A New Potentiometric Sensor for

Determination and Screening

Phenylalanine in Blood Serum Based on
Molecularly Imprinted Polymer
Zahra Bangaleh,a Hayedeh Bagheri Sadeghi,b,* Soltan Ahmad Ebrahimi,a and Parvaneh
Najafizadeha
Author information Article notes Copyright and License information Disclaimer
Go to:

Abstract
Methods routinely utilized for detection of phenylalanine in new-born blood consist of
enzymatic assays, lacking sensitivity and HPLC assays which are expensive and time-
consuming to conduct. We, here, report for the first time, the construction of a
phenylalanine sensitive electrode, on the basis of a selective molecularly imprinted
polymer, offering sensitivity, economy and ease of use for the measurement of
phenylalanine .The sensor was constructed of a graphite-rod electrode which was coated
by MIP embedded polymer base made from polyvinyl chloride and plasticizer mixture,
dissolved in THF. At optimized conditions the electrode revealed a Nernstian response
29.73 ± 1.0 mV decade-1 in a concentration range of 1 × 10⁻⁸ to 1 × 10-4 M with
detection limit of 5 × 10⁻⁹ M. The potential response of the electrode was constant in the
pH range of 4.0–7.5. The electrode unfolded a response time of ~20 sec. The selectivity
coefficient of the sensor towards a number of different amino acids with molecular
similarities and some metal ions was evaluated. The sensor was successfully used for
determination of phenylalanine in blood serum and the results were in good compatibility
with HPLC method.

Metodele utilizate în mod obișnuit pentru detectarea fenilalaninei în sângele nou-născut

constau în analize enzimatice, lipsite de sensibilitate și teste HPLC care sunt costisitoare
și consumă mult timp. Aici, raportăm pentru prima dată, construcția unui electrod sensibil
la fenilalanină, pe baza unui polimer selectiv imprimat molecular, care oferă sensibilitate,
economie și ușurință de utilizare pentru măsurarea fenilalaninei. Senzorul a fost construit
dintr-un grafit- electrod cu tijă care a fost acoperit cu baza polimerică încorporată MIP,
fabricată din clorură de polivinil și amestec de plastifiant, dizolvată în THF. În condiții
optimizate, electrodul a dezvăluit un răspuns Nernstian 29,73 ± 1,0 mV deceniu-1 într-un
interval de concentrație de 1 × 10⁻⁸ la 1 × 10-4 M cu limita de detecție de 5 × 10⁻⁹ M.
Răspunsul potențial al electrodului a fost constantă în intervalul pH de 4,0–7,5.
Electrodul a desfășurat un timp de răspuns de ~ 20 sec. A fost evaluat coeficientul de
selectivitate al senzorului față de un număr de aminoacizi diferiți, cu asemănări
moleculare și unele ioni metalici. Senzorul a fost utilizat cu succes pentru determinarea
fenilalaninei în serul din sânge, iar rezultatele au fost în bună compatibilitate cu metoda
HPLC.

Key Words: Phenylalanine, Potentiometric sensor, Molecular electrochemistry, MIPs

Go to:

Introduction
L-Phenylalanine is an α-amino-acid with the formula C6H5CH2CH(NH2)COOH, molar
mass of 165.19 g/mol and pK a 9.13 (1) (Figure 1). This essential amino-acid is classified
as nonpolar because of the hydrophobic nature of the benzyl side chain. L-Phenylalanine
(LPA) is an electrically neutral amino-acid used to biochemically form proteins. LPA is
found naturally in the breast milk of mammals. It is used in the manufacture of food and
drink products and sold as a nutritional supplement for its reputed analgesic and
antidepressant effects. It is a direct precursor to the neuromodulator phenethylamine, a
commonly used dietary supplement. Phenylketonurea is an inborn metabolic disorder
which is characterized by increased serum phenylalanine. This hyperphenylalaninemia is
mainly due to the abnormally low activity of phenylalanine hydroxylase, the enzyme
responsible for the conversion of phenylalanine to tyrosine. As a result of this genetic
defect, phenylalanine and its metabolites from alternative biochemical pathways,
accumulate in the brain leading to tissue damage which manifests itself as abnormal
neurological development and mental retardation. There is no cure for this abnormality
and the most effective treatment for the affected individuals is early detection followed
by strictly limiting phenylalanine intake in food. As a result, in many countries
hyperphenylalaninemia screening programs for the newborn have been run by health
agency for many years. The frequency of this abnormality in the population varies greatly
from one country to another, being low in Finland (1:200000) and Japan (1:120000)
while it is much higher in Turkey (1:2600) and Iran (1:3672) (2).

L-Phenylalanine

Figure 1
L-Fenilalanina este un alfa-aminoacid cu formula C6H5CH2CH (NH2) COOH, masa
molară de 165,19 g / mol și pK a 9,13 (1) (Figura 1). Acest aminoacid esențial este
clasificat ca nepolar datorită naturii hidrofobe a lanțului lateral benzilic. L-fenilalanina
(LPA) este un aminoacid neutru electric utilizat pentru formarea biochimică a proteinelor.
LPA se găsește în mod natural în laptele matern al mamiferelor. Este utilizat la fabricarea
produselor alimentare și a băuturilor și vândut ca supliment nutritiv pentru reputațiile sale
efecte analgezice și antidepresive. Este un precursor direct al neuromodulatorului
fenetilamină, un supliment alimentar utilizat frecvent. Fenilcetonurea este o tulburare
metabolică înnăscută care se caracterizează prin creșterea fenilalaninei serice. Această
hiperfenilalaninemie se datorează în principal activității anormal de scăzute a
fenilalaninei hidroxilază, enzima responsabilă de conversia fenilalaninei în tirozină. Ca
urmare a acestui defect genetic, fenilalanina și metaboliții săi din căile biochimice
alternative se acumulează în creier care duce la deteriorarea țesuturilor care se manifestă
ca dezvoltare neurologică anormală și retard mental. Nu există nicio vindecare pentru
această anomalie, iar cel mai eficient tratament pentru persoanele afectate este depistarea
timpurie, urmată de limitarea strictă a aportului de fenilalanină în alimente. Drept urmare,
în multe țări, programele de screening de hiperfenilalaninemie pentru nou-născut au fost
conduse de agenția de sănătate de mai mulți ani. Frecvența acestei anomalii în populație
variază mult de la o țară la alta, fiind scăzută în Finlanda (1: 200000) și Japonia (1:
120000), în timp ce este mult mai mare în Turcia (1: 2600) și Iran (1: 3672 ) (2). –
raportare la Romania

L-Phenylalanine (LPA)

There are few methods for determination of phenylalanine, such as Gutrie test,
flourometric and HPLC-Tandem Mass Spectrometry (2-5) which is the method of choice
as it offers great specificity and excellent sensitivity for the detection of phenylalanine in
serum or other matrices. As mentioned above, there is no cure for this disease and early
detection is of paramount importance for effective suppression of symptoms later in life.
In many countries access to modern mass spectrometric or chromatographic methods is
not immediately available to all health centers and therefore, detection of phenylketonuria
(PKU) requires the sample to be sent to central labs. This process is expensive and time
consuming often taking days for the sample to reach the lab and results to get back. Thus
the need is strongly felt for a method which is simple enough to carry out in all health
centers/maternity units and also has suitable analytical characteristics with regards to
sensitivity, selectivity and reproducibility. Electrochemical sensors appear to be good
candidates.

Există puține metode de determinare a fenilalaninei, cum ar fi testul Gutrie, florometric și

Spectrometria de masă HPM-Tandem (2-5), care este metoda de alegere, deoarece oferă o
mare specificitate și o sensibilitate excelentă pentru detectarea fenilalaninei în ser sau alte
matrice. . Așa cum am menționat mai sus, nu există nicio vindecare pentru această boală,
iar detectarea timpurie are o importanță crucială pentru suprimarea eficientă a
simptomelor ulterior în viață. În multe țări, accesul la metode moderne de spectrometrie
sau cromatografice de masă nu este imediat disponibil pentru toate centrele de sănătate și,
prin urmare, detectarea fenilcetonurie (PKU) necesită trimiterea eșantionului în
laboratoarele centrale. Acest procedeu este costisitor și consumă mult timp, luând adesea
zile pentru ca proba să ajungă în laborator și rezultatele să se întoarcă. Astfel, nevoia este
puternic resimțită de o metodă suficient de simplă de efectuat în toate centrele de sănătate
/ unități de maternitate și are, de asemenea, caracteristici analitice adecvate în ceea ce
privește sensibilitatea, selectivitatea și reproductibilitatea. Senzorii electrochimici par a fi
buni candidați.

Molecularly imprinted polymers (MIPs) are attractive as versatile and inexpensive

materials capable of molecular recognition. MIPs consist of highly cross-linked polymers
that are synthesized in the presence of a template molecule. Subsequent removal of the
template leaves a cavity that retains affinity and selectivity for the template.

Polimerii imprimați molecular (MIP) sunt atractivi ca materiale versatile și ieftine,

capabile de recunoaștere moleculară. MIP-urile constau din polimeri extrem de reticulate,
care sunt sintetizate în prezența unei molecule șablon. Îndepărtarea ulterioară a șablonului
lasă o cavitate care păstrează afinitate și selectivitate pentru șablon.

The cavity is analogous to the ‘active site’ of enzymes. These MIPs have shown to be
useful in enantioseparations, catalysis, solid-phase extraction, drug delivery
chromatography and in the preparation of sensors specific for the analytes of interest,
using a variety of sensing methods (6). Over the two decades, imprinted polymers have
attracted a broad interest from the scientists engaged in sensor development. This
attention can be attributed to the serious potential advantages of the MIPs usage in place
of natural receptors and enzymes, such as their superior stability, low cost, high
selectivity, and easy preparation. A few examples of detection methods using imprinted
polymers include: fluorescence (7), luminescence (8), surface Plasmon resonance (9-10)
quartz crystal microbalance (10), impedance measurement (11), induced scintillation
(12), field effect transistor (13), optical approaches (14-15), and acoustic wave sensors
(16). Currently, there is an increasing number of the MIP reports on electrochemical
sensors with capacitive (17-18), conductometric (19), amperometric (20-21), and
voltammetric (22-24) transduction. Despite the relatively simple transduction of the
potentiometric signal, only limited reports on design of the potentiometric sensors based
on the molecular imprinted technology can be found in literature (25-30).

Cavitatea este analogă cu „situl activ” al enzimelor. Aceste MIP-uri s-au dovedit a fi utile
în enantioseparate, cataliză, extracție în fază solidă, cromatografie cu administrare de
medicamente și în prepararea senzorilor specifici pentru analitele de interes, folosind o
varietate de metode de detectare (6). De-a lungul celor două decenii, polimerii imprimați
au atras un interes larg din partea oamenilor de știință implicați în dezvoltarea senzorilor.
Această atenție poate fi atribuită avantajelor potențiale grave ale utilizării MIP-urilor în
locul receptorilor și enzimelor naturale, cum ar fi stabilitatea lor superioară, costul scăzut,
selectivitatea ridicată și prepararea ușoară. Câteva exemple de metode de detectare care
utilizează polimeri imprimați includ: fluorescență (7), luminiscență (8), rezonanță
plasmatică de suprafață (9-10) microbalanță cristalină de cuarț (10), măsurare de
impedanță (11), scintilație indusă (12), efect de câmp tranzistor (13), abordări optice (14-
15) și senzori de undă acustică (16). În prezent, există un număr tot mai mare de rapoarte
MIP despre senzori electrochimici cu transducție capacitivă (17-18), conductometrică
(19), amperometrică (20-21) și voltammetrică (22-24). În ciuda transducției relativ simple
a semnalului potențiometric, în literatura de specialitate se pot găsi doar rapoarte limitate
despre proiectarea senzorilor potențiometrici bazate pe tehnologia imprimată moleculară
(25-30

In this work we have developed a new ion selective electrode based on molecularly
imprinted polymers for determination of phenylalanine, which to our knowledge is the
first reported electrode of this kind.

În această lucrare am dezvoltat un nou electrod selectiv cu ioni bazat pe polimeri

imprimați molecular pentru determinarea fenilalaninei, care, din cunoștința
noastră, este primul electrod raportat de acest fel.

Go to:

Experimental
Materials and Instruments

L-phenylalanine (LPA), tyrosine, valine, tryptophane, histidine, aspartic acid, leusine,

iso-leusine, glycine, polyvinyl chloride (PVC), dibutyl phetalate (DBP), dioctylphetalate
(DOP), nitrobenzene (NB), ortho-nitrophenoloctyl ether (O-NPOE), sodium tetraphenyl
borate (NaTPB), oleic acid (OA), potassium tetrakis (KTpClPB), and ethylene glycol
dimethacrylate (EDMA) were obtained from Sigma-Aldrich (Milwaukee, USA).

2,2’-Azo-bis-iso-butyronitrile (AIBN)was obtained from Acros (Geel, Belgium).

Tetrahydrofuran (THF), acetonitrile (ACN), methanol (MeoH) and acetic acid were all of
HPLC grade and purchased from Aldrich (USA), and used without any further
purification. The potential measurements were performed by means of Metrohm-629
pH/mv meter.

L-fenilalanină (LPA), tirozină, valină, triptofan, histidină, acid aspartic, leusină, izo-
leuzină, glicină, clorură de polivinil (PVC), ftalat de dibutil (DBP), dioctilphetalat (DOP),
nitrobenzen (NB), orto- nitrofenoloctil eter (O-NPOE), borat de sodiu tetrapenil
(NaTPB), acid oleic (OA), tetrakis de potasiu (KTpClPB) și dimetacrilat de etilen glicol
(EDMA) au fost obținute de la Sigma-Aldrich (Milwaukee, SUA). 2,2’-azo-bis-izo-
butironitril (AIBN) a fost obținut din Acros (Geel, Belgia). Tetrahidrofuranul (THF),
acetonitrilul (ACN), metanolul (MeoH) și acidul acetic au fost de toate HPLC și au fost
achiziționate de la Aldrich (SUA) și au fost folosite fără alte purificări. Măsurările
potențiale au fost efectuate cu metru Metrohm-629 pH / mv

Preparation of Phenylalanine Imprinted Polymer

The molecularly imprinted polymer against L-phenylalanine was synthesized as reported

previously (31). A mixture of acetonitrile (3 mL) and glacial acetic acid (0.6 mL)
containing 1 mmol L-Phenylalanine and 1.2 mM trichloroacetic acid (TCA) was
prepared. After sonication for 10 min, 2 mL of acetonitrile containing 0.5mmol 2,2’-Azo-
bis-iso-butyronitrile (AIBN) and 20 mmol ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) was
added. The solution was mixed for 5 min in a thick walled glass tube and sparged with
argon for a further 5 min. The reaction vessel was sealed and the polymerization reaction
was allowed to proceed for 24 h at room temperature. The polymer mass obtained was
ground into a powder and washed with MeOH (four times) and 10% w/v TCA (once).
The MIP was again washed by resuspension in 5% acetic acid solution and
centrifugation. This step was repeated (usually about 25 times) until no L-phenylalanine
could be detected by HPLC. The polymer was washed with distilled water, by
centrifugation and resuspension, until the pH of the supernatant equaled that of water.
After drying, grinding, and passing through a series of sieves (particle size less than 74
µm), the polymer was used to prepare PVC film electrodes. The NIP was synthesized in
the absence of phenylalanine with the same procedure as MIP.

Polimerul imprimat molecular împotriva L-fenilalaninei a fost sintetizat așa cum a fost
raportat anterior (31). S-a preparat un amestec de acetonitril (3 ml) și acid acetic glacial
(0,6 ml) care conține 1 mmol L-fenilalanină și 1,2 mM acid tricloroacetic (TCA). După
sonicare timp de 10 minute, s-au adăugat 2 ml de acetonitril conținând 0,5 mmoli 2,2-
Azo-bis-izo-butironitril (AIBN) și 20 mmol etilenglicol dimetacrilat (EDMA). Soluția a
fost amestecată timp de 5 min într-un tub de sticlă cu pereți groși și a fost întinsă cu argon
pentru încă 5 min. Vasul de reacție a fost sigilat și reacția de polimerizare a fost lăsată să
continue 24 de ore la temperatura camerei. Masa de polimer obținută a fost măcinată într-
o pulbere și spălată cu MeOH (de patru ori) și 10% greutate în greutate TCA (o dată).
MIP a fost spălat din nou prin resuspensie în soluție de acid acetic 5% și centrifugare.
Această etapă a fost repetată (de obicei de aproximativ 25 de ori) până când nu a putut fi
detectată L-fenilalanină de către HPLC. Polimerul a fost spălat cu apă distilată, prin
centrifugare și resuspensie, până când pH-ul supernatantului a egalat cu cel al apei. După
uscare, șlefuire și trecere printr-o serie de site (dimensiunea particulelor mai mică de 74
um), polimerul a fost utilizat pentru a pregăti electrozii de film din PVC. NIP a fost
sintetizat în absența fenilalaninei cu aceeași procedură ca MIP.

Electrode Preparation
The sensor was prepared by thoroughly mixing 10 mg of MIP or NIP, 30 mg of PVC, 59
mg of O-NPOE as plasticizer and 1 mg NaTPB as additive in 2 mL of THF. The resulting
mixture was completely dissolved and left for about 20 min until the extra solvent
evaporated and a concentrated mixture was obtained. A carbon rod was then dipped into
the mixture until it was covered with a thin layer of the mixture. Then, the modified
carbon rod was left for few hours to dry and finally a piece of copper foil and a wire was
attached to the upper end of the electrode to make the electrical connection possible
Figure 2.

Senzorul a fost preparat prin amestecarea completă a 10 mg de MIP sau NIP, 30 mg de

PVC, 59 mg de O-NPOE ca plastifiant și 1 mg NaTPB ca aditiv în 2 ml de THF.
Amestecul rezultat a fost dizolvat complet și lăsat timp de aproximativ 20 min până la
evaporarea solventului suplimentar și a fost obținut un amestec concentrat. O tijă de
carbon a fost apoi introdusă în amestec până când a fost acoperită cu un strat subțire de
amestec. Apoi, tija de carbon modificată a fost lăsată timp de câteva ore să se usuce și în
final o bucată de folie de cupru și un fir s-a atașat la capătul superior al electrodului
pentru a face posibilă conexiunea electrică

Block diagram of proposed electrode

Since the aim of the research was to measure small amounts of blood serum, it was
decided to make a special cell which can hold only few milliliters (~ 2 mL each
compartment) of the sample. This cell is constructed of two small compartments
connected to each other by a narrow channel and has a sample inlet and drain outlet. The
cell dimensions are shown in Figure 3.The sample is pumped in by a peristaltic pump
Figure 4. It must be mentioned that the pump is only used to transfer the sample into the
cell compartments and measurements are performed in quiescent solution.
Întrucât scopul cercetării a fost măsurarea unor cantități mici de ser sanguin, s-a decis
realizarea unei celule speciale care să poată ține doar câteva mililitri (~ 2 ml fiecare
compartiment) din probă. Această celulă este construită din două mici compartimente
conectate între ele printr-un canal îngust și are o intrare și o ieșire de eșantion.
Dimensiunile celulelor sunt prezentate în figura 3. Eșantionul este pompat de o pompă
peristaltică Figura 4. Trebuie menționat că pompa este utilizată doar pentru a transfera
proba în compartimentele celulei și măsurările sunt efectuate în soluție liniștită

Figure 3

Schematic diagram of the designed system

Figure 4

Schematic diagram of the cell

Emf Measurements

The performance of the sensor was investigated by measuring the emf values of various
phenylalanine standard solutions. Potentiometric evaluation of the electrodes was carried
out using the following cell:

Ref. electrode | |test solution | MIP membrane coated carbon rod electrode

Activity coefficients of ions in aqueous solutions were calculated according to the Debye-
Hückel equation.

Performanța senzorului a fost investigată prin măsurarea valorilor emf ale diferitelor
soluții standard de fenilalanină. Evaluarea potențiometrică a electrozilor a fost efectuată
folosind următoarea celulă:

Ref. electrod | | soluție de testare | Electrod cu tija de carbon acoperită cu membrană MIP

Coeficienții de activitate ai ionilor în soluții apoase au fost calculați conform ecuației

Debye-Hückel.

Go to:

Results and Discussion

Optimization of the Membrane

Effect of different amounts of PVC, MIP, plasticizer, and additive were investigated on
performance of membrane. Different types of plasticizers such as O-NPOE, DOP, DBP,
and NB were used and to reduce the ohmic resistance, additives KTpCIPB and NaTPB
were examined. The results are listed in Table 1. The best response was exhibited by the
membrane no. 7 incorporating MIP, PVC, O-NPOE, NaTPB, and THF as solvent in the
ratio of 10:30:59:1(MIP: PVC: O-NPOE: NaTPB in %wt) respectively.

S-a investigat efectul diferitelor cantități de PVC, MIP, plastifiant și aditiv

asupra performanței membranei. Au fost utilizate diferite tipuri de plastifianți
precum O-NPOE, DOP, DBP și NB și pentru a reduce rezistența ohmică, au
fost examinați aditivii KTpCIPB și NaTPB. Rezultatele sunt enumerate în
tabelul 1. Cel mai bun răspuns a fost prezentat de membrana nr. 7 încorporând
MIP, PVC, O-NPOE, NaTPB și THF ca solvent în raportul de 10: 30: 59: 1
(respectiv MIP: PVC: O-NPOE: NaTPB în% în greutate).
Table 1

Optimization of membrane ingredient

Membrane O- Linear Slope

MIP PVC DOP NB NaTPB KTpCIPB OA THF
No. NPOE Range (mV/decade)
10-6 –
1 6.5 31 - - 61 1.5 - - 1.5 2.0
10-7
10-4 –
2 6.5 31 61 - - 1.5 - - 1.5 11.3
10-7
10-4 –
3 8.5 30 60 - - 1.5 - - 1.5 16.6
10-7
10-4 –
4 8.5 30 - 60 - 1.5 - - 1.5 12.3
10-7
10-4 –
5 10 30 - - 59 1 - - 1.5 4.0
10-8
5 × 10-
6 10 30 - - 59 - 1 - 1.5 4 – 5 × 9.3
10-7
10-5 –
7 10 30 - - 59 - - 1 1.5 2.2
10-8
10-4 –
8 10 30 - 59 - 1 - - 1.5 12.9
10-8
10-4 –
9 10 30 - 59 - - 1 - 1.5 5.3
10-8
10-5 –
10 10 30 59 - - - - 1 1.5 16.5
10-8
10-4 –
11 [a] 10 30 59 - - 1 - - 1.5 29.7
10-8
10-4 –
12 [b] 10 30 59 - - 1 - - 1.5 3.6
10-8
10-3 –
13 [c] - 30 59 - - 1 - - 1.5 _
10-8
Open in a separate window

[a] MIP. [b] NIP. [c] Blank.

Effect of pH

The sample pH effect on potential response of the sensor was tested with a 10-6 M
standard solution of LPA.
The pH of solutions was adjusted between 2-12 by addition of concentrated NaOH or
HCl solution and potentials were recorded. Results are shown in Figure 5. A constant
potential response in pH range of 4-7.5 can be observed. At alkaline pH values formation
of hydroxyl amino-acid complex and in acidic solution (pH less than 4.0) protonation of
phenylalanine are most probably responsible for this behavior. Therefore, it was decided
to make all potential measurements in pH 6.0.

Efectul pH-ului probei asupra răspunsului potențial al senzorului a fost testat cu o soluție
standard de 10-6 M de LPA.

PH-ul soluțiilor a fost ajustat între 2-12 prin adăugarea soluției concentrate de NaOH sau
HCl și au fost înregistrate potențialele. Rezultatele sunt prezentate în figura 5. Un răspuns
potențial constant în intervalul de pH de 4-7,5 poate fi observat. La valorile de pH
alcaline formarea complexului de hidroxil aminoacid și în soluția acidă (pH mai mic de
4,0) protonarea fenilalaninei sunt cel mai probabil responsabile de acest comportament.
Prin urmare, s-a decis efectuarea tuturor măsurătorilor potențiale în pH 6,0.

Figure 5
Effect of pH on the response of optimized electrode

Calibration Curve

The potential response curves of MIP-, NIP and the blank membrane are shown in Figure
6.

Figure 6

Calibration curve for proposed electrode with optimized composition based on MIP NIP,
and blank (with no polymer)

The MIP membrane shows a Nernstian response of 29.73 ± 0.92 mv per decade over the
concentration range of 1 × 10⁻⁸ to 1 × 10⁻⁴ M with a detection limit of 5 × 10-9. At very
high concentration of phenylalanine, calibration curve levels off due to saturation of
imprinted phenylalanine. This is not considered as a disadvantage since, determination of
very low concentration of phenylalanine is needed for evaluation of
hyperphenylalaninemia in new-born blood.
Curba de calibrare pentru electrodul propus cu compoziție optimizată pe baza MIP NIP,
și semifabricat (fără polimer)

Membrana MIP prezintă un răspuns nernstian de 29,73 ± 0,92 mv pe deceniu în intervalul

de concentrație de 1 × 10⁻⁸ la 1 × 10⁻⁴ M cu o limită de detecție de 5 × 10-9. La
concentrații foarte mari de fenilalanină, curba de calibrare se degajează datorită saturației
fenilalaninei imprimate. Acest lucru nu este considerat un dezavantaj, deoarece
determinarea concentrației foarte scăzute de fenilalanină este necesară pentru evaluarea
hiperfenilalaninemiei în sângele nou-născut.

Response Time and Reversibility of the Electrode Response

Response time of an ion-selective electrode is defined as the average time required for the
sensor to reach ± 1 mv of the magnitude of the equilibrated potential signal after
successively immersing the electrode in a series of ion solution, each having a 10 fold
concentration difference. The dynamic potential response with time is presented in Figure
7. As seen, the electrode reaches to its equilibrium response in a short time (<20 sec) in
all concentrations. To evaluate the reversibility of the electrode, a similar procedure with
opposite direction was adopted.

Timpul de răspuns al unui electrod selectiv de ioni este definit ca timpul mediu necesar
pentru ca senzorul să atingă ± 1 mv din mărimea semnalului potențial echilibrat după
imersarea succesivă a electrodului într-o serie de soluții ionice, fiecare având o diferență
de concentrație de 10 ori . Răspunsul potențial dinamic cu timpul este prezentat în Figura
7. După cum se vede, electrodul atinge răspunsul său de echilibru într-un timp scurt (<20
sec) în toate concentrațiile. Pentru a evalua reversibilitatea electrodului, a fost adoptată o
procedură similară cu direcție opusă.
Figure 7

Dynamic response of the electrode for step changes in phenylalanine concentration

The measurements were performed in the sequence of high-to-low sample

concentrations, and the results are shown in Figure 8. It shows that the potentiometric
responses of the sensor was reversible and had no memory effect, although the time
needed to reach equilibrium values were longer than that of low-to-high sample
concentration.

Măsurătorile au fost efectuate în secvența concentrațiilor de probă mari până la mici, iar
rezultatele sunt prezentate în figura 8. Arată că răspunsurile potențiometrice ale
senzorului au fost reversibile și nu au avut efect de memorie, deși timpul necesar pentru
atingerea valorilor de echilibru au fost mai lungi decât cea a concentrației de eșantion
scăzut-înalt.
Figure 8

Response characteristics of proposed electrode for high to low sample cycle

Interference Studies

The existence of the interfering ions affects the response behavior of ion-selective
electrodes. For this reason, the term of selectivity coefficients, KSel, is employed to
describe this phenomenon. In our investigation, the calculation of the selectivity
coefficients was conducted with the help of the matched potential method (MPM). In
matched potential method, the potentiometric selectivity coefficient is defined as the
activity ratio of primary and interfering ions that give the same potential change under
identical conditions. At first, a known activity (a ‘A) of the primary ion solution is added
into a reference solution that contains a fixed activity (a A) of primary ions, and the
corresponding potential change (ΔE) is recorded. Next, a solution of an interfering ion
(B) is added to the reference solution until the same potential change, (ΔE) is recorded.
The change in potential produced at the constant background of the primary ion must be
the same in both cases. The selectivity coefficient of the sensor towards a number of
different amino acids with molecular similarities and some metal ions was evaluated. The
results are listed in Table 2, and shown in Figure 9.
Existența ionilor interferenți afectează comportamentul de răspuns al electrozilor selectivi
de ioni. Din acest motiv, termenul coeficienților de selectivitate, KSel, este folosit pentru
a descrie acest fenomen. În cadrul investigației noastre, calculul coeficienților de
selectivitate a fost realizat cu ajutorul metodei potențiale potrivite (MPM). În metoda
potențialului potrivit, coeficientul de selectivitate potențiometrică este definit ca raportul
de activitate al ionilor primari și interferenți care dau aceeași schimbare potențială în
condiții identice. La început, o activitate cunoscută (o „A) a soluției de ioni primari este
adăugată într-o soluție de referință care conține o activitate fixă (a) de ioni primari și se
înregistrează modificarea potențială corespunzătoare (ΔE). Apoi, la soluția de referință se
adaugă o soluție a unui ion interferențial (B) până când se înregistrează aceeași
modificare potențială (ΔE). Schimbarea potențialului produs pe fundalul constant al
ionului primar trebuie să fie aceeași în ambele cazuri. A fost evaluat coeficientul de
selectivitate al senzorului față de un număr de aminoacizi diferiți, cu asemănări
moleculare și unele ioni metalici. Rezultatele sunt enumerate în tabelul 2 și sunt
prezentate în figura 9

Table 2

Selectivity coefficient values using matched potential method

Interference log KAB pot

Tyrosine 1.65 × 10-3
Tryptophan 4.95 × 10-3
Histidine 6.18 × 10-3
Valine 3.8 × 10-3
Aspartic Acid 8.25 × 10-3
Leucine 3.09 × 10-3
Isoleucine 8.25 × 10-3
Glycine 4.5 × 10-3
Ca2+ 3.53 × 10-3
Na+ 4.95 × 10-3
Mg2+ 1.65 × 10-3
K+ 4.95 × 10-3

Open in a separate window

Figure 9
(a, b and c) Potential response of proposed electrode towards a number of different amino
acids with molecular similarities and some metal ions

Analytical Application

The proposed sensor was directly used as an indicator electrode for determination of
phenylalanine in human blood serum. Human blood was collected from 21 thoroughly
controlled blood donors (new-born up to 25 years old) from a diagnostic laboratory in
Tehran. The red blood cells were separated by centrifugation and then the blood serum
was frozen at -20 °C. Before use; the blood serum was thawed for about an hour at room
temperature. Sample solutions for direct potentiometric determination were prepared by
dilution of 10 µL of blood serum to 5 mL by deionized water. The potential was
measured and the concentration of phenylalanine was calculated from calibration curve
line-equation. Each experiment was repeated three times (n = 3) and the mean values are
listed in Table 3. Dilution coefficient was taken into account in concentration calculation
of each sample. To verify the results and obtain the accuracy of the potentiometric
method, the measurements were made by standard HPLC method used in medical
diagnostic laboratories.

Senzorul propus a fost utilizat direct ca electrod indicator pentru determinarea

fenilalaninei în serul din sângele uman. Sângele uman a fost colectat de la 21 de donatori
de sânge controlați minuțios (nou-născuți până la 25 de ani) dintr-un laborator de
diagnostic din Teheran. Celulele roșii au fost separate prin centrifugare și apoi serul din
sânge a fost înghețat la -20 ° C. Inainte de folosire; serul de sânge a fost decongelat
aproximativ o oră la temperatura camerei. Soluțiile de probă pentru determinarea
potențiometrică directă au fost preparate prin diluarea a 10 ul de ser sanguin la 5 ml cu
apă deionizată. Potențialul a fost măsurat și concentrația de fenilalanină a fost calculată
din linia ecuației curbei de calibrare. Fiecare experiment a fost repetat de trei ori (n = 3),
iar valorile medii sunt enumerate în tabelul 3. Coeficientul de diluare a fost luat în calcul
la concentrația fiecărui eșantion. Pentru verificarea rezultatelor și obținerea exactității
metodei potențiometrice, măsurătorile s-au făcut prin metoda HPLC standard folosită în
laboratoarele de diagnostic medical.

Table 3

Recoveries obtained by potentiometric method in respect to standard HPLC method

ID Potentiometric response (µM) HPLC response (µM) Recovery (%)

1 1332 1291 103
2 646 624 103
3 580 563 103
4 558 557 100
5 460 455 101
6 362 352 103
7 162 163 99
8 57 60 95
9 142 151 93
10 44 48 91
11 53 67 79
12 190 194 98
13 394 418 94
14 74 91 82
15 603 642 94
16 222 212 104
17 168 170 99
18 175 200 87
19 61 79 78
20 1220 1091 111
21 1551 1376 112
Open in a separate window

HPLC assay of phenylalanine

The HPLC analysis of serum phenylalanine was carried out using an assay based on the
method described by Hilton (32). Briefly, 50 µL of 500 mM methyl-DL-phenylalanine,
as internal standard, was added to 50 µL serum sample. The solution was mixed for 30
sec. One-hundred-fifty µL 5% perchloric acid was added to the solution and the mixture
was vortex mixed for 30 sec. Thirty µL of 2 M KOH was added and mixed for 10 sec.
The cloudy solution was allowed to stand at 4 °C for 10 min. The solution was
centrifuged at 4000×g and 40 µL of the supernatant was injected onto the HPLC column.
The chromatography conditions were as follows: Isocratic separation was affected using
a mixture of Acetonitrile: 2 mM sodium dihydrogen phosphate buffer (pH 3.5) (3:97 by
volume), pumped at a flow rate of 1 mL per min through a 4.6 × 150 mm, 5 µm, ODS-B,
and Tracer Excel column (Teknokroma, Barcelona, Spain). The column eluate was
monitored at 214 nm. The chromatograph consisted of a Young Lin 9100 HPLC system
(Young Lin, Korea). Chromatograms were recorded using Autochro-3000 software
package (Young Lin, Korea). The HPLC assay was calibrated using phenylalanine-spiked
serum samples over the range of 10 to 1250 µM. Assay validity was regularly checked
using commercial control sera. The recovery results are summarized in Table 3 and
correlation coefficient between the two methods (R2 = 0.9949) is shown in Figure 10
which both indicates the excellent performance of the sensor.

Analiza HPLC a fenilalaninei serice a fost efectuată utilizând o analiză bazată pe metoda
descrisă de Hilton (32). Pe scurt, 50 pL de 500 mM metil-DL-fenilalanină, ca standard
intern, au fost adăugate la 50 pL probă serică. Soluția a fost amestecată timp de 30 sec.
La soluție s-a adăugat o sută cincizeci de pL acid percloric 5% și amestecul a fost
amestecat vortex timp de 30 sec. S-au adăugat treizeci ui de KOH 2 M și s-au amestecat
timp de 10 sec. Soluția tulbure a fost lăsată să stea la 4 ° C timp de 10 min. Soluția a fost
centrifugată la 4000 × g și 40 ul de supernatant au fost injectate pe coloana HPLC.
Condițiile de cromatografie au fost următoarele: separarea izocratică a fost afectată
folosind un amestec de Acetonitril: tampon cu fosfat de sodiu dihidrogen de 2 mM (pH
3,5) (3:97 în volum), pompat la un debit de 1 ml pe minut până la 4,6 × 150 mm, 5 µm,
coloana ODS-B și Tracer Excel (Teknokroma, Barcelona, Spania). Coloana eluată a fost
monitorizată la 214 nm. Cromatograful a constat dintr-un sistem HP Lin 9100 HPLC
(Young Lin, Coreea). Cromatogramele au fost înregistrate folosind pachetul software
Autochro-3000 (Young Lin, Coreea). Testul HPLC a fost calibrat folosind probe de ser
cu vârf de fenilalanină pe un interval de 10 până la 1250 pM. Validitatea testului a fost
verificată în mod regulat folosind seruri de control comercial. Rezultatele de recuperare
sunt rezumate în tabelul 3 și coeficientul de corelație dintre cele două metode (R2 =
0.9949) este prezentat în figura 10, care indică ambele performanțe excelente ale
senzorului.
Figure 10

Correlation of the potentiometric and HPLC measurements of phenylalanine in 21 blood

serum samples

Go to:

Conclusion
In this work we have developed a new ion selective electrode based on molecularly
imprinted polymers for determination of phenylalanine in blood serum, which to our
knowledge is the first reported electrode of this kind. The sensor was constructed of a
carbon rode which was coated by a membrane consisting of phenylalanine MIP, o-NPOE
as plasticizer and NaTPB as additive. A special cell was designed, constructed and used
instead of usual beakers, which permitted small volumes of sample intake. At optimized
conditions the electrode exhibited a nernstian response 29.73 ± 1.0 mV decade⁻¹ in a
concentration range of 1 × 10⁻⁸ to 1 × 10⁻⁴ M with detection limit of 5 × 10⁻⁹ M. The
potential response of the electrode was constant in the pH range of 4.0–7.5. The electrode
unfolded a response time of ~20 sec. The selectivity coefficient of the sensor towards a
number of different amino acids with molecular similarities and some metal ions was
evaluated. The sensor was successfully used for determination of phenylalanine in blood
serum and the results were in good compatibility with HPLC method and offered the
sensitivity required for the detection of phenylalanine in biological fluids. The proposed
sensor is easy to use, fast, and cost-effective.

În această lucrare am dezvoltat un nou electrod selectiv ionic bazat pe polimeri imprimați
molecular pentru determinarea fenilalaninei în serul din sânge, care, din cunoștința
noastră, este primul electrod raportat de acest fel. Senzorul a fost construit dintr-o rulă de
carbon care a fost acoperită de o membrană formată din fenilalanină MIP, o-NPOE ca
plastifiant și NaTPB ca aditiv. O celulă specială a fost proiectată, construită și utilizată în
loc de paharele obișnuite, ceea ce a permis mici volume de prelevare de probe. În condiții
optimizate, electrodul a prezentat un răspuns nernstian 29,73 ± 1,0 mV deceniu⁻¹ într-un
interval de concentrație de 1 × 10⁻⁸ la 1 × 10⁻⁴ M cu limita de detecție de 5 × 10⁻⁹ M.
Răspunsul potențial al electrodului a fost constantă în intervalul pH de 4,0–7,5.
Electrodul a desfășurat un timp de răspuns de ~ 20 sec. A fost evaluat coeficientul de
selectivitate al senzorului față de un număr de aminoacizi diferiți, cu asemănări
moleculare și unele ioni metalici. Senzorul a fost utilizat cu succes pentru determinarea
fenilalaninei în serul din sânge, iar rezultatele au fost în bună compatibilitate cu metoda
HPLC și au oferit sensibilitatea necesară pentru detectarea fenilalaninei în fluidele
biologice. Senzorul propus este ușor de utilizat, rapid și rentabil.

Go to:

Acknowledgment
This work was supported by grant number 12886 from Iran University of Medical
Sciences. The researchers would like to thank the staff of the Pharmacology Department
at Iran University of Medical Sciences.

Go to:

References
1. Dawson RMC. Data for Biochemical Research. 1st ed. Clarendon Press, UK : Oxford
Sciences Publications; 1959. [Google Scholar]
2. Mitchell JJ, Trakadis YJ, Scriver CR. Phenylalanine hydroxylase deficiency. Genet.
Med. 2011;13:697–707. [PubMed] [Google Scholar]
3. Guthrie R, Susi A. A simple Phenylalanine method for detecting Phenylketonuria in
large population of newborn infants. Pediatrics. 1963;32:338–43. [PubMed] [Google
Scholar]
4. Pandor A, Eastham J, Beverley C, Chilcott J, Paisley S. Clinical effectiveness and cost
effectiveness of neonatal screening for inborn errors of metabolism using tandon mass
spectrometry. Health Technol. Assess. 2004;8:1–121. [PubMed] [Google Scholar]
5. Williams RA, Mamotte CDS, Burnett JR. Phenylketonuria: an inborn error of
Phenylalanine metabolism. Clin. Biochem. Rev. 2008;29:31–41. [PMC free article]
[PubMed] [Google Scholar]
6. Haupt K, Mosbach K. Molecularly imprinted polymers and their use in biomimetic
sensors. Chem. Rev. 2000;100:2495–504. [PubMed] [Google Scholar]
7. Suárez-Rodríguez JL, Díaz-García ME. Fluorescent competitive flow-through assay
for chloramphenicol using molecularly imprinted polymers. Biosens. Bioelectron.
2001;16:955–61. [PubMed] [Google Scholar]
8. Jenkins AL, Uy OM, Murray GM. Polymer-based lanthanide luminescent sensor for
detection of hydrolysis product of the nerve agent soman in water. Anal. Chem.
1999;71:373–8. [PubMed] [Google Scholar]
9. Klar T, Perner M, Grosse S, von Plessen G, Sprikle W, Feldman J. Surface-plasmon
resonance in single metallic nanoparticles. Phys. Rev. Lett. 1998;80:4249–51. [Google
Scholar]
10. Kikuchi M, Shiratori S. Quartz crystal microbalance (QCM) sensor for CH3SH gas
by using polyelectrolyte-coated Sol-Gel film. Sens. Actuators B Chem. 2005;108:564–
71. [Google Scholar]
11. Panasyuk-Delaney T, Mirsky VM, Ulbricht M, Wolfbeis OS. Voltammetric sensor
for vanylmanelic acid on molecularly imprinted polymer-modified electrodes. Anal.
Chim. Acta. 2001;435:157–62. [Google Scholar]
12. Ye K, Mosbach K. Polymers recognizing biomoleculs based on a combination of
molecular imprinting and proximity scintillation. J. Am. Chem. Soc. 2001;123:2901–2.
[PubMed] [Google Scholar]
13. Zayats M, Lahav M, Kharitonov AB, Willner I. molecularly imprinted polymers for
analytical chemistry application. Tetrahedron. 2002;58:815–24. [Google Scholar]
14. McDonagh C, Burke CS, MacCraith BD. Optical chemical sensors. Chem. Rev.
2008;108:400–22. [PubMed] [Google Scholar]
15. Suárez-Rodríguez JL, Díaz-García ME. Flavonol fluorescent flow-through sensid
based on a molecularly imprinted polymer. Anal. Chim. Acta. 2000;405:67–76. [Google
Scholar]
16. Tan Y, Peng H, Liang C, Yao S. A new assay system for Phenacetin using biomimic
bulk acoustic wave sensor with a molecularly imprinted polymer coating. Sens. Actuators
B Chem. 2001;73:179–84. [Google Scholar]
17. Blanco-López MC, Lobo-Castañón MJ, Miranda-Ordieres AJ, Tuñón-Blanco P.
Electrochemical sensors based on a molecularly imprinted polymers. Trends Analyt.
Chem. 2004;23:36–48. [Google Scholar]
18. Suedee R, Intakong W, Dickert FL. Molecularly imprinted polymer- modified
electrode for on-line conductometric monitoring of Haloacetic acid in chlorinated water.
Anal. Chim. Acta. 2006;569:66–75. [Google Scholar]
19. Weng CH, Yeh WM, Ho KC, Lee GB. A microfluidic system utilizing molecularly
imprinted polymer film for amperometric detection of morphine. Sens. Actuators B
Chem. 2007;121:576–82. [Google Scholar]
20. Gómez-Caballero A, Unceta N, Goicolea MA, Barrio RJ. Voltammetric
determination of metamitron with an electrogenerated molecularly imprinted polymer
microsensor. Electroanalysis. 2007;19:356–63. [Google Scholar]
21. Kriz D, Mosbach K. Competitive amperometric morphin sensor based on a agarose
immobilized molecularly imprinted polymer. Anal. Chim. Acta. 1995;300:71–5. [Google
Scholar]
22. Gholivand MB, Torkashvand M. A novel high selective and sesitive metronidazole
voltammetric sensor based on a molecularly imprinted polymer. Talanta. 2011;84:905–
12. [PubMed] [Google Scholar]
23. Javanbakht M, Fard SE, Mohammadi A, Abdouss M, Ganjali MR, Norouzi P,
Safaraliee L. Molecularly imprinted polymer based potentiometric sensor for
determination of Hydroxyzine in tablets and biological fluids. Anal. Chim. Acta.
2008;612:65–74. [PubMed] [Google Scholar]
24. Kirsch N, Hart JP, Bird DJ, Luxton RW, McCalley DV. Towards the development of
molecularly imprinted polymer based screen –printed sensor for metabolites of PAH S.
Analyst. 2001;126:1936–41. [PubMed] [Google Scholar]
25. Alizadeh T, Akhoundian M. A novel potentiometric sensor for promethazine based
on a molecularly imprinted polymer (MIP): The role of MIP structure on the sensor
performance. Electrochim. Acta. 2010;55:3477–85. [Google Scholar]
26. Liang R, Zhang R, Qin W. Potentiometric sensor based on molecularly imprinted
polymers for determination of melamine in milk. Sens. Actuators B Chem.
2009;141:544–50. [Google Scholar]
27. Saber Tehrani M, Vardini MT, Abroomand Azar P, Husain SW. Molecularly
imprinted polymer based PVC-membrane-coated graphite electrode for the determination
of Metoprolol. J. Iran. Chem. Soc. 2010;7:759–69. [Google Scholar]
28. Sadeghi S, Fathi F, Abbasifar J. Potentiometric sensing of Levomisol hydrochloride
based on molecularly imprinted polymers. Sens. Actuators B Chem. 2007;122:158–64.
[Google Scholar]
29. Bagheri Sadeghi H, Ebrahimi SA, Tamaddon A, Bozorgvar F, Affifinia H, Almasian
N, Mollaei S. Potentiometric sensing of Lamotrigine based on molecularly imprinted
polymers. Electroanalysis. 2011;23:2716–23. [Google Scholar]
30. ChenY , Chen L, Bi R, Xu L, Liu Y. A potentiometric chiral sensor for L-
phenylalanine based on crosslinked polymethylacrylic acid-polycarbazole hybrid
molecularly imprinted polymer. Anal. Chim.Acta. 2012;754:83–90. [PubMed] [Google
Scholar]
31. Najafizadeh P, Ebrahimi SA, Panjeshahin MR, Kamyab Hesari K, Rezayat
Sorkhabadi SM. Synthesis of a phenylalanine imprinted polymer for attenuation of
phenylalanine absorption via the gut in a murine hyperphenylalaninemia model. J. Mater.
Chem. B . 2014;2:2144–52. [Google Scholar]
32. Hilton MA. Liquid-chromatographic direct determination of phenylalanine and
tyrosine in serum or plasma,with application to patients with phenylketonuria. Clin.
Chem. 1982;28:1215–18. [PubMed] [Google Scholar]