UNIVERSITATEA TEHNICĂ “GHEORGHE ASACHI” IAŞI

Facultatea Inginerie chimică şi protecţia mediului

Domeniul de licenţă: Inginerie Chimică
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaţiii practice 2012-2013, Ş.L. PUITEL A.C.

L3 Cromatografia în fază lichidă la înaltă presiune (high pressure liquid chromaorgraphy)

Cromatografie - tehnică folosită pentru separarea componenţilor unei probe, prin care aceşti
componenţi se distribuie între două faze, una staţionară şi una mobilă. Faza staţionară poate fi un solid
sau un lichid depus pe suport.

Rezervor
solvent
de eluţie
f ă

Sistem de
Sistem de injecţie detecţie

Colector de fracţiuni

Componenţii unui sistem HPLC

1. Rezervor sau rezervoare care conţin faza sau fazele mobile; fază mobilă - ansamblul format din
gazul purtător şi porţiunea din eşantionul introdus în coloană (GC); un lichid (solvent) folosit
pentru eluarea componenţilor probei prin coloană sau după coloană. Poate fi monocomponent
sau un amestec de solvenţi (HPLC); Faza mobilă trebuie să conţină reactivi chimici puri. Înainte
de utilizare, faza mobilă trebuie filtrată şi degazată, atunci când se impune prevenirea formării
bulelor de aer în sistem. Trebuie să se asigure filtrarea fazei mobile în circuitele sistemului
HPLC pentru îndepărtarea impurităţilor mecanice (particule, praf etc).
2. Pompă de înaltă presiune. Pompa trebuie să asigure o presiune în domeniul (0…40) MPa;
Pompa trebuie să asigure un debit cuprins între (0,1…5,0) ml/min; Pulsaţiile pompei trebuie să
nu depăşească ± 2 % vârf la vârf (ca presiune), când se monitorizează sistemul cu apă, la o
presiune de retur de 14 MPa, la un debit de 1 ml/min, pentru o durată de 10 minute. Între pompă
şi coloană, sistemul HPLC trebuie să dispună de un monitor de presiune şi de un releu limitator
de presiune.
3. Dispozitiv de injecţie - mijloc tehnic de introducere a probei în coloana cromatografică;
4. Coloană cromatografică - un tub care conţine faza staţionară prin care trece faza mobilă;
faza staţionară - solid depus sau nu pe un suport solid care produce separarea constituenţilor unei probe
datorită diferenţelor de solubilitate şi respectiv, de adsorbţie; material imobil activ existent în coloană,

1
UNIVERSITATEA TEHNICĂ “GHEORGHE ASACHI” IAŞI
Facultatea Inginerie chimică şi protecţia mediului
Domeniul de licenţă: Inginerie Chimică
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaţiii practice 2012-2013, Ş.L. PUITEL A.C.

depus pe suportul solid sau fiind însuşi suportul solid, care produce o întârziere în trecerea
componenţilor probei, ca urmare a proceselor specifice de separare cromatografică (HPLC). . Materialul
de construcţie trebuie să fie inert faţă de componenţii fazei mobile şi a probelor de analizat. În acest
sens materialele din care se realizează pot fi materiale metalice, din sticlă sau material plastic. Mai mult,
acestea trebuie şi să reziste la presiunea generată de pompă.
5. Detector - dispozitiv care permite conversia concentraţiilor componenţilor probei în semnal
electric proporţional; Caracteristicile detectorului includ:
− zgomot de fond - măsură a variaţiei semnalului de ieşire al unui detector în situaţia în care nu se
înregistrează prezenţa unui component al probei;
− limită de detecţie - concentraţia componentului de interes al probei care dă un semnal de ieşire al
detectorului, egal (de regulă) cu de trei ori zgomotul de fond;
− selectivitate - caracteristica unui detector de a reacţiona într-un grad înalt la anumite categorii de
compuşi faţă de altele;
− sensibilitatea unui detector - semnalul produs de unitatea masică a compuşilor într-un gaz
purtător, care se încadrează într-una din categoriile următoare.
pentru un detector dependent de concentraţie, ea se exprimă în A x ml x g-1 sau V x ml x g prin ecuaţia:
PxF
S= unde
M
S Sensibilitatea;
P Aria integrată a picului (A x s sau V x s);
F Debitul gazului purtător (ml/s);
M Masa eşantionului în faza mobilă purtătoar (g)

pentru un detector dependent de debitul masic, sensibilitatea se exprimă în A x s x g-1 sau V x s x g1

prin ecuaţia: S = P/M; unde simbolurile sunt aceleaşi ca la definiţia de mai sus;
− domeniu liniar al detectorului - domeniul concentraţiilor sau al debitelor masice pentru un
component de interes al probei, pentru care sensibilitatea detectorului rămâne constantă într-o
plajă de 5 %. Valoarea sa este dată de raportul dintre limita superioară a liniarităţii şi limita de
detecţie;
− domeniu dinamic al detectorului - domeniul concentraţiilor sau al debitelor masice ale unui
component al probei, pentru care o modificare a cantităţii de probă produce o modificare
măsurabilă a semnalului de ieşire al detectorului;
Detectori utilizaţi în HPLC:
Detector UV/vizibil - detector care măsoară absorbanţa luminii prin probă;
Detector cu fluorescenţă - detector care utilizează relaţia dintre emisia fluorescentă şi concentraţia
compuşilor probei care au fost excitaţi prin absorbţia luminii;
Detector electrochimic - detector care poate fi folosit pentru măsurarea componenţilor probei care se
pot oxida sau reduce electrochimic la electrozi;
Detector selectiv de masă (MS) - conform descrierii de la punctul.
6. Trebuie să se ia în considerare sistemele de prelucrare automată a datelor cu ajutorul cărora se
pot efectua analize complete, atât calitative, cât şi cantitative, respectiv de integrare sau
calculatoare care achiziţionează şi prelucrează automat datele sub formă digitală, livrând
rezultatele analizei.
7. Sistem automat de colectare a fracţiunilor – componenţilor unei probe. Uneori, mai ales în cazul
cromatografiei preparative este necesar ca o parte din componenţii probei să fie colectati în
vederea utilizări sau efectuării de analize suplimentare.

Terminologie utilizată în cromatografie

2
UNIVERSITATEA TEHNICĂ “GHEORGHE ASACHI” IAŞI
Facultatea Inginerie chimică şi protecţia mediului
Domeniul de licenţă: Inginerie Chimică
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaţiii practice 2012-2013, Ş.L. PUITEL A.C.

− eluţie - extragerea şi deplasarea constituenţilor unei probe din faza staţionară de către faza mobilă;
− cromatogramă - un grafic al răspunsului electric al detectorului funcţie de timp. Din cromatogramă
se obţin următorii parametri de reţinere: timpul de reţinere (tR), precum şi înălţimea (h) sau aria (A)
picurilor (vârfurilor cromatografice) componenţilor separaţi; pe baza acestor parametri se identifică
şi se determină cantitativ componenţii probei;
− analiză calitativă: identificarea unui compus prin cromatografie, cu ajutorul unor etaloane, pe baza
parametrilor de reţinere (tR);
− analiză cantitativă - calcularea concentraţiilor compuşilor chimici sau a compoziţiei probei din
datele picurilor componenţilor (arie, înălţime) şi ale componenţilor de referinţă;
− timp de reţinere sau de retenţie - intervalul de timp scurs de la injectarea probei până la înregistrarea
valorii maxime a picului componentului din probă;

− repetabilitate - limită de acceptabilitate pentru rezultatele măsurărilor succesive efectuate asupra

aceluiaşi măsurand, în aceleaşi condiţii de lucru, de către acelaşi operator şi în cursul unei perioade
relativ scurte de timp.
− Factor de capacitate
V − V0 t R − t0 t ' R
k' = R = =
V0 t0 t0
Unde
VR = volumul de retentie pentru un anume compus
V0 = volum de retentie faza mobilă, solvent sau pentru un compus inert faţă de coloană
t R = timp de retenţie a compusului R
t 0 = timp de retentie faza mobilă, solvent sau pentru un compus inert faţă de coloană
t`R = timp de retenţie efectiv
− Selectivitatea sau factorul de separare

Eficienţă de separare

3
UNIVERSITATEA TEHNICĂ “GHEORGHE ASACHI” IAŞI
Facultatea Inginerie chimică şi protecţia mediului
Domeniul de licenţă: Inginerie Chimică
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaţiii practice 2012-2013, Ş.L. PUITEL A.C.

Cromatografie în fază normală cromatografie în fază inversă

Cromatografie în fază normală se referă la faptul că faza stationară este una polară- adsorbant de
tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice (SiO2); principiul separarii: etape repetate de adsorbtie-
desorbtie fază mobilă este nepolară (hexan, heptan, THF, amestecuri de alcool izopropilic cu acetat de
etil şi o cantitate redusă de apă). Componenţii nepolari sunt evacuaţi rapid (eluţie rapidă); compuşii
polari au timpi de retenţie ridicaţi în consecinţă vor fi evacuaţi mai greu din sistem. Timpul de retenţie
creşte şi pe măsură ce în faza mobilă creşte cantitatea de solvent nepolar.
Absorption is the incorporation of a substance in one state into another of a different state (e.g., liquids being absorbed by a
solid or gases being absorbed by a liquid). Adsorption is the physical adherence or bonding of ions and molecules onto the
surface of another phase (e.g., reagents adsorbed to solid catalyst surface).
În cazul cromatografiei lichide la înaltă presiune în fază inversă (reversed phase HPLC), faza
staţionară este nepolară lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice. Interacţiunile dintre
componenţii unei probe de analizat şi faza staţionară sunt hidrofobe (nespecifice). Ordinea de eluţie este
inversă compuşii polari prezintă timpi de eluţie mici în timp ce compuşii nepolari prezintă timpi de
eluţie mari. În consecinţă cei din urmă sunt evacuaţi ultimii din coloană. Faza mobilă este în general
polară.

Normal-Phase HPLC : Reversed-Phase HPLC:

Compusul A(galben) este foarte polar; compusul B are o polaritate medie iar C este cel mai puţin polar.

4
UNIVERSITATEA TEHNICĂ “GHEORGHE ASACHI” IAŞI
Facultatea Inginerie chimică şi protecţia mediului
Domeniul de licenţă: Inginerie Chimică
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaţiii practice 2012-2013, Ş.L. PUITEL A.C.

Partea practică

Se realizeaza solutii de concetratie cunoscuta de ftalat de potasiu (0,1....0,5 g/L); guaiacol

(0,05...0,1 g/L) şi acid vanilic. Deasemenea se realizează şi un amestec dintre cele 2 solutii.
Pentru etalonarea calitativă (stabilirea timpilor de retentie a celor 3 compuşi) se injectează
separat cate 200 μL în sistemul cromatografic. Se înregistrează cromatogramele celor 3 compuşi şi se
stabilesc timpii de retenţie corespunzători.
Pentru etalonarea cantitativă a sistemului se procedează în felul următor: se realizează injecţii
succesive din soluţiile compuşilor de mai sus, soluţii de concentraţie diferită şi cunoscută. Pentru fiecare
tip de soluţie se calculează cu ajutorul softului Origin suprafetele corespunzătoare picurilor. Se trasează
dreapta de etalonare şi se stabileşte corelaţia Apic=f(C).
Pentru determinarea concentraţiilor dintr-un amestec se injectează în coloană 200 μL se
determină suprafaţa celor 3 picuri şi ulterior, prin interpolare concentraţia.

Momente de dipol ale unor compuşi organici