VERIFICAREA PURITĂŢII ADN SE REALIZEAZĂ

SPECTROFOTOMETRIC:

• moleculele de ADN monocatenar

(ADNmc) sau dublucatenar (ADNdc)
prezintă absorbanţă maximă la
lungimi de undă care variază între
257 şi 260 nm;
• absorbanţa maximă pentru moleculele
proteice rămase eventual în extract
este la 280 nm;
• absorbanţa maximă pentru moleculele
de glucide rămase eventual în extract
este la 230 nm;
• absorbanţa prezentă la 220 nm este
datorată oligonucleotidelor rezultate
din fragmentarea ADN în timpul
Spectrofotometrul UV-Vis NanoDrop™
extracţiei.
One Microvolume spectrophotometer
69
(Thermo Scientific™)
 A260 nm ŞI A280 nm POT STABILI
GRADUL DE CONTAMINAREA ADN CU
PROTEINE SAU CU ARN
• raportul A260 nm/A280 nm optim este cuprins
între 1,8 şi 2;
• un raport mai mic de 1,8 ne indică o
contaminare cu proteine a extractului;
• un raport mai mare de 2 ne indică o
contaminare cu ARN a extractului.
Spectrul de absorbţie al unei soluţii de ADN
între 220 şi 280 nm.
A260 nm ŞI A230 nm POT STABILI
GRADUL DE CONTAMINARE ADN CU
POLIZAHARIDE
• raportul A260 nm/A230 nm optim
este mai mare ca 2;
• un raport mai mic de 2 ne
indică o contaminare cu
polizaharide a extractului.
70
 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A
CONCENTRAŢIEI ACIZILOR NUCLEICI DINTR-UN
EXTRACT

• Cea mai simplă metodă de se bazează pe citirea

absorbanţei la 260 nm şi apoi pe folosirea
următoarelor formule:
• A260 nm = 1 corespunde la 50 μg ADNdc/ml;
• A260 nm = 1 corespunde la 33 μg ADNmc/ml;
• A260 nm = 1 corespunde la 40 μg ARN/ml
• A260 nm = 1 corespunde la 20 μg oligonucleotide/ml.
• Este totuşi recomandabil ca determinarea
concentraţiei acizilor nucleici pe baza valorii de
absorbanţă la 260nm să fie corelată şi cu
aspectul ADN în gel de electroforeză.
71
 IDENTIFICAREA SPECIEI DE ORIGINE A
MATERIEI PRIME PRIN PCR-RFLP
Tehnica RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
•În mod normal, secvenţele ADN similare prezintă aceeaşi succesiune de nucleotide şi
deci, aceleaşi hărţi de restricţie. Cu toate acestea există situaţii în care la nivelul
secvenţelor apar mici diferenţe cauzate de mutaţii punctiforme, deleţii sau inserţii.
•Endonucleazele prezintă un situs unic de recunoaştere la nivelul secvenţelor de
nucleotide .
•Mutaţiile pot modifica situsurile de restricție astfel încât endonucleazele să nu îşi mai
exercite activitatea enzimatică sau pot genera noi situsuri.

72
 IDENTIFICAREA SPECIEI DE ORIGINE A
MATERIEI PRIME PRIN PCR-RFLP

• În aceste cazuri, hărţile de restricţie se modifică în funcţie de modificările de

secvenţă nucleotidică apărute şi acest fenomen stă la baza principiului tehnicii
RFLP.
• Astfel, dacă realizăm o restricţie enzimatică cu una sau mai multe endonucleaze,
a două fragmente de ADN a căror secvenţe diferă punctual, provenite de la
organisme înrudite, vom obţine cu o probabilitate forte mare profile de restricţie
diferite.
• Fragmentele obţinute în urma reacţiei de restricţie pot fi analizate uşor prin
electroforeză în gel de agaroză. Fiecare secvenţă ADN va genera profile de
restricţie particulare care diferă prin lungimea fragmentelor rezultate.
• Tehnica are aplicaţii în identificarea şi cartarea tulpinilor bacteriene, în analiza
organismelor înrudite sau în studiile de criminalistică.

73
 IDENTIFICAREA SPECIEI DE ORIGINE A
MATERIEI PRIME PRIN PCR-RFLP

• PCR-RFLP este o tehnică în două etape, anume PCR urmat de analiza RFLP a
produșilor de amplificare.
• Se bazează pe existența unor secvențe (situsuri) specifice de restricție în
interiorul fragmentelor amplificate prin PCR.
• Această tehnică a fost aplicată în mare măsură pe carne și specialități din carne
și are capacitatea de a diferenția specii foarte apropiate.
• Avantajele PCR-RFLP sunt legate de simplitatea, costul redus și pretabilitatea
analizei la automatizare.
• Aplicabilitatea PCR-RFLP este diminuată în cazul existenței mutațiilor
intraspecifice la siturile de restricție, a prezenței de specii mixte și gradul ridicat
de prelucrare a materiei prime.
• Markerii mtDNA sunt vizați mai ales în cazul diferențierii speciilor de carne
domestice și de vânat.

74
FLUXUL DE LUCRU ÎN TEHNICA PCR-RFLP

75
 PCR-RFLP ca Instrument molecular de discriminare între carnea provenită de la animale
domestice și vânat

Pregătirea probelor/extracția ADN

Probele au fost spălate cu etanol și apă deionizată.
ADN a fost extras cu kitul Qiagen DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Germany).
Bucațele mici de țesut (25 - 30 mg) au fost amestecate cu 180 μl de tampon de liză inclus în
kit și 20 μl proteinază K, vortexate, și incubate la 56 °C timp de 3 h, până la liza completă.
S-au adăugat 4 ml de RNază A (100 mg·ml-1), și s-a incubat 2 min la temperatura camerei.
Ulterior s-au adăugat 200 μl de tampon inclus în kit și 200 μl de etanol (96–100%), și s-a
vortexat.
Amestecul a fost pipetat în colonițele DNeasy Mini Spin Column și s-a urmărit protocolul
indicat de producător. ADN a fost eluat cu 50 μl de tampon de eluție inclus in kit .
Toate probele (3-7 g) au fost supuse fierberii timp de 10 min, 30 min și 60 min. Aceeași
procedură de extracție a fost urmărită.
76
 TEHNICA PCR-RFLP – STUDIU DE CAZ

• Din gena aleasă 12S rRNA, s-au amplificat 2 fragmente

• Primul fragment amplificat 712–714 bp;
F: GGTAAATCTCGTGCCAGCCA și R: TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGAC
Condiții PCR: 15 pmol din fiecare primer, 200 μmol·L-1 din fiecare dNTP, 1 x tampon
PCR, 2 mmol·l-1 Mg2+, 1,25 U Taq DNA polymerase (HotStarTaq, Qiagen), și 3 μl de
ADN matriță, în volumul final de 30 μl.
hot start 40 cicluri Extensie finală
95 °C 94 °C 60 °C 72 °C 72 °C
15 min 45 s 45 s 45 s 8 min

Câte10 μl de ampliconi PCR au fost digerați cu una din enzimele de restricție AseI (taie
AT^TAAT), FatI (^CATG) sau MseI (T^TAA) (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), (vol.
Final 20 μl). Fragmentele de restricție au fost separate prin electroforeză în gel de
agaroză 3% în tampon TBE (0.089 mol·l-1 Tris, 0.089 mol·l-1 borat, 0.002 mol·l-1 EDTA).

77
 TEHNICA PCR-RFLP – STUDIU DE CAZ
(CONTINUARE)

• Al doilea fragment amplificat 267–269 bp;

F: ACGTTAGGTCAAGGTGTAACC și R: TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGAC
Condiții PCR: 15 pmol din fiecare primer, 200 μmol·L-1 din fiecare dNTP, 1 x tampon
PCR, 3 mmol·l-1 Mg2+, 1,25 U Taq DNA polymerase (HotStarTaq, Qiagen), și 3 μl de
ADN matriță, în volumul final de 30 μl.

hot start 40 cicluri Extensie finală

95 °C 94 °C 53 °C 72 °C 72 °C

15 min 45 s 45 s 45 s 8 min
Câte10 μl de ampliconi PCR au fost digerați cu una din enzimele de restricție AseI, FatI sau
MseI (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), (vol. Final 20 μl). Fragmentele de restricție
au fost separate prin poliacrilamidă 12 % în tampon TBE (0.089 mol·l-1 Tris, 0.089 mol·l-
1 borat, 0.002 mol·l-1 EDTA) și marcate cu bromură de etidium și observate în lumină

UV.

78
ANALIZA HĂRTII RESTRICȚIE FRAGMENT 669-712
PB

79
ANALIZA RESTRICȚIE FRAGMENT 267-269 PB

80
 TEHNICA PCR- AFLP (AMPLIFIED FRAGMENT
LENGHT POLYMORPHISM)

• Tehnica AFLP (Polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate) constă în

amplificarea selectivă a fragmentelor de restricţie generate plecând de la ADN
genomic.
• Tehnica foloseşte endonucleazele de restricţie pentru a cliva ADN genomic, apoi
capetele coezive rezultate sunt folosite pentru legarea unor adaptori specifici cu
ajutorul unor ligaze. După ligare se realizează o reacţie de preamplificare cu
ajutorul unor primeri care hibridizează la nivelul adaptorilor. Prin această reacţie
vor fi amplificate numai acele fragmente care au capetele modificate. Primerii
folosiţi sunt desemnaţi pe baza complementarităţii cu secvenţa adaptorului, având
în plus o nucleotidă fapt care conduce la un proces de amplificare şi mai selectiv
al fragmentelor modificate. Se consideră că în această etapă sunt amplificate
aproximativ un sfert din produşii de restricţie modificaţi prin adăugarea
adaptorilor.
• Produşii reacţiei de preamplificare sunt supuşi unei a doua reacţii PCR selective.
De această dată, primerii utilizaţi sunt formaţi din secvenţa complementară
adaptorilor plus 3 nucleotide suplimentare, această modificare având acelaşi rol,
de a scădea cât de mult posibil numărul fragmentelor ce vor fi amplificate. 81
Ampliconii rezultaţi vor fi analizaţi prin electroforeză în gel de poliacrilamidă.
 TEHNICA PCR- AFLP (AMPLIFIED FRAGMENT
LENGHT POLYMORPHISM)

82
 * SCAR - sequence-characterized amplified regions
• Extracția ADN
• Fragmentele de țesut muscular (25–50 mg) de la ambele specii au fost omogenizate cu 200
μL tampon de extracție (1% (w/w) CTAB (bromură de cetiltrimetilamoniu), 2 mM EDTA,
10 mM Tris–HCl, pH 8.0, 1.4 M NaCl) și 50μg de proteinază K, apoi incubate timp de 2 h
la 55 ◦C.
• Amestecul a fost centrifugat la 10,000 rpm, 2 min. Supernatantul a fost transferat peste
300 μL NaCl (6 M), omogenizat prin inversare și centrifugat la 10,000 rpm, 30 min.
• Un volum egal de izopropanol a fost adăugat peste supernatant și s-a lăsat peste noapte la
−20 ◦C. Precipitatul ADN a fost spălat de două ori cu etanol 70% și o dată cu etanol 100%
• ADN a fost dizolvat în tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA/pH 8.0), și adus la
concentrația de 100 ng/μL , fiind stocat apoi la −20 ◦C. Concentrația ADN s-a măsurat cu
un spectrofotometru DU 600 (Beckman Counlter, Fullerton, CA, USA).

83
 REACTIILE AFLP

• 200 ng ADN genomic din fiecare probă au fost digerate cu 5 U EcoR I și 1 U MseI (New
England BioLabs, Ipswich, MA, USA), realizată simultan cu ligarea adaptorilor cu 68 U T4
ligază (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA). Mediul de reacție a conținut 1×BSA
(bovine serum albumin, BGI LifeTech, Beijing, China) și 0.05 M NaCl fiind menținut la 37
◦C timp de 5 h.
• Pre-amplificarea PCR a fost realizată în volumul final de 20 μL, conținând 2 μL tampon
10×, 0.4 μL dNTP (10 mM), 1.6 μL MgCl2 (25 mM) și 1 U Taq ADN polimerază
(Promega, Madison, WI, USA), cu perechea de primeri F: GACTGCGTACCAATTC și
R: GATGAGTCCTGAGTAA în următoarele condiții

tratament 25 cicluri Extensie finală

72 °C 94 °C 56 °C 72 °C 60 °C

2 min 25 s 30 s 2 min 30 min

• Produșii de pre-amplificare au fost diluați de 10 ori cu tampon TE (20 mM Tris–HCl, 0.1
mM EDTA, pH 8.0) au fost utilizați ca matrițe pentru reacții PCR selective ulterioare .
84
 REACTIILE AFLP

• Reacția PCR selectivă a fost realizată cu combinația de primeri

• EcoRI GACTGCGTACCAATTCCXX
• Mse I GATGAGTCCTGAGTAA AXX
• unde XX reprezintă două nucleotide specifice selecționate pentru a amplifica un subset
de fragmente de restricție
• Reacția PCR a fost următoarea

10 cicluri Extensie finală

1. Touch down PCR* 94 °C 65-56 °C 72 °C
30s 30 s 60 s
24 cicluri
II. PCR normal 94 °C 56 °C 72 °C 72 °C
30s 30 s 60 s 30 min
• Capătul 5’ al primerilor EcoRI a fost marcat cu colorantul fluorescent 6-FAM (Sangon,
Shanghai, China). 85
 TOUCH-DOWN PCR

Tehnica urmăreşte eliminarea la maxim a

• Tehnica Touch-Down PCR
amplificărilor nespecifice.
porneşte de la temperaturi
crescute de hibridizare în primele
În PCR clasic, temperatura de topire a perechii de
cicluri, acestea scăzând treptat
primeri determină limita superioară a temperaturii către sfârşitul reacţiei.
lor de hibridizare – în acest punct, au loc numai
împerecherile specifice primeri-matriţă. • Astfel, în primele cicluri de
La temperaturi mai mici vor apărea şi alte reacţie, la temperaturi crescute,
împerecheri aleatorii. primerii vor hibridiza numai în
regiunile unde potrivirea este
optimă. Ca urmare, se vor
amplifica numai acele secvenţe
pentru care ei au omologie
maximă.
• Aceste fragmente amplificate în
primele cicluri vor servi drept
matriţă pentru amplificările
ulteriore care se realizează la
temperaturi mai scăzute. 86
 REZULTATE

Electroforeza în gel de poliacrilamidă

5 μL produși de amplificare au fost omogenizați cu
tampon de încărcare AFLP [98% (v/v) formamidă,
10mMEDTA, 0.25% bromophenol și 0.25% xilen cianol],
denaturate la 95 ◦C timp de 10 min și răcite imediat pe
gheață
Gelul de PAA 10% [9.66% acrilamidă, 0.34% bisacrilamidă,
7M uree) a fost rezolvat în tampon 1×TBE (0.89 M Tris,
0.89 M acid boric, 0.02 M EDTA, pH 8)] la 180 V, 6 h.
Gelul a fost fixat în acid etanoic 10% , 1 h și marcat cu
azotat de argint ( 0.1% AgNO3 și 0.15% formaldehyde
37% ) timp de 30 min, și revelat (3% Na2CO3, 0.15%
formaldehidă (37%), 0.002% Na2S2O3).
Liniile 1-5 sunt specimene diferite de păstrăv curcubeu.
Se observă unicitatea profilului de benzi, dar și o bandă
comună apare la toți indivizii și numai la probele de 87
păstrăv, nu si la somon.
 PCR ÎN TIMP REAL (REAL-TIME PCR)

Prin Real-Time PCR se realizează concomitent amplificarea şi cuantificarea acumulării unei

secvenţe de ADN ţintă.
Metoda este folosită în principal pentru detectarea nivelului de expresie al unor gene dar şi
pentru a detecta prezenţa unor mutaţii la nivelul diferitelor regiuni din ADN. Practic, tehnica
are atât aplicaţii calitative (identificarea unor mutaţii sau a tulpinilor bacteriene diferite), cât şi
cantitative (determinarea nivelurilor de expresie a genelor, sau identificarea proprției dintr-un
anumit ingredient într-un produs).
Metodele tradiţionale folosesc gelul de agaroză pentru detectarea şi caracterizarea produşilor
PCR. Aceasta abordare ridică diverse probleme de rezoluţie, sensibilitate sau precizie.
Real-Time PCR este o tehnică mult mai eficientă datorită acurateţii cantitative a amplificării şi
detecţiei acumulării ampliconului pe parcursul întregii reacţii de amplificare. Astfel, proba este
monitorizată în timp real şi există avantajul că la ora actuală metoda este complet
automatizată.

88
 PRINCIPIUL CUANTIFICĂRII ÎN
REAL-TIME PCR
Real-Time PCR înglobează mecanismele de
amplificare şi detecţie într-un singur proces
prin folosirea marcării cu compuşi fluorescenţi
care au capacitatea de a corela concentraţia
ampliconilor cu intensitatea semnalului
luminos.
- Coloranţi fluorescenţi intercalanţi – se
folosesc compuşi de tipul SYBR-Green care
posedă o proprietatea că atunci când sunt liberi
în soluţie prezintă un nivel scăzut de
fluorescenţă, dar în momentul în care sunt
încorporaţi la nivelul unei duble catene ADN,
intensitatea fluorescenţei lor creşte de până la
200 de ori.
Din această cauză, cu cât mai mulţi ampliconi
sunt formaţi în urma reacţiei PCR, cu atât mai
mulţi coloranţi vor fi intercalaţi la nivelul
dublelor catene formate şi cu atât intesitatea
89
fluorescenţei va creşte.
 PRINCIPIUL CUANTIFICĂRII ÎN REAL-TIME PCR

- Sonde “Molecular Beacon” – în acest caz

- Sonde TaqManTM – în această
se lucrează cu sonde ADN care formează
variantă, sonda este conjugată cu un
structuri tijă-buclă („stem-loop”),
fluorocrom şi cu un captator de
regiunea buclă („loop”) fiind
fluorescenţă capabil să absoarbă
complementară cu molecula de acid
energia fluorocromului. Atât timp cât
nucleic ţintă. Sondele au ataşate la
sonda este intactă ea nu va emite
capete fluorocromi. Fluorescenţa este
fluorescenţă. Odată începută
dectectabilă numai când sonda se leagă
amplificarea, sonda este hidrolizată,
la ADN.
fluorocromul este separat de captator
- În structura sondei întâlnim patru regiuni şi în consecinţă fluorescenţa va creşte,
distincte: o regiune „loop” putând fi detectată. Pe măsură ce
complementară cu secvenţa ADN ţintă, o reacţia avansează, semnalul
regiune „stem” reprezentată de capetele fluorescent se va intensifica deoarece
complementare sondei, un fluorocrom vor exista în mediul de reacţie din ce
dispus la capătul 5’ care emite doar în ce mai mulţi fluorocromi liberi care
atunci când sonda este hibridizată cu emit semnal luminos . Metoda se
ţinta şi un captator de fluorescenţă bazează pe activitatea 5'-3'
ataşat covalent la capătul 3’ care exonucleazică a ADN polimerazei.
captează fluorescenţa atunci când sonda 90
este liberă.
PRINCIPIUL CUANTIFICĂRII ÎN REAL-TIME PCR

91
PRINCIPIUL CUANTIFICĂRII ÎN REAL-TIME PCR

92
DINAMICA UNEI REACŢII PCR ŞI FAZELE DE
ACUMULARE ALE AMPLICONILOR.

93
VALIDAREA PCR ÎN TIMP REAL - CURBA DE TOPIRE (MELTING
CURVE).

94
STUDIU DE CAZ

95
 PROTOCOLUL RT-PCT
• ADN a fost amplificat cu aparatul RotorGene 6000 (Corbett Research, Sydney,
Australia).
• Reacțiile au fost realizate în tuburi de 100 µl (Corning Axigen, Union City, CA,
• USA).
• Soluția de lucru a fost obținută astfel: 5 µl amestec PCR premixat (QuantiTect SYBR
Green PCR Kit, Qiagen, Hilden, Germany), 0.25 U SubTherm TAQ Polymerase,
25 ng DNA și 1680 nM mix total de primeri (GAS1, LIT2, AME1, BUD2, VAI1,
• VOM3, PIS3), și apă liberă de RN-aze până la volumul de 10 µl.

Hot-start 35 cicluri Extensie finală

95 °C 95 °C 54 °C 65 °C 72 °C

10 min 12 s 12 s 30 min 3 min

• Curba de melting a fost realizată de la 65 la 90 C, cu creșteri de 0.5 grade din 5 în 5 s.

96
• Reacțiile de control au fost realizate în aceleasi conditii, cu exceptia utilizării
primerilor 200 nM COILfor și 200 nM COILrev.
97
 Interpretarea rezultatelor
- analiza curbei de topire -

98