COD: PR_HCN_03

PROTOCOL
Versiune: 02
Prelucrare histopatologica
Pagina: 1 / 6

Pentru prelucrarea pieselor în vederea obţinerii de lame pentru diagnostic histopatologic sunt necesare
următoarele operaţiuni:
1. Fixare în formol
2. Prelevarea pieselor
3. Prelucrare histologica a ţesuturilor
4. Includere în parafină
5. Secţionare la microtom
6. Etalarea sectiunilor
7. Colorarea secţiunilor
8. Montarea lamelor

1.FIXAREA

Fixarea urmăreşte oprirea procesului de descompunere a ţesuturilor pentru a păstra forma şi structura
celulelor, utilizand soluţii cu proprietăţi speciale numite substanţe fixatoare.
Dupa primirea pieselor/produselor, cu verificarea acestora, a documentelor de insotire si semnarea de
primire, ASAP procedeaza la fixarea lor.
Reguli de fixare
Fragmentele de ţesuturi şi organe trebuie fixate cât mai rapid după recoltare pentru a evita uscarea /
retractarea lor, în recipiente care se inchid etans si suficient de mari astfel incat lichidul fixator să aibă un volum
de 2-10 ori mai mare decât volumul piesei (in functie de volumul piesei).
Durata fixării
Fixarea are loc progresiv, regiunile profunde fiind fixate mai târziu decât cele superficiale.
Durata fixării se apreciază în funcţie de natura fixatorului, dimensiunile piesei, structura tesutului şi
temperatura la care se face fixarea. Numai formolul permite păstrarea piesei în lichidul fixator timp indelungat.
Pentru ca fragmentele de organe să fie fixate bine, este nevoie de minimum 24 ore. In mod curent se utilizează
o soluţie de formaldehidă 10% (10 ml formaldehida concentrata diluata cu 90 ml apa de robinet) tamponată cu
carbonat de calciu. Inainte de prelevare, piesele se spala cu apa de robinet 1-2 ore.

2.PRELEVAREA

Prelevarea este efectuata de MCAP/MAP sau ASAP sub supravegherea medicilor anatomopatologi si se
face conform protocolului „Orientarea macroscopica a biopsiilor si pieselor chirurgicale” – PR_HCN_01.
Fragmentele tisulare prelevate sunt incluse de catre ASAP in casete pentru uz histopatologic notate cu
numarul corespunzator.

3.PRELUCRAREA HISTOLOGICA

Prelucrarea histologica a fragmentelor tisulare prelevate si incluse in casete se realizează automat la

histoprocesor. Ca agenţi de deshidratare utilizam alcool etilic, pentru clarificare toluen, iar impregnarea
(parafinarea) se realizează cu parafină histologică.
Perioada de procesare automata a prelevatelor tisulare este de aprox. 24 de ore.
Etapa de fixare este realizata de catre ASAP, iar etapele de deshidratare, clarificare si impregnare cu parafina
sunt realizate automat.

Tehnica şi timpii de lucru pentru procesare:

 fixare în formol tamponat 10%
- timp minim - 24 h
- timp maxim - 48 h
 deshidratare în alcool (timp realizat automat) – 3 bai:
- 96o - timp de 1 h si 30 min
- 96o - timp de 1 h si 30 min
- 96o - timp de 2 h si 30 min

Elaborat Verificat Aprobat

Medic Coordonator Serviciu de Medic Coordonator Serviciu de
Functia Anatomie Patologica si Anatomie Patologica si Director medical
Prosectura Prosectura
Data 17.10.2016

Semnatura

© Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie Cuza Voda, Iasi

 COD: PR_HCN_03
PROTOCOL
Versiune: 02
Prelucrare histopatologica
Pagina: 2 / 6


deshidratare în alcool etilic absolut - 3 băi (timp realizat automat):
- baia I – timp de 1 h si 30 min.
- baia II - timp de 1 h si 30 min.
- baia III - timp de 1 h si 30 min.
 clarificare în toluen - 3 băi (timp realizat automat)
- baia I – timp de 1 h si 30 min.
- baia II – timp de 1 h si 30 min
- baia III – timp de 1 h si 30 min.
 parafinare în 3 băi parafină histological (timp realizat automat):
- baia I - 1 h si 30 min
- baia II - 1 h si 30 min
- baia III - 1 si 30 min.h
Timp de prelucrare 48-72 ore.

4.INCLUDEREA IN PARAFINA

Este operaţiunea prin care se creează condiţii pentru secţionarea în secţiuni subţiri, plane, transparente si
care consta in infiltrarea fragmentului tisular cu un material semidur cu punct de topire fix, ce poate fi secţionat
după solidificare. Parafina folosită este parafină histologică granule cu punct de topire 56-58 °C.
Includerea la parafina este realizata de catre ASAP la inglobatorul de parafina:
- casetele cu prelevatele tisulare impregnate cu parafina la histoprocesor sunt introduse in baia cu
parafina topita a modulului de incalzire al inglobatorului
- pe rand, fiecare caseta este deschisa si i se indeparteaza capacul
- moldul metalic se plaseaza sub robinetul de curgere a parafinei si cu ajutorul unei pense metalice
incalzite se introduce prelevatul tisular
- moldul este umplut pe jumatate cu parafina lichida, apoi este transferat pe punctul de racire si se
aseaza caseta numerotata
- se completeaza cu parafina pana se acopera partial caseta
- se trec moldurile pe placa modulului de racire
- dupa racire se detaseaza moldurile.

5.SECTIONAREA LA MICROTOM

Sectionarea la microtom este o operatie simpla doar in aparenta. In realitate, este un timp dificil de
standardizat, in care sunt implicate experienta, indemanarea si rabdarea ASAP care efectueaza aceasta
operatiune.
Sectionarea este procedura prin care se obtin sectiuni de diferite grosimi care se etaleaza pe lame in
vederea colorarii. Specimenele incluse in parafina se sectioneaza cu lame de unica folosinta adaptate la microtom.
Manipularea blocului in soclu si repozitionarea se fac intotdeauna cu microtomul blocat.
Unghiul de taiere reprezinta inclinatia fata de planul sectiunii. Se considera ca unghiul de 5 - 10° este
optim, exceptand indicatiile speciale din partea firmelor constructoare.
Secţionarea propriu-zisă:
- se indeparteaza excesul de parafina de pe caseta
- se aşează blocurile în ordine, pe numere
- se pregătesc lamele scrise în ordine unse cu o picătură de albumina Mayer (soluţie de albuş de ou +
glicerină în proporţii egale + câteva cristale fenol)
- se ia caseta şi se introduce în lăcaşul specific
- se fixează lama de secţionare
- se retrage dispozitivul în care este fixata caseta cu blocul de parafină cu ajutorul unei manete pâna
la nivelul lamei de secţionare
- se controlează nivelul printr-o mişcare cursivă de sus în jos
- suprafaţa blocului va fi paralelă cu cuţitul

Elaborat Verificat Aprobat

Medic Coordonator Serviciu de Medic Coordonator Serviciu de
Functia Anatomie Patologica si Anatomie Patologica si Director medical
Prosectura Prosectura
Data 17.10.2016

Semnatura

© Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie Cuza Voda, Iasi

 COD: PR_HCN_03
PROTOCOL
Versiune: 02
Prelucrare histopatologica
Pagina: 3 / 6

- se intră uşor în bloc pentru a evidenţia secţiunea şi nivelul de intrare

- când s-a ajuns la nivelul dorit se taie uşor, cursiv, secţiuni de 4 microni
- secţiunile se culeg de pe dispozitiv cu ajutorul pensonului şi se aseaza pe lame notate
corespunzator.

6.ETALAREA SECTIUNILOR

Pregatirea lamelor de catre ASAP:

- numerotarea lamelor, curatate si degresate in prealabil, cu un creion rezistent la reactivii folositi la colorare
(numarul inscriptionat pe lame trebuie sa coincida cu numarul de pe caseta si cel de inregistrare din registru de
analize histopatologice)
- tratarea lamelor cu albumină Mayer (soluţie de albuş de ou + glicerină în proporţii egale + câteva cristale fenol)
Etalarea sectiunilor histopatologice:
- secţiunile se “culeg” de pe dispozitivul de taiere al microtomului cu ajutorul pensonului şi se aseaza pe lame
- etalarea secţiunilor pe lamă şi aderarea lor de aceasta se face cu ajutorul apei distilate şi a acelor de disociere,
la cald, direct pe platina la temp. de 56-58 grade Celsius. Operatiunea este realizata de ASAP.

7.COLORAREA SECTIUNILOR

Colorarea secţiunilor etalate pe lame se face la aautomatul de colorare de catre AUT / ASAP si se
utilizeaza coloratia uzuala hematoxilina eozina. Cand este cazul ASAP efectueaza tehnici speciale de colorare.
Pentru colorarea sectiunilor histologice utilizam solutii gata preparate si kit-uri Merck.

COLORAŢIA HEMATOXILINĂ EOZINĂ

Aplicaţii: este metoda de colorare histopatologică cea mai frecvent utilizată
Principiu: presupune colorarea succesivă a sectiunilor:
- cu un colorant bazic – hematoxilină (colorant natural de origine vegetală) care evidenţiază structurile
bazofile (cromatina nucleară, ribozomii citoplasmatici, granule de secreţie) în nuanţe de albastru
- cu un colorant acid – eozină (colorant sintetic derivat din fluoresceină),care evidenţiază substraturile
acidofile (citoplasmele celulelor mature, fibrele colagene, fibrele musculare), care se colorează în
nuanţe de roz pal la roz viu sau roşu.
Se utilizeaza solutii preparate de Hematoxilina Mayer si Eozina de la firma Merck.
TEHNICA DE COLORARE:
1. Deparafinare în 3 băi succesive de toluen, - 5 min/baie
2. Clatire 3 băi succesive de alcool etilic – 2 bai alc. absolut, 1 baie alc. 96º, timp de 3 min/baie;
3. Spălare cu apa de robinet timp de 1 min ;
4. Colorare cu hematoxilină Mayer acidifiată timp de 3 min;
5. Spălare cu apă de robinet 5 min;
6. Colorare cu eozină apoasa Y timp de 1 min;
7. Clătire cu apă de robinet 1 min;
8. Deshidratare în 3 băi succesive de alcool etilic – 1 baie alc. 96º şi 2 bai alc. Absolut, timp de 1
min/baie ;
9. Clarificare în 3 băi succesive de toluen, prima baie de 3 min si urmatoarele de 5 min/baie.
10. Montare – Entelan.
TIMP DE COLORARE 51 MIN.
REZULTATE: - cromatina nucleară, ribozomii, granulele de secreţie – albastru
- citoplasma celulelor mature, fibrele de colagen, fibrele musculare – roz pal.

COLORAŢIA VAN GIESON

Aplicaţii: este utilizată în special pentru fibrele de colagen şi ţesutul muscular, cu folosirea unor coloranţi
nucleari citoplasmatici şi fibrilari în soluţii care conţin mordant.
Se utilizeaza kit pentru coloratia Van Gieson de la firma Merck.

Elaborat Verificat Aprobat

Medic Coordonator Serviciu de Medic Coordonator Serviciu de
Functia Anatomie Patologica si Anatomie Patologica si Director medical
Prosectura Prosectura
Data 17.10.2016

Semnatura

© Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie Cuza Voda, Iasi

 COD: PR_HCN_03
PROTOCOL
Versiune: 02
Prelucrare histopatologica
Pagina: 4 / 6

SOLUŢIA A:
 Hematoxilină 1g;
 Alcool etilic absolut 100 ml
Soluţia se lasă la maturare 30 de zile.
SOLUŢIA B:
 Clorură ferică 29%;
 Acid clorhidric 1 ml;
 Apă distilată 95 ml.
PICROFUXINĂ:
 10 ml fuxină acidă 1%;
 90 ml soluţie saturată de acid picric
 ELASTINA WEIGERT
TEHNICA DE COLORARE:
1. Deparafinare în 3 băi succesive de toluen – 5 min/baie;
2. Clatire în 3 băi succesive de alcool etilic – 2 bai absolut, 1 baie alc. 96º, timp de 3 min/baie;
3. Spălare cu apă de robinet timp de 1 min;
4. Colorare cu elasina Weigert timp de 10 min ;
5. Spalare cu apa de robinet 1 min ;
6. Colorarea secţiunii cu un amestec în părţi egale din soluţiile A şi B timp de 5 min;
7. Spălare cu apă de robinet 1 min;
8. Colorare cu picrofuxina 2 min;
9. Deshidratare în 3 băi succesive de alcool etilic – 1 baie alc. 96º şi 2 bai alc. absolut, timp de
1 min/baie;
10. Clarificare în 3 băi succesive de toluen timp de 1 min./baie
11. Montare – Entelan.
TIMP DE COLORARE 48 MIN.
REZULTATE: nuclei – negri
fibre de colagen – roşu
citoplasma celulelor musculare şi epiteliale – galbenă.

COLORAŢIA ALBASTRU ALCIAN

Aplicatii: se aplică pentru evidenţierea mucinelor acide şi neutre.
SOLUŢII:
Se utilizeaza kit pentru coloratia ALBASTRU ALCIAN de la firma Merck.
TEHNICA DE COLORARE:
1. Deparafinare în 3 băi succesive de toluen, timp de 3 min/baie;
2. Clatire în 3 băi succesive de alcool etilic – 2 bai alc. absolut si 1 baie alc.96º, timp de 3 min/baie;
3. Spălare cu apă de robinet timp de 1min;
4. Colorare cu soluţie albastru alcian timp de 5 min;
5. Clătire cu apă de robinet 3 min;
6. Spalare cu apa distilata 30 sec;
7. Tratare cu acid periodic 15 min;
8. Clatire cu apa de robinet 3 min;
9. Spalare cu apa distilata 30 sec;
10. Colorare cu reactiv Schiff timp de 15 min;
11. Clatire cu apa de robinet 3 min;
12. Spalare cu apa distilata 30 sec;
13. Colorare cu hematoxilină Mayer timp de 20 sec;
14. Clătire cu apă de robinet 3 min;
15. Deshidratare în 3 băi succesive de alcool etilic – 1 baie alc. 96º şi 2 bai alc. absolut, timp de
1 min /baie;
16. Clarificare în 3 băi succesive de toluen, timp de 1 min/baie;

Elaborat Verificat Aprobat

Medic Coordonator Serviciu de Medic Coordonator Serviciu de
Functia Anatomie Patologica si Anatomie Patologica si Director medical
Prosectura Prosectura
Data 17.10.2016

Semnatura

© Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie Cuza Voda, Iasi

 COD: PR_HCN_03
PROTOCOL
Versiune: 02
Prelucrare histopatologica
Pagina: 5 / 6

17. Montare – Entelan, balsam de Canada.

TIMP DE COLORARE 72 MIN.
REZULTATE: mucopolizaharidele acide – albastru-turcoaz.

COLORAŢIA PAS
Aplicaţii: se aplică pentru a demonstra componenetele normale şi patologice caracterizate prin grupe
adiacente glicolice şi aminohidroxilice.
Se utilizeaza kit pentru coloratia PAS de la firma Merck
TEHNICA DE COLORARE:
1. Deparafinare în 3 băi succesive de toluen, timp de 3 min/baie;
2. Clatire în 3 băi succesive de alcool etilic – 2 bai alc. absolut, 1 baie 96º, timp de 1 min/baie;
3. Spălare in 1 baie cu apă de robinet timp de 1 min;
4. Colorare cu reactivul Schiff timp de 5 min;
5. Spalare cu apa de robinet 3 min;
6. Spalare 1 baie apa distilata 30 sec ;
7. Baie cu Shiff reagent timp de 16 min;
8. Spălare cu apă de robinet timp de 3 min;
9. Spalare 1 baie apa distilata 30 sec ;
10. Colorare cu hematoxilina Mayer timp de 2 min ;
11. Spalare cu apa de robinet timp de 3 min ;
12. Deshidratare in 3 bai succesive de alcool etilic – 1 baie alc. 96º şi 2 bai alc. absolut, timp de 1 min
/baie;
13. Clarificare în 3 băi succesive de toluen, timp de 1 min/baie;
14. Montare – Entelan.
TIMP DE COLORARE 52 MIN.
REZULTATE: celule şi structuri subcelulare – roşu-violaceu.
structuri acelulare – roşu-violaceu
nuclei – albaştri.

COLORATIA GORDON SWEET

Aplicatii: evidenţiază fibrele de reticulină din ţesutul conjunctiv.
Reactivi: soluţia Wilder: într-un cilindru gradat se pipetează 10 ml de azotat de argint 10 %, se adaugă
pipetând 10 ml hidroxid de sodiu 2 %; precipitatul format este dizolvat prin pipetare de amoniac până soluţia
devine limpede. Se completează în cilindru pâna la 100 ml cu AD. Se lasă la maturat 24 de ore la întuneric.
TEHNICA DE COLORARE:
1. Deparafinare în 3 băi successive de toluen, timp de 3 min/baie ;
2. Clatire în 3 băi succesive de alcool etilic – 2 bai alc. absolut si 1 baie alc. 96º, timp de 3 min/baie ;
3. Colorare cu soluţia de permanganat de potasiu 1 % - 1 min ;
4. Spălare cu apa distilata 30 sec;
5. Albire cu soluţie de acid oxalic 1 % - 1 min ;
6. Spălare cu apa distilata 30 sec;
7. Mordansare cu alaun feriamoniacal 2 % timp de 15 min ;
8. Spălare cu apa distilata timp de 30 sec;
9. Tratare cu soluţie Wilder – 7 sec;
10. Spălare cu apa distilata – 30 sec;
11. Tratare cu soluţie formol 10 % - 30 sec;
12. Spălare cu apa distilata – 30 sec;
13. Deshidratare în 3 bai succesive de alcool etilic – 1 baie alc. 96º şi 2 bai alc. absolut, timp de 1 min
/baie;
14. Clarificare în 3 băi succesive de toluen, timp de 1 min ;
15. Montare – Entelan.
TIMP DE COLORARE 44 MIN.

Elaborat Verificat Aprobat

Medic Coordonator Serviciu de Medic Coordonator Serviciu de
Functia Anatomie Patologica si Anatomie Patologica si Director medical
Prosectura Prosectura
Data 17.10.2016

Semnatura

© Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie Cuza Voda, Iasi

 COD: PR_HCN_03
PROTOCOL
Versiune: 02
Prelucrare histopatologica
Pagina: 6 / 6

REZULTATE: fibrele reticulare şi nervoase – negre

ţesutul conjunctiv – brun-cenuşiu
colagenul – galben.

8.MONTAREA LAMELOR

Aceasta etapa a prelucrarii este realizata de AUT / IAP si are menirea de a proteja secţiunea fragilă de
eventuale deteriorări şi de a conserva neschimbată coloraţia.
Efectuarea procedurii:
- suportul cu lame colorate se introduce intr-un recipient cu toluen pentru clarificare
- se pregătesc lamelele cu câte 1-2 picături de Entelan
- se scurge lama pe care se afla secţiunea dupa ce a fost clarificata in toluen si se sugativeaza
usor marginile lamei
- se aplica lama pe lamelă si se comprima usor până adera una de cealaltă
- se scot eventualele bule de aer dintre lamă şi lamelă, apăsând uşor cu unghia sau bagheta
- se şterge lama pe dos şi pe margini, absorbind surplusul
- se aseaza pe tava si se lasă să se usuce la termostat la 56 grade Celsius.
Montarea lamelelor se efectueaza in nisa cu exhaustare.

Abrevieri:
MCAP = Medic Coordonator Anatomie Patologica
MAP = Medic Anatomie Patologica
ASAP = Asistent Anatomie Patologica
AUT = Autopsier
IAP = Ingrijitor Anatomie Patologica

Elaborat Verificat Aprobat

Medic Coordonator Serviciu de Medic Coordonator Serviciu de
Functia Anatomie Patologica si Anatomie Patologica si Director medical
Prosectura Prosectura
Data 17.10.2016

Semnatura

© Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie Cuza Voda, Iasi