LP 23.

Diagnosticul infecției determinate de Clostridioides difficile

(fost Clostridium difficile).
Diagnosticul infecției determinate de Helicobacter pylori.

OBIECTIVE:
1. Însuşirea etapelor diagnosticului bacteriologic în infecția determinată de C. difficile.
2. Însuşirea etapelor diagnosticului bacteriologic în infecția determinată de H. pylori.

1. Diagnosticul infecției determinate de Clostridioides difficile (fostul Clostridium

difficile (ICD).
C. difficile
- prezent în microbiota intestinală (1-4% adult, 30-40% copii < 1 an)
- produce – toxina A (enterotoxină) – alterează permeabilitatea epiteliului intestinal
- toxina B (citotoxină) – lezează mucoasa colică
- prezintă rezistență naturală la numeroase antibiotice.
C. difficile (tulpini toxigene) determină colita pseudomembranoasă post antibiotico-terapie
(cefalosporine, fluorochinolone, clindamicină, amoxicilina&acid clavulanic).
Indicații de testare:
 toți pacienții la care diareea apare după 48 de ore de la internare
 diaree sau alte tablouri clinice sugestive la pacienți care au avut spitalizări recente sau
tratament la domiciliu cu antibiotice (cefalosporine, fluorochinolone, clindamicină,
amoxicilina&acid clavulanic), antisecretorii gastrice, imunosupresoare.
a. Prelevare - 1-2 ml de scaun diareic, din cel putin 3 zone distincte ale prelevatului
- dacă detecția toxinelor nu se poate efectua în primele 2 ore după recoltare, proba se poate
păstra timp de cel mult 2 zile la 4C (la temperatura camerei toxina se degradează după 2
ore); păstrarea probei pe o durată mai mare de timp este posibilă doar la -20.
b. Teste screening – DOAR la pacienții cu manifestări clinice evocatorii de ICD
1. Cultivare - metodă cu sensibilitate crescută, dar lenta
- bacterie nepretențioasă nutritiv; proba prelucrată se însămânțează pe medii de cultură
(selective și neselective)
- strict anaerob
- incubare 48-72 ore, 37°C
- identificarea coloniilor suspecte – ex. microscopic (bacili gram pozitivi, sporulați, spor
oval, deformant, central/subterminal) și test de aglutinare C. difficile

1
 2. Detectarea enzimei GDH (glutamat dehidrogenaza) prin metode imunoenzimatice -
metoda are sensibilitate ridicată, însă specificitate redusă (nu face diferența între tulpinile
toxigene și netoxigene).

c. Teste de confirmare:
1. Detectarea toxinelor A și B prin metode imunoenzimatice:
- direct din materii fecale sau din supernatantul culturilor în bulion.
- Metodele tip ELISA, ELFA și imunocromatografice au performanțe similare, mai reduse decât
ale testelor de citotoxicitate, variind între 25-89%.
- Se recomandă folosirea testelor care urmăresc concomitent prezența toxinelor A și B.
2. Detectarea genelor care codifică toxinele C. difficile prin metode moleculare:
- este în prezent tehnica optimă pentru stabilirea diagnosticului etiologic.
- se recomandă folosirea truselor comerciale de real-time PCR pentru detectarea genelor ce
codifică toxinele de C. difficile (A, B sau toxină binară).
- sensibilitatea și specificitatea metodelor moleculare este ridicată și oferă un diagnostic
rapid.
- Limite: necesită infrastructura adecvată.
3. Teste de citotoxicitate pe culturi celulare
- au sensibilitatea cea mai ridicată și sunt considerate ”gold standard”.
- Limite: durata detectării din proba de scaun este de aproximativ 2 zile, necesită echipament de
laborator adecvat pentru culturi celulare și personal instruit în acest domeniu.

Algoritm de diagnostic etiologic

Se recomandă un diagnostic în 1-3 etape, aplicabil doar în laboratoarele care au posibilitatea
efectuării atât a testelor de detecție rapidă cât și a cultivării :
a. Efectuarea unui test de detecție a prezenței toxinelor/genelor care le codifică:
 rezultatul pozitiv confirma diagnosticul de ICD;
 daca rezultatul este negativ se trece la a doua etapă.
b. Cultivarea probei de scaun pentru izolarea de anaerobi:
 absența culturilor face improbabil diagnosticul de ICD;
 în cazul izolării de colonii identificate drept C. difficile se trece la a treia etapă.
c. Efectuarea unui test de detecție a toxinelor/genelor care le codifică din cultura bacteriană :
 dacă este pozitiv se confirmă ICD
 dacă este negativ este foarte probabilă colonizarea cu C. difficile iar boala actuală are o
altă etiologie.
2
Justificarea algoritmului:
 testele imunoenzimatice/PCR au specificitate foarte bună și identifică tulpinile toxigene –
diagnostic confirmat
 în special testele imunoenzimatice, dar și PCR pot furniza rezultate fals negative, de aceea se
trece la cultivare pentru a crește șansa identificării unei tulpini toxigene de C. difficile.
Pentru pacienții cu teste negative sau la care s-au izolat tulpini netoxigene decizia de tratament
adecvat a ICD este la latitudinea medicului curant.

2. Diagnosticul infecției determinate de Helicobacter pylori.

A) Diagnostic direct
Prelevare I) fragment biopsie gastrică (metodă invazivă)
II) materii fecale
I) fragment biopsie gastrică
a) Ex. microscopic - bacili gram negativi spiralați sau încurbați, nesporulați
b) Izolare – pretențios nutritiv – medii îmbogățite (suplimentate cu sânge, hemină și cărbune)
și selective (antibiotice)
- microaerofil
- cultivă lent (3-6 zile), la 30°- 37°C
- catalază pozitiv, oxidază pozitiv, urează pozitiv
c) Testul ureazei – fragment de biopsie + soluție uree și indicator de pH => reacție pozitivă =
culoare roșie
d) Teste de biologie moleculară
Infecția poate evolua atât la pacienții cu cancer gastric cât și la cei fără această neoplazie =>
este indicată biopsia gastrică deoarece evidențiază și transformarea malignă a celulelor.
II) materii fecale – detecție antigenică în materii fecale (ELISA sau imuncromatografie).

Metode neinvazive
A. Testul respirator cu uree marcată – metodă neinvazivă care depistează dioxidul de
carbon marcat radioactiv eliminat în aerul expirat după ce se administrează uree marcată
cu izotop 13C sau 14C. Util mai ales pentru demonstrarea eradicării infecției (la o lună
post-terapie).

B. Diagnostic indirect – diagnostic serologic (ELISA, IF, WB)

- anticorpii persistă mulți ani
- titrul anticorpilor nu se corelează cu gravitatea infecției sau cu răspunsul la terapie
- util în studii epidemiologice și în evaluarea inițială a unui pacient simptomatic

3
 WB- Ac anti-cagA (pentru identificare)

WB- utilizata pentru a detecta prezenta anticorpilor specifici H. pylori

-antigene diferite fixate pe benzi de nitroceluloza prin migrare in camp electroforetic, la distante
diferite in functie de greutatea moleculara
Interpretare :
Pozitiv : colorarea benzii corespunzatoare antigenului de 120 kDa CagA (citotoxina) si a cel
putin doua benzi corespunzatoare antigenelor cu greutate moleculara de 95 kDa VacA (toxina
vacuolizanta), 33 kDa, 29 kDa UreA, 26 kDa, 19 kDa si 17 kDa.
Negativ : absenta colorarii benzilor
Indicatii : gastrita, ulcer gastric, ulcer duodenal.
Prezenta benzilor VacA si/ sau CagA- frecventa mai mare la pacienti cu ulcer duodenal, gastrita
atrofica si carcinom gastric.

Bibliografie: Buiuc D. Microbiologie Medicală, ed. a VI-a, Editura “Gr. T. Popa” Iaşi, 2003,
cap. 12, pag. 203-205; cap. 17, pag. 243-244.