BD-Curs 9

Enzime (partea I)

Procesele biologice sunt acompaniate de reacţii chimice. Aceste reacţii sunt

accelerate de enzime, catalizatori capabili sa mărească viteza de reacţiilor biochimice din
formele esenţiale de viaţă de la virusuri la oameni.
Primele referiri asupra enzimelor au apărut încă din cărţile vechi care s-au axat pe
descrierea modului de preparare a unor alimente (pâine, brânzeturi), băuturi nealcolice
sau frăgezirea cărnii. Este unanim acceptat faptul că sinteza proteinelor (prin intermediul
proceselor de transcripţie si translaţie) necesită enzime. Acest aspect este considerat
paradoxul biologiei moleculare din care derivă numeroase întrebări referitoare la originea
vieţii. În zilele noastre enzimele sunt utilizate atât în industria alimentară cât şi cea a
detergenţilor. Mai mult, numeroase boli sunt asociate cu reducerea sau creşterea
activităţii uneia sau mai multor enzime. Este cunoscut faptul că numeroase medicamente
sunt de fapt inhibitori ai enzimelor. “Reactoarele” enzimatice, în care enzimele sunt
ataşate covalent pe suporturi solide pot fi utilizate pentru unele sinteze care au loc fară
reacţii secundare. Terapia enzimatică este o practică în care se utilizează cantităţi
apreciabile de enzime pentru a suplimenta lupta iîmpotriva numeroaselor maladii (cancer,
alergii, boli degenerative, boli digestive, insuficienţe la nivelul pancreastului, disfuncţii
ale sistemului imunitar sau în durerile cronice acute).

Enzimele în antichitate
În antichitate aplicaţiile în care se foloseau enzime s-au bazau pe observaţiile
empirice din folclor. Cea mai veche consemnare referitoare la utilizarea enzimelor este
ilustrată de o descriere a procedeului de fabricare a vinului în vechiul Babilon (cca 2100
îC). Microorganismele (surse enzimatice) au fost folosite în diverse procese de
fermentaţie. Un exemplu este procedeul de obţinere a oţetului (utilizat drept conservant
sau în scopuri medicinale) prin conversia enzimatică a alcoolului etilic la acid acetic. De
asemenea una dintre sursele de bază în nutriţia popoarelor antice a constituit-o produsele
lactate. De exemplu, branza era preparată de circa 7000 de ani îC prin închegarea laptelui
sub acţiunea unor enzime. Aceştia utilizau ficina (obţinută dintr-un extract de smochin) şi
renina (obţinută sub forma unui precursor din stomacul bovinelor, oilor sau caprelor
tinere). Cele două procedee au fost descrise de Homer (în Iliada) şi Aristotel. Procedeul
de creştere a aluatului (în cazul producerii pâinii) este de fapt datorat producerii
dioxidului de carbon pe cale enzimatică. Un procedeu de frăgezire a cărnii era folosit de
locuitorii din insulele Pacificului. Aceştia utilizau sucul de papaia (care conţine o
protează, o enzima numită papaina). Exploratorii din armata navală britanică foloseau
sucul de papaia atât pentru frăgezirea cărnii cât şi pentru tratamentul împotriva viermilor.

Începutul enzimologiei
Primele ipoteze îndrăzneţe asupra naturii proceselor fermentative au fost emise de
elveţianul Theophanus Bombastus von Hohenheim (denumit Paracelsus) încă din secolul
XV. Paracelsus a lăsat detalii experimentale despre modul în care viaţa umana poate lua
naştere în laborator pe baza fermentaţiei unei mostre de lichid seminal. Pe baza
observaţiilor asupra fermentaţiei, Van Helmut recunoaşte acţiunile similare ale
fermetaţiilor din corpul vieţuitoarelor cu cele care produc fermentaţia mustului. Francois
Dubois de la Boe (1614-1672) a privit fermentaţia ca un proces pur chimic. El arăta că
procesele fermentative din tubul digestiv sunt realizate cu ajutorul salivei, bilei sau
secreţiilor din pancreas şi sunt similare cu cele care au loc la obţinerea alcoolului sau
oţetului. Studiile analitice ale lui Lavoisier (1743-1794) asupra fermentaţiei alcoolice au
concis faptul că procesul chimic al fermentaţiei se supune legilor conservării masei. Abia
în secolul următor T. Schwann (1838) a indicat cu precizie faptul că fermentaţia este un
proces biochimic în care intervine drojdia asupra zaharurilor.
Digestia enzimatica a fost unul dintre cele mai studiate în secolele XVIII and XIX.
Cercetătorul francez Rene Antoine Ferchault de Reaumur (1752) a demonstrat pentru
prima dată că digestia este un proces chimic şi nu unul fizic. Acesta a folosit un cilindru
metalic în interiorul căruia era imobilizată o bucată de carne. Bucata a fost introdusă în
stomacul unui soim (sau prin simpla imersare în sucul gastric al acestuia) constatându-se
faptul că a suferit digestia într-o zi. Un procedeu asemănător a fost folosit de Spallanzani
(1729-1799) în cazul unor animale şi a omului demonstrând faptul că ingredientul activ
din sucul gastric poate distruge bucăţi de carne. Spallanzani a arătat că digestia este
dependentă de temperatură sau de cantitatea de suc gastric în care carnea a fost imersată.
La sfârşitul anilor 1830 chimistul german Gerhardus Johannes Mulder a efectuat
analiza elementală a unor proteine din plante şi animale. În mod neaşteptat, el a
descoperit ca aproape toate proteinele au aceeaşi formulă empirică. J. J. Berzelius,
profesorul său, a propus temenul de “proteină” pentru aceste substanţe izolate. Mulder a
mers mai departe şi a identificat unii aminoacizii fiind drept produşii de degradare ai
proteinelor. Acesta nu a putut determina structura primară a proteinelor şi implicit masa
lor dat fiind faptul că la acea dată nu se cunoştea nici un compus având o masă
moleculară apreciabilă. Treptat s-a impus introducerea unei terminologii adecvate pentru
enzime. În 1883, Emil Duclaux, elevul lui Pasteur a propus câteva principii în ceea ce
priveşte nomenclatura enzimelor, unul dintre acestea constând în denumirea acestor
proteine în funcţie de substratul acestora la care se adauga sufixul –aza. În 1836, biologul
german Theodor Schwann descoperă enzima numită pepsina, prima enzimă animală
cunoscută, pe care o comentează în lucrarea Űber das Wesen des Verdaungsprozesses
(Despre esenţa digestiei). 20 de ani mai tarziu în lucrarea “Cercetări asupra fermentaţiei”
Louis Pasteur relatează faptul că fermentaţia este cauzată de microorganisme (fermenţi)
şi nu de reacţiile chimice aşa cum se crezuse până atunci. Ulterior, fiziologul rus, I. P.
Pavlov (1849-1936) fundamentează biochimia digestiei, evidenţiind însemnătatea
fermenţilor din secreţia gastrică si intestinală.
În 1862 biochimistul Ernst Felix Hoppe-Seyler prepară o formă cristalină de
hemoglobină. Un an mai tarziu Pasteur descoperă microorganismul (Acetobacter) care
este implicat în procesul de acrirea vinului. În 1871 Ernst Felix Hoppe-Seyler descoperă
invertaza, o enzimă care catalizează conversia zaharozei în glucoză şi fructoză. Acelaşi
cercetător dezvoltă 4 ani mai tarziu o metodă de clasificare a proteinelor. Fiziologul
Willhem Friedrich Kuhne descoperă tripsina (1876), enzimă din sucul pancreatic şi
inventeaza termenul de “enzimă” (cuvânt din greacă) pentru a defini acei compuşi care
lucrează la fel de bine atât în exteriorul celulei cât şi în interiorul ei. Botanistul Wilhelm
Pfeffer începe o lucrare de pionierat: utilizarea membranelor semipermeabile pentru
măsurarea greutăţii moleculare a proteinelor. E. Hansen a introdus (în 1888) noi metode
de obţinere a fermentilor care au fost adoptate de fabricanţii de bere. Datorită dezvoltării
tehnicilor de separarea a enzimelor şi descoperirilor înregistrate in domeniul
stereochimiei, in anul 1894 E. Fischer a formulat ipoteza specificităţii enzimelor potrivit
căreia o enzima actionează asupra unei singure substanţe (substrat) sau a unui grup de
compuşi cu structură chimică asemănătoare.
Taka-diastaza (-amilaza), o enzimă digestivă descoperită de J. Takamine (1894),
a fost produsă comercial utilizând o cultura de Aspergellus oryzae (mucegai) pe tărâţe de
grâu şi a fost utilizată la clivarea amidonului.
Prima peroxidază a fost izolată din hrean, iar prima amilază a fost extrasă din
boabele de cereale. Cercetătorii au încercat să extragă aceste ingrediente în formă pură. În
1897, Bertrand a izolat o enzimă (cupru oxidaza) din seva copacilor. Acesta este primul
exemplu de stabilizare a enzimelor cu ajutorul substratului. Biochimia s-a dezvoltat pe
baza unui conflict între doi cercetatori (Liebig şi Pasteur) asupra naturii procesului de
fermentaţie. Acest aspect a fost clarificat de fraţii Buchner care au utilizat un extract de
drojdie uscată (1897) pentru a demonstra faptul că fermentaţia alcoolică poate fi facută şi
în absenţa celulelor de drojdie vii. După un şir de investigaţii s-a putut demonstra faptul
că clivarea glucozei a fost datorată prezenţei în extractul de drojdie a unui număr
semnificativ de catalizatori (numite zimaze) care acţionează în diferite etape ale lanţului
catalitic.
Prima coenzimă, NAD+, a fost descoperită de Harden şi Zoundin în 1906. Aceştia
au observat faptul că prin adăugarea unor extracte de drojdie după fierbere şi filtrare la un
extract netratat fermetaţia alcoolică este accelerată. Structura acestui cofactor a fost
elucidată mai târziu (1930) de Hans von Euler-Chelpin. O altă coenzimă, ATP-ul, a fost
izolată din ţesutul muscular în aceeaşi perioadă (1929) de K. Lohmann. Coenzima A a
fost descoperită mai târziu în 1945, de către F. A. Lipmann.
Separarea L-leucinei dintr-un amestec racemic a fost realizată de către Warburg
(1906) prin hidroliza propil esterului leucinei cu ajutorul extractelor din ficat. Doi ani mai
tărziu Röhm a utilizat în industria pielii enzime pancreatice pentru tăbăcire. Acelaşi
cercetator a folosit mai tarziu (1913-1915) enzime din pancreas un produs (Burnus)
pentru îndepărtarea murdăriei de pe haine (prin imersarea acestora timp de câteva ore
înaintea procesului de spălare) cauzată în special de proteinele din pete (de exemplu
sânge). Prin utilizarea acestei enzime în etapa de prespălare se folosea o cantitate mai
mică de săpun, determinând astfel o scădere a gradului de distrugere a fibrelor şi o
protecţie a persoanei care era implicată în procesul de spălare.
Nelson şi Griffin (1916) au imobilizat invertaza pe un suport (cărbune)
demonstrând faptul că enzima işi păstrează activitatea catalitică.
Natura chimică a enzimelor a constituit o dispută de-a lungul timpului. David
Keilin (1925) a descoperit citocromul, o enzimă importantă în respiraţia celulară. Cinci
ani mai târziu este cristalizată a doua enzimă-pepsina. La scurt timp (1931) germanul
Otto H. Warburg a fost recompensat premiul Nobel pentru fiziologie şi medicină pentru
descoperirea enzimelor respiratorii. A. H. T. Theorell reuşeşte să izoleze cristale de
mioglobină. Willstätter, care lucra cu o peroxidază care avea o activitate catalitică
ridicată, credea că preparatele sale sunt lipsite de proteine. În contrast, ureaza (cristalizată
de către Sumner) a avut o activitate catalitică redusă care a fost considerată de unii
sceptici fiind de fapt un contaminant al proteinei (enzimei).
 Dezvoltarea enzimologiei mecanistice
Cinetica enzimatică se ocupă cu studiul acţiunii enzimelor.
Conceptul de complex enzima-substrat a fost introdus de E. Fisher care a propus
modelul lacăt-cheie pentru a descrie modul în care componentele complexului trebuie să
fie într-o anumită relaţie stereochimică. Mai târziu, Brown (1902) a demonstrat că acest
complex este de fapt un intermediar al reacţiilor catalizate de enzime. Un an mai târziu V.
Henri a descris primul model matematic aplicat la cinetica enzimatică. Acest model a fost
îmbunătăţit de Michaelis şi asistenta sa Menten (1913) şi este folosit şi în literatura de
specialitate actuală pentru a descrie masura în care enzimele catalizează reacţiile chimice.
O contribuţie semnificativă a avut şi L. Pauling (1948) care a sugerat faptul că starea de
tranziţie a reacţiei chimice este stabilizată de interacţiunile diverselor molecule cu situsul
catalitic al enzimei. Din 1960 cultivarea unei bacterii frecvent întâlnită în sol, Bacillus
licheniformis, s-a putut obţine o protează care poate fi utilizată în industria detergenţilor
cu scopul de a îndepărta murdaria cauzată de proteinele aflate pe haine, la temperaturi
reduse. În 1965 Monod, Wyman şi Changeux au arătat că pot avea loc interacţii indirecte
(alosterice) între diferitele situsuri catalitice care aparţin aceleaşi enzime.
În 1971 D. Nathans şi H. Smith au obţinut diferite enzime de restricţie (7 ani mai
târziu aceştia vor fi răsplătiţi cu premiul Nobel pentru fiziologie şi medicină), fapt care a
permis deschiderea de noi orizonturi în domeniul biologiei moleculare (modificarea
ADN-ului, etc). Doi ani mai târziu S. H. Cohen şi H. W. Boyer demonstrează faptul că
moleculele de ADN pot fi scindate cu ajutorul enzimelor de restricţie, iar apoi pot fi
asociate cu alte tipuri de enzime (liaze) şi pot fi copiate prin inserarea lor în E. coli. Acest
studiu este de fapt piatra de temelie a ingineriei genetice. În 1976, M. F. Gelert descoperă
enzima numită giraza, enzima care contribuie la împachetarea ADN-ului sub forma unor
superspirale.

Studiul structurii enzimelor

Metodele spectrale, cristalografia de raze X şi RMN-ul multidimensional s-au
dovedit a fi foarte folositoare în descrierea aspectelor structurale pe baza cărora
guvernează cataliza enzimatică. Prima enzimă care a fost cristalizată şi studiată de J.
Sumner cu ajutorul difracţiei de raze X a fost ureaza din fasole (1926). Mai târziu (1930-
1936), J. H. Northrop şi M. Kunitz au cristalizat pepsina, tripsina şi chimiotripsina facând
astfel un pas important pentru înţelegerea naturii chimice a enzimelor. John Desmond
Bernal face prima fotografie de difracţie cu raze X (1934) a unui cristal proteic (pepsina).
Descrierea completă a structurii tridimensionale a primei proteine a fost facută în 1957 de
către Kendrew pentru mioglobină. Cinci ani mai târziu acest cercetător şi M. F. Perutz au
câştigat premiul Nobel pentru chimie pentru studiul hemoproteinelor cu ajutorul razelor
X. În prezent detaliile structurale obţinute prin cristalografia de raze X şi RMN-ul
multidimensional sunt frecvent utilizate pentru elucidarea unor mecanisme de cataliză
enzimatică şi pentru găsirea unor liganzi noi care se leagă de situsul activ al enzimei.
Aceaste informaţii permit descoperirea unor noi medicamente ce pot fi folosite pentru
tratarea unor boli datorate unor enzime/proteine care intră în componenţa anumitor
virusuri sau sunt prezente în organismului uman.
 Structura tridimensionala a enzimelor este dictată de structura primară a lanţului
polipeptidic. Pentru a deduce structura primară a proteinelor este necesară hidroliza
acesteia de la capatul N-terminal (degradare Edman). Insulina a fost prima proteină a
cărei structură primară a fost elucidată (Sanger, 1953). Zece ani mai târziu a fost desluşită
prima secvenţă de aminoacizi a unei enzime (ribonucleaza). Structura lizozimei a fost
elucidata în 1965.
Aplicaţiile enzimelor
Enzimele sunt utilizate în zilele noastre la diverse aplicaţii ca: sinteza chimică,
industria detergenţilor, şi truse de curăţare a lentilelor de contact. Oricum, unul dintre
cele mai importante aspecte ale enzimologiei moderne constă în utilizarea inhibitorilor
enzimelor în industria farmaceutică, drept medicamente pentru medicina umană şi
veterinară. Multe din aceste medicamente acţionează asupra unor enzime care sunt
asociate cu diferite boli. Aspirina, una dintre cele mai folosite medicamente pe plan
mondial, este un antiinflamator care inhibă activitatea enzimatică a prostaglandin
sintazelor.
Enzimele sunt parte integrantă a patolgiei umane. Designul unor inhibitori a permis
combaterea activităţii unor enzime (Tabelul 1). Aceşti inhibitori pot fi folosiţi drept
agenţi terapeutici.

Tabel 1. Exemple de inhibitori folosiţi drept medicamente

Inhibitor/ Boala/ Enzima
Medicament contextul Inhibată
Acyclovir herpes ADN polimeraza
Ciclosporina transplant Ciclofilina/
de organe Calcineurina
DuP450 SIDA proteaze HIV
Fluorouracil cancer Timidilat sintaza
Phenelzine depresie Monoamin-oxidaza (creier)
Zileuton alergie 5-Lipoxigenaza

Proprietăţile remarcabile ale enzimelor

Enzimele sunt cei mai performanţi, precişi, stereospecifici catalizatori din toate
grupele de catalizatori. Enzimele (“en”-in, “zima”-drojdie) sunt proteine care au
capacitatea de a interacţiona cu o substanţă chimică numită substrat şi proprietatea de a
mări viteza de transformare a acestuia în produşi de reacţie, după care acestea se refac şi
pot fi utilizate într-un nou ciclu catalitic. S-a estimat faptul că există circa 25000 de
enzime. Până în prezent s-au caracterizat aproximativ 3000 de enzime din care 300 s-au
obţinut în stare cristalină.
Enzimele au câteva proprietăţi remarcabile în comparaţie cu alte tipuri de
catalizatori. Dintre acestea trei proprietăţi importante sunt: marea lor putere catalitică,
specificitatea şi gradul în care activitatea lor catalitică poate fi controlată de o serie de
compuşi naturali.
 Puterea catalitică
Enzimele pot creşte viteza de reacţie cu până la 17 ordine de magnitudine. În cele
mai multe cazuri o comparaţie între viteza unei reacţii catalizate enzimatic şi necatalizată
este greu de realizat. Pentru ultima reacţie (în absenţa catalizatorului, enzimei) vitezele
pot fi foarte mici şi ca atare greu de cuantificat. Când această comparaţie este posibilă
creşterile vitezei de reacţie pot fi mai mari de 4 (creatin kinaza), 8 (alcool
dehidrogenaza), 9 (triozfosfat izomeraza), 10 (hexokinaza), 11 (fosforilaza) ordine de
magnitudine. În unele situaţii activitatea enzimatică poate fi masurată la temperatura mai
mică (datorită stabilităţii reduse a enzimei) comparativ cu reacţia necatalizată.
Un exemplu îl constituie ureaza, prima enzimă (din fasole Canavalia ensiformis) care a
fost cristalizată în stare pură. Existenţa enzimei a fost raportată încă din secolul XIX.
Experimentele iniţiale au fost efectuate de către chimistul suedez Jon Jakob Berzelius,
cercetătorul care a introdus termenul de activitate catalitică. Sumner a reuşit să izoleze
enzima şi să o cristalizeze (a fost recompensat cu premiul Nobel in 1947).
Ureea este o molecula foarte stabilă, care în mod normal hidrolizează foarte încet
obţinându-se acidul izocianic şi amoniac. Durata reacţiei necatalizate este de 3,6 ani la 38
C. Activitatea catalitică a enzimei determină o creştere a vitezei de reacţie (în mediu
acid) de aproape 14 ordine de magnitudine. În timp ce reacţia necatalizată implică o
eliminare directă a moleculei de amoniac, enzima probabil catalizează o reacţie
hidrolitică a ionului carbamat (intermediar).