Braicu Cornelia

• S-a nascut din motive pragmatice si a coexistat cu stiintele

medicale si a adus cunostiintele preclinice in practica clinica
• Presupune planificarea si organizarea cercetarii fundamentale si
preclinice pentru aplicarea rezultatelor in viata reala
Trochim et al.: Clin Transl Sci. 2011 June ;
4(3): 153–162
Trochim et al. Clin Transl Sci. 2011 June ; 4(3):
153–162
Nature Medicine Blumberg et al: 18, Pages: 35–41 : (2012)
Cercetarea biomedicala sau medicina experimentala aplica
principiile stiintelor naturale in practica medicala
Disciplinele biomedicale:
• biologia celulara si moleculara (genomica, transcriptomica,
proteomica, metabolomica, fiziomica)
• biochimia
• biotehnologia
• embriologia
• ingineria tisulara etc.
Biomedicina presupune studiul proceselor fiziologice sau
patologice cu ajutorul biologiei, chimiei si fizicii
(interdisciplinaritate)
 Cercetarea preclinica in oncologie
 Diagnostic oncologic: morfopatologie, laborator clinic
 Metode in vitro (tehnici de cercetare in afara
organismelor)
- metode biochimice
- biologia celulara (culturile de celule)
- genomica
- transcriptomica etc
 Metode in vivo ( studii pe animale)
 Metode in silico (modele simulate pe computer)
termen introdus de Pedro Miramontes in 1989 (“DNA
and RNA Physicochemical Constraints, Cellular Automata and
Molecular Evolution” – a dezvoltat experimente biologice
simulate in intregime pe computer)
 Culturile de celule

Avantaje
 Reprezinta o alternativa la modelul
animal dar si un punct de pornire a
unei cercetari experimentale
 Un micromediu partial controlat (de
semnalat efortul de standardizare)
pH, temperatura, presiune osmotica,
presiune O2 si CO2
 Controlul nutrientilor, hormonilor,
factorilor de crestere
 Posibilitatea de caracterizare
 Stocare pe termen lung
 Cuantificare
Limite
 Necesara expertiza in manipulare
sterila
 Contaminare microbiana
 Contaminare chimica
 Instabilitate fenotipica si genetica
 Contaminare intre linii celulare
 Dificultati de identificare a tipurilor
celulare (markeri, histologic, influenta
micromediului)
 Numar de celule limitat
 Dotari speciale
 Costuri destul de ridicate
Diferentele intre experimentele in vitro si in vivo

 Trecerea de la geometria 3D (in vivo) la cultura in conditii 2D

(disparitia unor interactiuni heterotipice celulare specifice)

 Cresterea proliferarii celulare in vitro

 Lipsa reglarii homeostatice, hormonale, a stimulilor nervosi (cu

modificarea metabolismului celular)

 Lipsa interactiunii cu sistemul imun

 Metabolismul energetic preponderent glicolitic (cu scaderea

rolului ciclului acidului citric)
 Harrison 1907 Dulbecco 1952 Ham, Mckeehan 1978
medii selective,
Carrel 1912 Gey 1952 interactiuni
Morgan, Parker, matriceale
Eagle
Freshney
 INTRACELLULAR CELL PRODUCTS:
ACTIVITY: Proteomics, secretion, IMMUNOLOGY: Cell
DNA transcription, biotechnology surface epitopes,
protein synthesis, hybridomas, cytokines and
energy metabolism, signaling,
drug metabolism, inflammation
cell cycle,
differentiation,
GENOMICS: Genetic analysis,
apoptosis
transfection, infection,
transformation, immortalization,
INTRACELLULAR
senescence
FLUX: RNA processing,
hormone receptors,
TISSUE ENGINEERING: Tissue
metabolite flux, calcium
constructs, matrices and
mobilization, signal
scaffolds, stem cell sources,
transduction, membrane
propagation, differentiation
trafficking

TOXICOLOGY:
PHARMACOLOGY: Drug CELL-CELL INTERACTION: Infection,
action, ligand receptor Morphogenesis, paracrine control, cytotoxicity,
interactions, drug cell proliferation kinetics, metabolic mutagenesis,
metabolism, cooperation, cell adhesion and carcinogenesis, irritation,
drug resistance motility, matrix interaction, inflammation
invasion, angiogenesis
Freshney
 TESTE DE PREDICŢIE A RĂSPUNSULUI
TUMORAL LA CHIMIOTERAPIE
 In ultimii 50 de ani -tehnici de laborator de testare a
chimiosensibilităţii/chimiorezis-tenţei la citostatice in vitroAr fi
echivalentul în oncologie a antibiogramei la agenţii
antiinfecţiosi (oncobiograma).
 Ipoteza centrală a acestei abordări este că fiecare pacient
are un profil individual de raspuns la terapie, legat de
diversitatea genetică individuală a fiecarei tumori, chiar
dacă fenotipic aceste tumori par identice, punându-se astfel
pentru prima oară problema terapiei individualizate/
personalizate.
 Testul MTT : Black şi Speer în 1953 au testat activitatea unui
antimetabolit, aminopterin. Acest test se bazeaza pe
evidenţierea viabilităţii celulare prin determinarea activităţii
metabolice a mitocondriilorde a converti o sare de
tetrazolium (methylthiazol diphenyl tetrazolium bromide-MTT)
şi masurată apoi prin spectrofotometrie.

(Black,M.M., Speer,F.D:” Effects of cancer chemotherapeutic agents on

dehydrogenase activity of human cancer tissue in vitro” Am. J.
Clin.Pathol.1953;23:218-227)
 1.5 0.4
**
1.5

*** 0.3 **
1.0 ***
1.0
*** *** ***
0.2
*** ***
0.5
*** 0.5
0.1

0.0 0.0 0.0

T
RL

+T

T2
L

M
+T

+T
M

T
TR

TR
M

M
CT
C

C
GM1 GM2 GBL 12
0.25
0.25 0.20
* 0.20
0.20 0.15 **
0.15
0.15
0.10 0.10
0.10
0.05 0.05
0.05
0.00
0.00 0.00

T
L

+T
M
TR
L

+T
M

+T
M
L

T
M
TR

TR
M

M
C

C
GBL 5 GBL 7 GBL 8

0.25 0.4
0.4
0.20
*
0.3 *
0.3 *** ***
0.15 ***
0.2 0.2
0.10
0.1 0.1
0.05

0.00 0.0 0.0

+T
M

T2
L

T
L

+T
M
L

+T
M

T
TR

TR
TR
M

M
M
C

C
GBL 15 GBL 16
GBL 17
 TESTE DE PREDICTIE A RASPUNSULUI TUMORAL LA
CHIMIOTERAPIE
 teste de citotoxicitate care determina integritatea structurala,
proliferarea si functia metabolica a celulelor dupa expunere la
tratament. Din acesta categorie fac parte metoda de excluzie cu tripan
blue, eliberarea de 51Cr , incorporarea de 3H-thimidina , testul MTT
 teste de supravietuire care masoara proliferarea celulelor lasate pe o
perioada mai lunga de timp dupa terapie ( tstul de clonogenitate)

Schema testului de clonogenitate elaborat in anii ’70 de Salmon şi Hamburger

J P Fruehauf:” In vitro assay-assisted treatment selection for women with breast or ovarian
cancer” Endocrine-Related Cancer (2002) 9 171–182)
 Compartie intre testele cele mai utilizate in predictia
raspunsului tumorilor la citostaice
( dupa J P Fruehauf:” In vitro assay-assisted treatment selection for women with
breast or ovarian cancer” Endocrine-Related Cancer (2002) 9 171–182)

TIPUL DE TEST CONDITII DE CULTURA PRODUS FINAL GRADUL DE SPECIFICITATE

ANALIZAT PREDICTIE
ATP Placi de microtitrare Continut de ATP chimiosensibilitate moderata

FCPA Fragmente micronice Formarea chimiosensibilitate Scazuta

in matrice celulara esterazelor de
fluoresceina

MTT Placi de microtitrare Formarea de chimiosensibilitate scazuta

formazan
DiSC Placi cu citofobicitate Celule neviabile ambele inalta
anlizate in
microscopie
optica
HTCA Placi de agar Formarea chimiosensibilitate inalta
coloniilor celulare
3H-uridina Matrice extracelulara Incorporarea de chimiorezistenta Moderata
3H-uridina

EDR Suspensie celulara in Incorporarea de chimiorezistenta inalta

agaroza 3H-uridina
Tipuri de moarte celulara indusa de
medicamente antineoplazice

Terapia antineoplazica
poate activa multiple
căi ce induc moartea
celulara, care adesea
interferează şi
cooperează, acest
concept stând la baza
unor combinaţii optime
a medicamentelor anti-
cancer

( MS, Zong WX.:” Chemotherapeutic approaches for targeting cell

death pathways.”Oncologist 2006 (4:342-57)
Teste de apoptoza (coloratie V-anexin FITC)
1.0

0.8

0.6 ***

OD
0.4

0.2

0.0

SC

Z
sp

sp
M
-A

A
C

-T

-
Ps

Ps
SC
N

N
C
-G

G
Z-
SC

M
C

-T
SC
C
Invazia si metastazarea
 Teste ale invaziei si metastazarii
 Dozarea metaloproteazelor din supernatante
si lizate celulare (MMP2 si MMP9)

 Teste de migrare (camera Boyden, test de

scarificare)

 Testul de invazie in Matrigel, colagen

 Teste de neoangiogeneza

 Teste de agregare (formarea de tumorisfere)

 Gene implicate in invazie si metastazare

• Celule stem marcate cu un
marker vital de fluorescenta PKH26
Fluorescent Cell Linker Kit fara a
afecta viabilitatea celulara, si a
carui fluorescenta se poate
mentine pana la 100 de zile
• Testul de migrare a fost efectuat
cu placi BD Fluoroblock 24 well
microplate, 8μm, ce permite
trecerea celulelor din camera
superioara membranei in godeul
subjacent.
• imagine preluata la 20 de ore
•Masurarea fluorescentei cu
microplate reader
Down-regulation of CDH3
in HuCCT1 cells reduced
invasion in Matrigel
invasion assay

CDH3/P-Cadherin regulates migration of HuCCT1 cholangiocarcinoma

cells Baek S, Lee YW, Yoon S, Baek SY, Kim BS, Oh SO - Anat Cell Biol
(2010)
 Formarea de tumorisfere

A B C

A- Celule de carcinom ovarian MLS cultivate în mediu standard

B- Pe masură ce concentraţia de FCS a fost diminuată, celulele tumorale au

prezentat modificari morfologice cu apariţia unor celulele fusiforme cu pierderea
polarizării celulare si a contactelor intercelulare.

C- formarea primelor agregate de celule în suspensie, la 7 zile de cultivare în mediu

serum-free
Co-Cultures to Mimic the Tumor
Microenvironmet: fibroblasts,
endothelial cells, and other
components of the tumor in
Perfecta3D Hanging Drop Plates
Teste de neoangiogeneza

Gulec&Woltering model
Formarea tubilor capilari in gel de fibrina

Comparatie intre HUVEC si culturi primare de glioblastom

3D angiogenesis assay

Modelul organotipic de neoangiogeneza a fragmentelor tumorale de

glioblastom incluse in gel de fibrina