Prelegerea 4 MTAC

Cromatografia

1
 Definitia cromatografiei

Cromatografia este termenul general folosit pentru o

varietate de tehnici fizico-chimice de separare si
identificare a componentelor unui amestec complex.
Au in comun distributia diferita a substantelor intre
doua faze (faza stationara si faza mobila) avand ca
rezultat deplasarea cu viteze diferite a substantelor
de interes cu ajutorul fazei mobile in lungul fazei
stationare.

2
Evenimente in istoria cromatografiei

1906 Tsvet – descrie cum poate separa pigmentii din

frunzele verzi utilizand o coloana cu creta (carbonat de
calciu) ca absorbant si un amestec de eter de
petrol/etanol ca eluent (faza mobila).
1931 Lederer & Kuhn – Lichid Cromatografia carotenoidelor
1938 TLC si schimbul ionic
1950 faza inversa in LC
1954 Martin & Synge (Nobel Prize)
1959 permeatia Gel
1965 LC instrumentala (Waters)

3
 Scopul cromatografiei

Identificarea componentelor
dintr-un amestec complex analitic

Izolarea unui component din

amestec
Chimie preparativa
Demonstrarea nivelului de sau
puritate semi-cantitativa
– Cuantificare
» Standard intern
 Termenii

Faza mobila in cromatografie = faza de extractie care se

misca prin sistem; FM=gaz, lichid sau fluid supercritic

Faza stationara in cromatografie = faza de extractie care

ramane fixa; FS = solid, gel sau lichid

Prin cromatografie se poate realiza separarea unor

compusi cu acelasi coeficient de distributie, modificand
raportul de distributie al acestora in timp.

Cromatograma –reprezentarea inregistrarii semnalului

detectorului in functie de timpul retentie sau de volumul
de elutie 5
 Clasificarea metodelor
cromatografice
I - dupa tehnica de lucru folosita: II - dupa forma fazei stationare:
❖ cromatografia de elutie
❖ cromatografia pe coloana
❖ cromatografia frontala ❖ cromatografia planara
❖ cromatografia de inlocuire ❖ cromatografia pe hartie
III - dupa starea fizica a fazei mobile:
❖ cromatografia de gaze (GC)
❖ cromatografia de lichide (LC)
❖ cromatografia de lichide supercritice (SFC)

IV - dupa mecanismul de separare: V - tehnici speciale:

❖ cromatografia de adsorbtie ❖ cromatografia in faza inversa
❖ cromatografia de partitie
❖ cromatografia in faza normala
❖ cromatografia de schimb ionic
❖ cromatografia de excluziune
❖ analiza isocratica
❖ cromatografia de afinitate ❖ elutie in gradient
 Tipurile de cromatografie

Clasificare dupa faza mobila:

– Gaz - cromatografia de gaze (GC)
» 1951 Martin and James (acizi grasi)
– Lichid – cromatografia de lichide (LC)
» 1964 Horvath (Yale) aparatura
» 1966 Horvath si Lipsky (componentele acidului nucleic)
– Fluid supercritic – Cromatografia cu fluide
supercritice (SFC)
» 1978 Lovelock (Yale) metaboliti
7
 FAZA MOBILA
Poate sa fie simpla (solutii apoase) sau mixta (tampon + solvent organic).
Se poate folosi in conditii:
- isocratice (compozitia fazei mobile ramane constanta in timpul separarii)
- in gradient (compozitia fazei mobile se modifica in timpul procesului)
Substanta Concentratia (mM) Domeniul de pH
Acid maleic 20 1,5 – 2,5

Acid formic 50 3,8 – 4,3

Acid acetic 50 4,8 – 5,2

Fosfat de sodiu 50 6,7 – 7,6
Trietanolamina 20 7,3 – 7,7
Tris 20 7,6 – 8,0
Dietanolamina 20 -50 8,4 – 8,4
Etanolamina 20 9,0 – 9,5
Piperadina 20 10,6 – 11,6
 FAZE MOBILE
Solutie volatil/ Recomandat pentru
pKa pH UV
tampon nevolatil a fi folosit
TFA 0.5 1.5 volatil 210 Da (0.02-0.1%)
Acid acetic 4.76 3.8-5.8 volatil 210 Da (0.1-1%)

Acid formic 3.75 2.8-4.8 volatil 210 Da (0.1-1%)

3.76- volatil/ Da (1-10mM), NH4;K
Acetat 4.76 210
5.76 nevolatil ;Na
2.75- volatil/ Da (1-10mM), NH4;K
Formiat 3.75 210
4.75 nevolatil ;Na
1.15- volatil/
2.15 DA
3.15 nevolatil
Fosfat 210
6.20-
7.20 nevolatil Nu pentru pH>7
8.20
Acid
2.1 1.1-3.1 nevolatil 200 Da (0.1-1%)
fosforic
 FAZE STATIONARE

Evolutia Silicagelului

1960 – Silice peliculara

1970 – Silice naturala neregulata de 10 μm
1980 – Silice sferica naturala de 5 μm
1990 – Silice sferica 3-5 μm de inalta puritate
2000 – Silicagel hibrid (co-polimer
organic/inorganic) de inalta puritate
Dimensiunea porului determina capabilitatea moleculelor de
analit de a intra in particula si de a interactiona cu suprafata sa
interioara. Acest este in special important datorita faptului ca
proportia dintre suprafata exterioara si cea interioara a
particulei este 1:1000.
Interactiunea moleculara de suprafata se petrece la suprafata
interioara a particulei.
Particule sferice si neregulare
 Liganzii din faza stationara

C18
C8
C4
aminopropil
cianopropil
diol
 DETECTORI
Detectorul da posibilitatea valorificarii calitative si cantitative a rezultatului analizei.
Clasificare:
I-dupa forma de raspuns:
→ detectori diferentiali, masoara diferentele in compozitia efluentului;
→ detectori integrali, masoara cantitatea de proba ajunsa la detector.

II-dupa proprietatea determinata:

→ detectori sensibili la concentratie, raspunsul este proportional cu
concentratia componentului;
→ detectori sensibili la debit de masa, raspunsul varieaza cu cantitatea de
proba ajunsa la detector in unitatea de timp.

III-dupa sensibilitate:
→ detectori universali, prezinta un semnal la toti compusii din efluent cu
exceptia fazei mobile;
→ detectori selectivi, detecteaza grupari inrudite ale componentelor probei;
→ detectori specifici, prezinta semnalul unui singur component sau la unui
numar limitat de componente cu proprietati chimice asemanatoare.
 Detectia se bazeaza pe proprietatile fizice si/sau chimice ale analitului
Detectorii pot masura caracteristicile optice, spectroscopice, electrice,
electrochimice, de masa ale analitilor
Concentratia Domeniu de
Denumire Selectivitate
minima linearitate
(mg mL-1)
Detector UV-VIS - molecule organice mari si compusi ai metalelor
5x10-10 5x104
tranzitionale care absorb lumina UV-VIS
Detector de - molecule organice puternic condensate;
10-11-10-9 103
fluorescenta - compusi care emit radiatie fluorescenta

Detector de - compusi care disocieaza in ioni (anorganici,

conductivitate 10-9 103
organici), aminoacizi
electrica
Detector indice de - detector non-specific cu cost redus
10-6 104
refractie
Detector - compusi care se oxideaza si reduc usor
10-10-10-8 -
electrochimic

Detector selectiv
- cel mai selectiv - 104
- cost ridicat
de masa
 Cromatograma

Semnalul detectorului in functie timpul de

retentie sau volumul
Semnalul Detectorului

1 2
Prezenta mai multor
picuri impartite in
functie de timp / volum
evidentiaza separarea
componentelor

timp sau volum

Aria picului  Concentratia 16

Picul cromatografic
 A
Timpul de aparitie al
unui pic (timpul de
E

Cromatograf
D
retentie) pentru
B
componentul/analitul
dat
C

Cromatograma
Marimea relativa a
picului (aria sau
Abundenta

B E
A
C
inaltimea) este
proportionala cu
abundenta relativa
a compusului in
D
amestec.
0 5 10 15 20
Timp (minute)
 Parametrii caracteristici
Timpul de retentie (tR) –timpul necesar unui solut dupa
injectare pentru a ajunge la detector.
Timpul mort (tM) – timpul necesar speciilor neretinute
pentru a parcurge distanta pana la detector;
Viteza fazei mobile (u) = L/tM; rata medie liniara de
miscare a moleculelor in faza mobila;
Viteza componentului din faza stationara (v) =
L/tR;
L= lungimea coloanei cromatografice;
Coeficientul de partitie K = cs/cm unde
cs = concentratia in faza stationara (molara);
cm= concentratia in faza mobila (molara);
 Volumul mort, Vm

volumul fazei lichide din

interiorul coloanei

Volumul mort este de cca.

65% din volumul coloanei
Cromatograma
Termeni utilizati 2[( tR ) B − (tR ) A ]
RS =
in cromatografie WA + WB

Rezolutia (RS) s-a utilizat

pentru caracterizarea
separabilitatii a doi
componenti.
Rezolutia creste daca se
reduce largimea zonei.
Rezolutia e influentata de
proprietatile
termodinamice ale
sistemului.
Optimizarea separarilor cromatografice
 Aparatura pentru LC

Eluent puternic/slab
Pompa (pana la 8000 psi)
Injector
Coloana
Detector
{Colector automat de fractii}
Computer

24
Moduri de separare folosind LC (I)

Adsorptia sau faza normala

Faza inversa
Interactia hidrofobica
Excluziunea marimii (cernere moleculara)
Schimbul ionic
Afinitatea

25
 Moduri de separare folosind LC (II)

Adsorbtia sau faza normala

– Faza stationara este mai polara decat cea
mobila
»coloana: hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2
»Faza mobila: hexan, CH2Cl2, THF, CH3OH
»Gradientul de elutie

26
Moduri de separare folosind LC (III)
Faza inversa (RPC)
– Faza stationara este hidrofoba si faza mobila este
hidrofila
– coloana: silica, polistiren modificat din punct de vedere
al covalentei cu un derivat alchil de 3-18*C
» Faza mobila : apa (solutie tampon) + solvent organic
(propanol CH3CN, CH3OH)
» gradient de elutie
Afinitatea (AC)
– Se bazeaza pe interactiile specifice si selective dintre
enzime sau anticorpi si liganzi
27
Moduri de separare folosind LC (IV)

Interactia hidrofobica (HIC)

– Faza stationara este hidrofoba si faza
mobila hidrofila
»Faza stationara: lanturi scurte de alchil
sau fenil cu densitate mica
»Faza mobila: concentratie
descrescatoare de solutii concentrate de
sare (3M NH4SO4)
»gradientul de elutie

28
Moduri de separare folosind LC (V)
Excluziune sterica (cernere moleculara)
(SEC)
– Interactiile chimice dintre proba si faza stationara nu
sunt dorite; separarea se obtine prin mecanismul de
“cernere” folosind o faza stationara poroasa
» Faza stationara: diferite tipuri de silice
» Faza mobila: putere ionica slaba (100 mM)
solutie tampon sau acid diluat (0.1% TFA) cu
CH3CN sau izopropanol (20-50%)
» Elutie izocratica
29
 METODA HPLC
•Cromatografia lichida de inalta performanta (HPLC) este un sistem de
operare cromatografica in care faza mobila este un lichid
•Fata mobila lichida este introdusa printr-o coloana care contine faza
stationara
Cromatograma este reprezentarea separării care a avut loc în sistemul HPLC. O
serie de peak-uri sunt puse în evidenţă faţă de linia de bază. Fiecare peak
reprezintă răspunsul detectorului la un anumit compus. Cromatograma este
imprimată de staţia computerizată.

Modul în care sunt create peak-urile

Prezentarea schematică a unui cromatograf de
lichide (HPLC) modern
 Abordarea elutiei

Isocratic – compozitie constanta a fazei

mobile
Gradient de elutie– compozitie variabila a
fazei mobile
– in trepte – schimbarea clara obtinuta la un
anumit punct in timp
– continuu – schimbarea este realizata constant
in timp

33
 Proprietatile unui bun detector
Sensibilitatea
– Raspuns/ C
Selectivitatea
– Raspuns universal sau selectiv
» selectivitatea – posibilitatea de a diferentia speciile chimice
Raspuns rapid
Linearitatea – domeniul de concentratie in care
semnalul este proportional cu concentratia
Stabilitatea in raport cu zgomotul (zgomotul de
fond) si timp (curgere)
34
 Detectori pentru LC
UV-Vis
– PMT (single )
– PDA (simultaneous multi-  monitoring)
Fluorescenta
Spectrometru de masa
Electrochimic
– Amperometrie
NMR
– microspirala NMR 35
 Spectrometrul de masa-MS

Sursa de ionizare
Analizorul
Componentele
– Caracteristici de diferentiere m/z
Detector de ioni

Captarea de electroni (EC)

– 70 eV e- + molecula neutra → ion molecular activ
Metodele – grea; fragmentare
de Ionizare chimica (CI)
– Ion reactiv + molecula → ion molecular + ion reactiv
ionizare
– Ion reactiv = He, OH- (apa), CH5+ sau CH3+ (CH4)
36
– usoara; putina fragmentare
 Metode de ionizare MS

Electrospray (ESI)
– Generarea de ioni prin dizolvarea sau desorbtia
unor picaturi de lichid incarcate electric
Desorbtia cu laser de pe o matrice
(MALDI)
– Ionizarea este facilitata de iradirea laser a probei
dizolvate intr-o matrice organica
– EX: acidul sinapinic

37
 Spectrometre de masa

Cuadrupol – cele mai obisnuite

Captator de ioni Tipuri
Timpul de zbor (TOF)

Scanare
Moduri – Colectare de date masice pe un domeniu cunoscut
de (lenta)
operare Monitorizarea ionilor selectivi (SIM)
– Masa probelor la valori predeterminate (rapida)
38
Sistem HPLC multiplu cu detectie MS

Autosampler

Pompa HPLC

valva
Pompa HPLC
Detector
MS
Pompa HPLC

Pompa HPLC

0 4min
Analiza HPLC in paralel

Sistem Sistem Sistem Sistem Sistem

1 2 3 4 1

date de la detectia MS
Moduri de separare folosind LC (VI)

Schimbul ionic (CSI)

– Interactiile de schimb ionic dintre analitul
(cationic sau anionic) si faza stationara
» Faza stationara: polistiren, silice
modificata cu grupe functionale precum
aminele cuaternare
» Faza mobila: solutie tampon continand
concentratii de saruri in crestere (NaCl,
MgCl2, K3PO4, NH4SO4)

41
 Schimbul ionic

Puternic – sarcina electrica a unui

schimbator de ion puternic este independenta
de pH
– Acizi Sulfonici (cation)
– Amine cuaternare (anion)
Slab – sarcina electrica a unui schimbator de
ioni slab este dependenta de pH
– Carboximetil celuloza (CM) (cation)
– Amine primare, secundare si tertiare, de ex.
dietilaminoetil (DEAE) (anion)
42
 FAZE STATIONARE
Schimbatorii de ioni sunt substante insolubile in apa, care au proprietatea de a
schimba ioni din structura lor (contraioni) cu ioni de acelasi semn dintr-o
solutie exterioara (proba) cu care vine in contact
naturali
1 - dupa modul de obtinere
sintetici
anorganici
organici
2 - dupa natura lor
micsti
anioniti
3 - dupa sarcina electrica
cationiti
puternici
4 - dupa taria gruparii functionale
slabi
Tipuri de schimbători de ioni
Răsini de polistiren
Celuloză si schimbători de ioni gel (dextran)
Silice poroasă

dextran
 Cromatografie de schimb anionic

Răsinile de schimb anionic utilizate de regula sunt cele de

amine cuaternare (Q-resin) și dietilaminoetan (DEAE)
 Cromatografie de schimb cationic
Răsinile schimbatoare de cationic mai frecvent utilizate sunt:
- S-resin, sulfate derivatives; răsini CM , carboxylate derived
ions
Grupe functionale in schimbul ionic

Schimb cationic
– Acid Sulfonic – SO3- (H+)
O

=
– Acizi Carboxilici – C – O-(H+)
Schimb anionic
– Amine Primare – NH3+(OH-)
+
CH3
– Amine Tertiare
– N – CH3 (OH-)
CH3
Faza Stationară – Răsina schimbătoare de ioni

Faza mobilă:
Pentru schimb cationic - H+
Pentru schimb anionic - OH-
pH-ul este controlat cu solutii tampon
– Ex. HCO3-/CO3—
Polistirene Divinilbenzen

CH CH2 CH CH2 CH CH2

R R
CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2

R R R
 Aplicatiile cromatografiei ionice
Separarea moleculelor se bazează pe diferențele de sarcină totale ale
proteinelor. Fiind deseori utilizată pentru purificarea proteinelor, dar poate
fi utilizată și pentru purificarea oligonucleotidelor, peptidelor și alte
molecule cu sarcina ionica.

Proteina de interes, respectiv sarcina moleculară ce ne interesează are

sarcină contrară față de gruparea funcțională adăugată la rășină (faza
stationara).

Este procesul de separare a ionilor și moleculelor polare bazate pe

proprietăților de sarcină a moleculelor

Prezintă utilizarea pe aproape orice fel de sarcină moleculară:

– Proteine
– Nucleotide
– Amino acizi
 IC pentru proteine
Cromatografia de schimb ionic implică două etape
principale:
- Contactul proteinei cu răsina
- Elutia sau deplasarea proteinei din răsină
Importante la contact sunt pH tampon folosit pentru
a echilibra si încărca proteina pe coloană
Factorii care controlează elutia sunt pH si/sau tăria
ionică
Schimbătorii de ioni utilizati mai frecvent sunt:
– Schimbator anioni – DEAE (dietilaminoetan)
– Schimbator cation – CM (carboxilmetil)
Schimbul anonic - Proteine
Schimbul anionic - proteina faza acida de
legatura
slaba – DEAE sau
puternica – amina cuaternara
N+(CH2CH3)2
N+(CH2CH3)2
Resin N+(CH2CH3)2
N+(CH2CH3)2
N+(CH2CH3)2 52
Protein
Schimbul cationic - Proteine
Schimbul cationic – proteina este faza
bazica de legatura
slaba – CM sau
puternica - sulfonica
COO-

COO-
Resin

COO-
COO- 53
Protein
Separarea unui amestec de medicamente
SEPARAREA STANDARD A HEMOGLOBINEI UMANE

Creşterea pH-ului la 4,9

Rezoluţia se îmbunătăţeşte prin
creşterea pH-ului la 4,9. Gradientul este de
la 0 la 500mM NaCl în 20 minute
(25mM/min).
Creşterea pH-ului la 5,5
Rezoluţia este îmbunătăţită în
continuare prin creşterea pH-ului la 5,5.
Gradientul de la 0 la 500 mM NaCl în 20
minute (25 mM/min).
Folosind un gradient mai mic.
Eluţia finală este cu citrat TEA 20mM la
pH 5,5 cu un gradient 25-125mM NaCl în 20
minute. Creşterea saltului iniţial la 25mM şi
făcând gradientul mult mai mic la 5mM
creşte în totalitate per minut, rezolvând
hemoglobina umană standard.
 PURIFICAREA
ANTICORPILOR
IgG de bovine şi albumina serică de
bovine.
Imunoglobulinele pot fi separate de
albumine, transferaze şi proteaze. Acest
lucru este ilustrat în separarea IgG bovină
de albumina serică bovină prin
cromatografia de schimb de anioni de
înaltă performanţă.
Separarea anticorpilor din serul de oaie.
Separarea albuminei serice de oaie
ilustrează nu numai purificarea de anticorpi
a probelor de alţi componenţi, dar, de
asemenea, fracţionarea în continuare a
anticorpilor în subclase prin cromatografia
de schimb de anioni de înaltă performanţă
folosind o coloană de schimb de anioni de
tip DEAE.
Cromatograma HPLC a compusilor din sucul de
portocale