Introducere

Factorul de transcripție Forkhead (FOXO1) joacă un rol important în medierea acțiunii insulinei și în
reglarea expresiei genelor țintă. Unele descoperiri indică faptul că FOXO1 este un regulator negativ al
sensibilității la insulină la nivelul ficatului, adipocitelor și celulelor β pancreatice.

FOXO1 conține situri de fosforilare Akt foarte bine conservate, iar activitatea acesteia este reglată de
fosforilarea mediată de Akt a tezitelor. FOXO1 fosforilat este exclus din nucleu, scăzând astfel activitatea
transcripțională.

FOXO1 stimulează, de asemenea, expresia fosfenolpiruvatului carboxinazaza (PEPCK) și a 6-fosfatazei

glucozei (G6P-ase) prin legarea directă a elementului de răspuns insulinic (IRE) mapat în promotorii
acestor gene. Deci, peste activitatea FOXO1 promovează hiperglicemia diabetică, dislipidemia și
răspunsul în fază acută.

Studii recente au demonstrat că insulina poate suprima activitatea FOXO1 și au fost documentate de noi
și de alții că deficiența de magneziu (Mg2 +) apare în timpul inducerii diabetului, iar deficiența de Mg
crește activitatea enzimelor PEPCK și G6P-ase.

Deci studiul de față a fost proiectat pentru a investiga posibilul rol al Mg2 + în suprimarea enzimei PEPCK
prin inhibarea expresiei genei FOXO1 în ficat. De asemenea, se examinează dacă Mg2 + contribuie la
activarea expresiei genelor GLUT4 și translocarea în mușchi prin inhibarea FOXO1.

2. Materials and methods

2.1. Animals

Animalele au fost împărțite în cinci grupuri (n = 10 șobolani la fiecare grup): control non-diabetic (NDC);
Controlul non-diabetic tratat cu Mg2 + (Mg2 + -NDC); diabetic cronic (CD); Diabetice cronice tratate cu
Mg2 + (Mg2 + -CD); și diabetici cronici tratați cu insulină (Ins-CD).

Streptozotocina (STZ) a fost utilizată pentru inducerea diabetului. Grupele Mg2 + -CD și Mg2 + -NDC au
primit 10 g / l sulfat de magneziu (MgSO4) adăugate la apă potabilă, iar grupul Ins-CD a primit 2,5 U / kg
insulină.

Diabetul a fost indus printr-o singură injecție IP de 60 mg / kg streptozotocină dizolvată în izotonice

normale și același volum de soluție salină normală a fost injectat animalelor din grupul NDC. La 10 zile
după injectarea STZ, nivelul glicemiei în condiții de repaus a fost determinat și prezența diabetului a fost
confirmată de niveluri de glucoză din sânge de peste 250 mg / dl. Animalele la care diabetul a durat 16
săptămâni au fost definite drept diabetice cronice. La zece zile de la inducerea diabetului, grupele Mg2 +
-CD și Mg2 + -NDC au primit 10 g / l de MgSO4 adăugate în apa de băut timp de 16 săptămâni. A fost
măsurat consumul de apă. Grupurile de control non-diabetice tratate cu Mg2 + și Mg2 + tratate non-
diabetice par să aibă un consum de apă semnificativ mai mic în comparație cu grupul diabetic cronic (42
± 2, 40 ± 2 și 203 ± 3,1 ml / 24 h pentru diabetul cronic tratat cu Mg2 +, Mg2 + - tratat non-diabetic,
respectiv diabetic cronic). Deci doza exactă de MgSO4 pe care șobolanii au consumat-o a fost de 0,42 g /
24 h.

Grupul Ins-CD a primit 2,5 U / kg de insulină (1/3 regulat și 2/3 NPH, de la Aksir Company Iran) timp de
16 săptămâni pentru a menține glicemia în jurul valorii de 100 ± 2 mg / dl [13]. Animalele au fost
monitorizate pentru concentrațiile de glucoză din sânge și greutatea corporală în fiecare săptămână la 9
dimineața, pe parcursul experimentului. Glicemia a fost măsurată cu ajutorul unui glucometru Ascensia
ELITE XL și a benzilor de testare a glicemiei Ascensia Elite, iar greutatea corporală a tuturor
experimentelor a fost înregistrată folosind o scală de cântărire digitală.

2.2. Test de toleranță intraperitoneală la glucoză (IPGTT)

Pentru IPGTT, animalele din toate grupurile au fost supuse la 15 ore de fixare peste noapte și li s-a
administrat 1,5 g de glucoză pe kilogram de greutate corporală prin injecție IP. Sângele a fost extras din
venă coadă la 0, 10, 20, 30, 60, 90 și 120 min după administrarea de glucoză.

2.3. Test biochimic

Animalele au fost anesteziate cu ketamina HCl, apoi animalele au fost decapitate.

Ficatul și mușchiul au fost izolate pentru gena FOXO1 și expresia proteinei prin PCR în timp real și,
respectiv, metode de imunohistochimie.

2.4. Extracția ARN

Pe scurt, ARN a fost tratat cu 1 ull DNază-I în 37 ° C timp de 30 min și apoi s-a adăugat 1 µl 50mM EDTA.
Apoi a fost incubat la 65 ° C timp de 10 min pentru inactivarea DNazei. ARN extras a fost cuantificat
utilizând electroforeză cu gel de agaroză 1,5%.

2.5. sinteza de ADNc și PCR cantitativă în timp real

Toate reacțiile au fost efectuate într-un volum terminal de 20 μl conținând 1 µL de probă de ADNc, 1 µl
de primer, 10 µL SYBR Green, 0/4 μL ROX și 7/6 μL de apă dublă distilată pentru toată β-actina, FOXO1
sau PEPCK. Starea de ciclism termic pentru β-actină a fost  o denaturare inițială la 95 ° C timp de 3
minute, urmată de 40 de cicluri de denaturare la 95 ° C timp de 10 sec, ungere la 68 ° C pentru fiecare
grund timp de 30 sec. Pentru FOXO1: starea ciclului termic a fost o denaturare inițială la 95 ° C timp de 3
minute, urmată de 40 ciclu de denaturare la 95 ° C timp de 10 secunde, recoacere la 62 ° C pentru
fiecare grund timp de 30 sec. De asemenea, pentru PEPCK, starea ciclului termic a fost o denaturare
inițială la 95 ° C timp de 3 minute, urmată de 40 de cicluri de denaturare la 95 ° C timp de 10 secunde și
recoacere la 65 ° C pentru fiecare grund timp de 30 sec. Toate standardele și măsurătorile probelor au
fost repetate de două ori.

Nivelurile de expresie ale FOXO1 și PEPCK au fost normalizate prin expresia β-actină ca genă menajeră și
calculate prin metoda 2-CT. A fost utilizată secvența seturilor de grunduri specifice pentru fiecare genă,
dimensiunile ampliconului și temperatura de recoacere a primerilor timp de PCR în timp real (tabelul 1).

2.6. imunohistochimie

Au fost tăiate cinci secțiuni de micrometri ale țesutului încorporat în parafină fixată în formalină și
preparate pentru colorarea IHC. Procesat prin xilen și o serie alcoolică gradată și tratată cu peroxid de
hidrogen 3% pentru a elimina activitatea peroxidazei endogene înainte de colorarea imună și blocată cu
5% ser normal de capră.

Grafice
2.7. analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± S.E.M. Diferențele între grupuri au fost evaluate prin ANOVA
unidirecțional și bidirecțional cu testul post-hoc Tukey.

3. Rezultate

Înainte de intervenție, nu au existat diferențe în ceea ce privește glicemia, IPGTT, greutatea corporală și
nivelul Mg plasmatic între animalele din fiecare grup.

3.1. Modificări ale glicemiei

Inducerea diabetului a determinat creșterea concentrației de glucoză din sânge și glicemia a continuat să
fie crescută la 16 săptămâni după inducerea diabetului. Administrarea de MgSO4 sau insulină timp de 16
săptămâni (din ziua 10) a provocat scăderea concentrațiilor de glucoză din sânge în grupele Mg-CD și
Ins-CD.

3.2. Efectul MgSO4 asupra testului de toleranță intraperitoneal la glucoză (IPGTT)

Înainte de a începe administrarea MgSO4 și STZ, modelele IPGTT pentru toate grupurile au fost similare.

Cu toate acestea, după 16 săptămâni, grupul CD a prezentat o intoleranță severă la glucoză (Fig. 1B),
care s-a îmbunătățit semnificativ în grupul Mg2 + CD până la un grad care a fost considerat eficient.

3.3. Modificări ale greutății corporale și a nivelului plasmatic al magneziului

Greutatea corporală a animalelor cu CD a scăzut nesemnificativ în comparație cu nivelurile la animalele

cu NDC; creșterea greutății corporale a fost observată în mod semnificativ după administrarea de Mg2 +
și insulină în comparație cu nivelurile la animalele cu CD (Fig. 2A).

Nivelul plasmatic Mg în CD a scăzut semnificativ în comparație cu grupul NDC. Administrarea de Mg2 + și

insulină timp de 16 săptămâni (începând cu ziua 10) a determinat creșterea concentrațiilor plasmatice
de Mg2 + în grupele Mg2 + -CD și Ins-CD, dar există diferențe semnificative între grupurile Mg2 + -CD și
Ins-CD. (Fig. 2B).

3.4. Modificări în expresia genei FOXO1 și PEPCK

Fig. 3A, respectiv C și Fig. 4A. Transcrierea FOXO1 în mușchi a scăzut în comparație cu șobolanii diabetici
cronici (CD) datorită tratamentului cu Mg2 +. Dar administrarea de insulină la șobolani diabetici nu a
putut reduce expresia genei FOXO1 în ficat, în comparație cu grupa CD.

3.5. Modificări ale nivelului de proteine FOXO1 și PEPCK

Fig. (4 B, C, respectiv 3 D și E). Conform descoperirilor noastre, nivelul de proteine FOXO1 în mușchi a
crescut în grupul CD, cu toate acestea acest rezultat nu a fost observat în grupele Mg2 + sau tratate cu
insulină. Nivelul proteic FOXO1 în ficat la grupul tratat cu Mg2 + a scăzut în comparație cu animalele CD,
dar această constatare nu a fost observată în grupul Ins-CD în comparație cu animalele CD și Mg2 + -CD.

Concluzii

Administrarea de MgSO4 a îmbunătățit IPGTT, a scăzut nivelul glicemiei și a scăzut genele FOXO1 și
PEPCK și expresia proteinelor în mușchi și ficat, în timp ce insulina doar ar putea scădea gena FOXO1 și
expresia proteinelor din mușchi. Aceste descoperiri au ilustrat faptul că MgSO4 a îmbunătățit
hiperglicemia prin inhibarea genei FOXO1 și a nivelului de proteine din mușchi și ficat și, de asemenea, a
scăzut nivelul glicemiei prin interzicerea căii gluconeogenezei în ficat. Cu toate acestea, administrarea de
insulină de mult timp nu a avut niciun efect asupra ficatului.

În general, rezultatele acestui studiu au arătat că Mg2 + este mai eficient decât insulina în controlul
glicemiei și în prevenirea căii gluconeogenezei în ficat, în timp ce Mg2 + are atât efecte hepatice cât și
musculare.