Genul Bordetella.

Bordetella pertussis (MI Popa)

57. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Bordetella cuprinde cocobacili Gram-negativi asemănători celor din genul Haemophilus, strict aerobi.
Specia tip este reprezentată de B. pertussis agentul etiologic al tusei convulsive izolată în 1906 de Bordet şi
Gengou; alte exemple sunt reprezentate de Bordetella parapertussis şi Bordetella bronchiseptica. În afară de
aceste trei specii (foarte înrudite din punct de vedere genetic) mai sunt cunoscute încă alte cinci.

57. 2. Caractere generale

57. 2. 1. Habitat
Bordetelele se pot localiza la nivelul cililor epiteliului respirator; nu au capacitatea de a invada. Reprezintă
microorganisme care infectează organismul uman, uneori şi animale cu sânge cald.
57. 2. 2. Caractere morfologice
Bordetella pertussis este un cocobacil Gram-negativ, cu dimensiunea de 0,5 μm / 0,5-2 μm, imobil. Atunci când
este recent izolat prezintă capsulă. În primele ore de cultivare prezintă pili ataşaţi de peretele bacterian. După
24 ore, pilii se pot identifica în mediul de cultură. Prin treceri succesive microorganismul devine polimorf, lipsit
de capsulă şi pili. De regulă celulele bacteriene apar izolate sau în pereche, foarte rar în lanţuri. Dacă se
practică o colorare cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule metacromatice situate bipolar.
57. 2. 3. Caractere de cultură
B. pertussis este unul din germenii care se cultivă şi se izolează dificil. Fiind inhibat de acizi graşi, peroxizi
organici etc, nu se dezvoltă pe mediile uzual folosite în diagnosticul bacteriologic. Necesită pentru cultivare
nicotinamidă sau acid nicotinic şi o temperatură optimă de 35-37ºC. Cel mai cunoscut mediu de cultură este
mediul Bordet-Gengou care conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de
penicilină sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea
microorganismelor. După 3-6 zile de incubare la 37ºC se pot dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uşor
transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de hemoliză (faza I). În lumina
transmisă oblic par ca picăturile de mercur. La izolare este necesar mediul Bordet-Gengou, însă prin treceri
repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau pe geloză simplă. Microorganismul se va multiplica
mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale,
virulenţa fiind scăzută.
Incubarea se realizează 3-7 zile la 35-37ºC în atmosferă umedă. Ar fi de menţionat că în această etapă de
izolare diagnosticul poate fi urgentat, realizându-se identificarea microorganismului prin imunofluorescenţă.
Aspecte genetice
Referitor la modificările antigenice care apar în cursul cultivării, s-a descris la Bordetella pertussis variaţia de
fază.
Faza I se întâlneşte la tulpinile izolate din produse patologice cultivate pe medii îmbogăţite. Sunt tulpini în
formă de S, virulente, capsulate cu mare capacitate imunogenă. Vaccinurile se prepară folosind culturi în faza I.
Fazele II şi III sunt intermediare.
Faza IV se întâlneşte la tulpini care se pot multiplica pe medii obişnuite. Au aspectul caracteristic formelor R.
Sunt degradate antigenic, nu produc toxină şi nu prezintă nici alţi factori de patogenitate.
57. 2. 4. Caractere biochimice
Sunt germeni strict aerobi, cu temperatură optimă de dezvoltare 35-37ºC, nu necesită prezenţa factorilor X sau
V, metabolizează oxidativ o serie de aminoacizi (ex. acidul glutamic) etc. Tulpinile virulente produc hemoliză.
57. 2. 5. Acţiunea factorilor fizici, chimici
În afara organismului Bordetella pertussis are o rezistenţă scăzută. Rezistă maximum 2 ore la temperatura
camerei. Lumina solară o distruge în 60 de minute, iar la 55ºC este distrusă în 30 de minute.
57. 2. 6. Structură antigenică
Structura antigenică este foarte complexă, bacteria prezentând spre exemplu:
- 1 hemaglutinină fimbrială (de natură proteică, cu structură filamentoasă, FHA);
- aglutinogene de suprafaţă (K), de natură proteică. Există aglutinogene specifice de gen şi de specie. Datorită
implicaţiilor epidemiologice, ar fi de menţionat că microorganismul are capacitatea de a-şi modifica serotipul in
vitro;
- la nivelul peretelui celular există lipopolizaharidul (endotoxina), antigen comun germenilor Gram-negativi.
În afară de aceste antigene mai există şi o serie de substanţe active cu rol important în patogenia bolii şi care
ar putea fi grupate astfel:
- toxina pertussis (TP), factor major de virulenţă, dar şi cel mai important antigen şi imunogen. Este o exotoxină
formată din 2 subunităţi (A şi B);
- adenilatciclaza;
- toxina letală (dermonecrotică);
- citotoxina traheală.
57. 2. 7. Răspuns imun
După infecţie apar titruri înalte de anticorpi anti-TP şi anti-FHA. Titrul anticorpilor anti-TP persistă timp
îndelungat (posibil pe tot parcursul vieţii), fiind corelaţi cu imunitatea faţă de o nouă îmbolnăvire.
57. 2 .8. Caractere de patogenitate
B. pertussis este patogenă în special prin localizare, multiplicare şi toxinogeneză.
În realizarea adeziunii la epiteliul ciliat respirator, un rol important îl au:
- fimbriile;
- aglutinogenele;
- hemaglutinina filamentoasă (FHA);
- pertactinele (PRNs);
- toxina pertussis.
Bacteria se multiplică rapid, interferă cu activitatea muco-ciliară normală, produce toxine care determină
apariţia manifestărilor clinice (toxinele au fost menţionate anterior).
Endotoxina (LOZ) are, probabil, un rol în patogenitate.

57. 3. Patogenie. Principalele afecţiuni produse

Bordetella pertussis este patogenă numai pentru om. Transmiterea se realizează în special pe cale aeriană
(picături Pflügge) într-un acces de tuse. Contagiozitatea este maximă în primul stadiu de boală şi la începutul
stadiului al doilea (de tuse paroxistică).
Microorganismul aderă, se multiplică rapid, interferă cu activitatea mucociliară normală, apar primele
manifestări clinice care se agravează treptat.
Substanţele toxice elaborate (şi în special TP) au următoarele acţiuni:
- după legarea subunităţii B (a TP) pe suprafaţa celulelor gazdei, are loc penetrarea subunităţii A. Subunitatea A
se leagă de proteina Gi de la nivelul membranei celulare, o inhibă şi rezultă o stimulare a adenilatciclazei şi
respectiv o creştere a sintezei de AMPc. Dintre efectele negative care se datorează sintezei de TP putem
enumera hipoglicemia, sensibilizarea la histamină, reducerea activităţii macrofagelor, diminuarea răspunsului
imun umoral (sinteza de anticorpi);
- adenilatciclaza pertussis diminuă activitatea fagocitară a macrofagelor şi leucocitelor;
- toxina letală produce necroze locale;
- citotoxina traheală produce ciliostază şi distrugerea celulelor respiratorii ciliate (favorizând, probabil,
acumularea de mucus, tusea şi apariţia infecţiilor secundare).
Boala la om se numeşte tuse convulsivă („tuse măgărească”).
După o incubaţie de 7-10 zile, încep manifestările clinice care evoluează în două faze.
În prima fază (catarală), care durează aproximativ 10 zile, microorganismul colonizează căile respiratorii
superioare, determinând manifestări necaracteristice, asemănătoare unei infecţii respiratorii obişnuite: tuse,
strănut, temperatură. În această etapă, pacientul este foarte contagios, elimină prin tuse un număr foarte
mare de microorganisme. Diagnosticul de laborator bacteriologic este posibil prin prelevări cu tampon steril de
la nivelul faringelui sau prin metoda „plăcilor tuşite”. Gravitatea şi durata bolii pot fi reduse dacă se face
tratament antimicrobian corect. În caz contrar simptomele se agravează treptat.
Faza a doua (paroxistică) este stadiul toxemic, cu accese de tuse paroxistică, accese adeseori tipice, cu
sonoritatea caracteristică. În acces, după o inspiraţie prelungită, forţată, urmează 5-10 secuse expiratorii
spasmodice, datorită contracţiei musculaturii bronşice şi glotice (de unde şi denumirea de „tuse măgărească”
dată bolii în ţara noastră sau de „cocqueleuche” în limba franceză). Adesea accesul se termină cu vomă şi cu
aspirarea vomismentelor. Pot apărea cianoză, convulsii, anxietate.
La o parte dintre pacienţi nu apar accese paroxistice tipice. La cei la care apar, pot fi până la 30 accese pe zi,
mai frecvente în timpul nopţii. Pe parcursul stadiului toxemic apare şi limfocitoza periferică caracteristică,
precum şi hipoglicemia.
Datorită obstrucţiei bronhiolelor mici cu dopuri de secreţii mucoase, precum şi datorită tusei şi inspirului
amplu, pot apărea o serie de complicaţii pulmonare. Problema eliminării secreţiilor este mai importantă la
copii deoarece stagnarea secreţiilor contribuie la instalarea hipoxiei şi dificultăţilor de nutriţie. Uneori apar
complicaţii şi la nivelul sistemului nervos central, care pot fi foarte grave (encefalita pertussis).
Faza a doua durează 2-4 săptămâni şi este urmată de convalescenţă, care durează 2-3 săptămâni.

57. 4. Diagnosticul de laborator

Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic sau imunologic.
57. 4. 1. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Bordetella pertussis este bacteriologic, direct.
Diagnosticul etiologic este foarte util în primul stadiu al tusei convulsive (pacientul este foarte contagios
iar evoluţia bolii poate fi influenţată pozitiv prin administrarea de antibiotice). Diagnosticul bacteriologic poate
fi realizat în timpul fazei catarale şi în prima parte a fazei paroxistice (foarte rar se mai pot obţine rezultate, la
mai mult de 4 săptămâni de la debut, în special pentru că, se administrează antibiotice şi chimioterapice).
Detectarea adenilat ciclazei (prin activitatea enzimatică) şi a toxinei pertussis (prin efectul citotoxic sau
imunoteste), în produsul patologic, eventual după îmbogăţire, sunt promiţătoare, dar nu au intrat în practică.
O valoare a numărului de leucocite de 16-50.000 / dL sânge, cu limfocitoză absolută, vine în sprijinul
diagnosticului de tuse convulsivă.
 Identificarea B. pertussis la persoanele asimptomatice (sau cu simptome nespecifice) şi respectiv la contacţi ar
permite aplicarea unor măsuri preventive.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai
aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse
de Bordetella pertussis se pot recolta secreţii de la nivelul tractului respirator superior (nazal, faringian). Vom
realiza recoltarea cu ajutorul tamponului din alginat de calciu care se lasă pe loc 30-60 de secunde pentru a
favoriza adsorbţia B. pertussis (bumbacul inhibă dezvoltarea microorganismelor) sau prin aspirarea secreţiilor
traheobronşice. Este descrisă (istoric) şi metoda „plăcilor tuşite” (se expune o placă Petri cu mediul Bordet-
Gengou la care s-a adăugat antibiotic, deschisă, la aproximativ în faţa gurii bolnavului în timpul accesului de
tuse).
Este recomandată prelucrarea imediat a p.p., dacă este posibil la patul bolnavului (microorganismul este
foarte puţin rezistent în mediul extern). Nu există o metodă perfectă pentru recoltarea p.p. atunci când se
suspicionează o infecţie cu B. pertussis (toate metodele au diferite limite atât din punctul de vedere al
sensibilităţii sau specificităţii cât şi din punct de vedere practic).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Examinăm frotiurile la microscopul
optic cu imersie şi notăm prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-
negativi, dispuşi separat sau în perechi, rareori în lanţuri scurte. Datorită faptului că aceste microorganisme se
colorează relativ slab în coloraţia ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă
(imunofluorescenţă directă) sau recolorarea prelungită cu fucsină sau safranină.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii
izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Bordetella pertussis este un
microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite; este inhibat de acizi
graşi, peroxizi organici etc. Izolarea B. pertussis în culturi este dificilă, dar eforturile sunt necesare pentru a
putea fi evaluată variaţia genetică (de fază) şi respectiv pentru a putea supraveghea fenomenul apariţiei
rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice.
Bordetella pertussis necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o temperatură optimă de 35-
37˚C, cu incubare timp de 3-7 zile, în aerobioză şi atmosferă umedă. Cel mai cunoscut mediu de cultură este
mediul Bordet-Gengou care conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de
penicilină / meticilină sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit
dezvoltarea microorganismelor. Dezavantajul principal al mediului clasic Bordet-Gengou este reprezentat de
timpul scurt în care poate fi utilizat (1-7 zile).
Actualmente se recomandă utilizarea unui mediu folosit iniţial ca mediu de transport, care include geloză
nutritivă, cărbune activat şi este suplimentat cu 10% sânge de cal. Acest mediu poate fi utilizat pe parcursul a
1-2 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid.
În vederea izolării primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu cărbune activat, însă prin treceri
repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau chiar şi pe geloză simplă. Microorganismul se va
multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări
structurale, virulenţa fiind scăzută.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale:
Sunt cocobacili Gram-negativi, mici, cu dimensiunea de 0,2-0,5 μm / 0,5-2 μm, imobili, dispuşi separat sau în
perechi, rareori în lanţuri scurte, cu tendinţa de a deveni pleomorfi în urma subcultivărilor (pot apărea şi forme
filamentoase).
Utilizând coloraţii speciale, în coloniile rezultate din primoculturi se pot evidenţia structurile capsulare. Dacă
frotiul se colorează cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule metacromatice situate bipolar.
Imunofluorescenţa directă este utilă şi pentru identificarea microorganismului după cultivare.
Caractere de cultură:
Produc colonii de tip S sau M. După 3-7 zile de incubare la 37˚C pe mediul Bordet-Gengou se pot dezvolta
colonii de tip S mici, convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un
halou de hemoliză (faza I).
În lumina transmisă oblic coloniile seamănă cu picăturile de mercur. Pe mediul cu cărbune activat coloniile
apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre, cu suprafaţa perlată.
Caractere biochimice:
Bordetella pertussis este hemolitică, oxidază-pozitivă, urează-negativă.
Se pot utiliza truse comerciale manuale care identifică specii de bacili Gram-negativi (BGN) (ex. API 20 E, API
20 NE), fiind de regulă necesare şi teste adiţionale de identificare.
Caractere antigenice:
Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Bordetella pertussis, prin reacţia de
aglutinare pe lamă.
Alte teste de identificare utilizate în laboratoare de referinţă:
Se poate utiliza amplificarea genetică folosind diferite amorse (primeri); tehnica PCR are o bună specificitate şi
sensibilitate dezavantajul principal fiind reprezentat de costul ridicat.
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii
tratamentului) poate fi necesară în scopul supravegherii apariţiei fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi se
realizează prin metode difuzimetrice.
57. 4. 2. Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic este de mică importanţă pentru pacientul cu tuse convulsivă, deoarece o creştere
semnificativă a anticorpilor aglutinanţi sau precipitanţi se realizează abia din a doua sau a treia săptămână de
boală. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC, reacţiile de aglutinare, hemaglutinare şi
hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip ELISA. Diagnosticul serologic poate fi realizat în cadrul unor studii
epidemiologice, în scop de cercetare; ar putea fi, eventual, util în diagnosticul diferenţial (retrospectiv).

57. 5. Tratament
Administrarea eritromicinei în faza catarală duce la blocarea multiplicării microorganismului, reduce gravitatea
simptomelor şi are valoare profilactică diminuând perioada în care pacientul este contagios. Se mai pot
administra rifampicină, tetraciclină, cloramfenicol, gentamicină dar nu ampicilină.
Tratamentul cu antibiotice, instituit după debutul fazei paroxistice, rareori mai poate influenţa cursul boli. În
general are drept mic beneficiu limitarea contagiozităţii pacientului respectiv.
Deosebit de important sunt tratamentul simptomatic, oxigenoterapia şi respiraţia asistată, hidratarea,
eliminarea secreţiilor, măsurile generale nespecifice, în special la nou-născuţi şi copii mici la care tusea
convulsivă rămâne o importantă problemă medicală. Eficiente sunt şi administrarea de sedative şi aspirarea
secreţiilor.

57. 6. Epidemiologie
Boala este endemică în zonele dens populate din orice parte a lumii şi adesea pot apare epidemii, în cicluri la 3-
5 ani, prin acumularea indivizilor susceptibili în populaţie.
Sursa cea mai frecventă este reprezentată de pacientul în faza catarală, infecţia răspândindu-se de obicei pe
cale aeriană. Contagiozitatea este foarte mare, 30-90% din contacţi receptivi putând face boala. Multe cazuri
apar înaintea vârstei de 5 ani, însă majoritatea cazurilor grave apar înaintea vârstei de un an. Odată cu
limitarea numărului de cazuri la copiii mici, este evident că adulţii cu boală atipică, nediagnosticată, reprezintă
populaţia cu rol major în transmitere. Boala este mai puţin periculoasă la adulţi, dar la copii rata mortalităţii
este destul de mare. Frecvenţa bolii a scăzut mult după 1930, odată cu introducerea vaccinării; totuşi evoluţia
numărului de îmbolnăviri în diferite ţări în care programele de imunizări sunt, în general, eficiente, pun
întrebări cu privire la eficacitatea vaccinului pertussis şi solicită găsirea unor soluţii.
În România, cazurile de tuse convulsivă raportate în anul 1997 au fost în număr de 263, incidenţa bolii
ajungând la valoarea de 1,20/0000. Pentru anul 1998, incidenţa bolii a scăzut la 0,4 0/0000, numărul de cazuri
înregistrate fiind de 97, la fel ca şi în 1999. Cel mai mare număr de cazuri în ultimii 10 ani a fost înregistrat în
anul 2000 (493 cazuri, incidenţă 2,20/0000). În perioada 2001-2006 au fost înregistrate anual între 37 (2006) şi
233 (2004) cazuri, evoluţia fiind imprevizibilă şi fără o legătură / influenţă epidemiologică demonstrată (sau
studiată).
Cu toate că vaccinarea DTP se realizează pe scară naţională în SUA, în 1997 au fost raportate 6.564 cazuri de
tuse convulsivă (incidenţă 2,460/0000), iar în 1999, 7.288 de cazuri, corespunzând la o incidenţă de 2,67 0/0000. În
anul 2001 incidenţa tusei convulsive a fost de 2,69 0/0000, cu 7.580 cazuri raportate. În perioada 2002-2004
numărul de cazuri şi respectiv incidenţa au înregistrat valori în continuă creştere, valoarea maximă fiind
raportată în 2004 (25.827 cazuri de tuse convulsivă). În anul 2005 au fost înregistrate 25.616 cazuri, incidenţa
fiind de 8,720/0000. Această evoluţie ridică semne de întrebare cu privire la raportarea cazurilor în ţara noastră şi
certifică necesitatea întăririi sistemului de supraveghere, inclusiv prin metode de laborator.

57. 7. Prevenire. Control

Vaccinul este o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza I, distruşi fie cu formol, mertiolat de sodiu
etc, fie prin căldură, fie prin acţiunea combinată a agentului fizic şi chimic. Vaccinul pertussis se administrează
în mod curent combinat cu anatoxina difterică şi tetanică sub forma trivaccinului diftero-tetano-pertussis
(DTP).
Dezavantajul acestui vaccin este faptul că, pe lângă componentele care duc la protecţie, conţine şi anumite
componente care induc la reacţii adverse, uneori necontrolabile. Însă, punându-se în balanţă beneficiile
vaccinării şi respectiv dezavantajele datorită reacţiilor adverse (care apar relativ rar), este unanim recunoscută
utilitatea vaccinării. Reacţiile adverse sunt de obicei reprezentate de reacţii locale şi febră, probabil datorită
conţinutului în lipopolizaharide.
Primovaccinarea se începe la 2 luni, administrându-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru
menţinerea imunităţii se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se
practică la 36 de luni de viaţă a copilului respectiv.
Datorită reacţiilor adverse mai sus menţionate se recomandă eliminarea componentei pertussis la nou-născuţii
cu probleme ale sistemului nervos, la cei predispuşi la boală şi la cei care au avut o reacţie adversă
semnificativă la o administrare anterioară a DTP-ului. Se studiază posibilitatea utilizării pe scară largă a unui
vaccin acelular în care să fie inclusă toxina pertussis inactivată, evitându-se astfel reacţiile adverse (vaccinul
acelular este deja recomandat în cadrul programului de imunizare din SUA, Japonia şi o bună parte din ţările
din UE). Componenta principală a vaccinului acelular este reprezentată de anatoxina pertussis inactivată
genetic (modificarea a 2 aminoacizi). Cu toate acestea, în ultimii ani există o serie de discuţii privind
eficacitatea acestui vaccin. Ceea ce este cert este că există o recrudescenţă a tusei convulsive în ţări în care
acoperirea vaccinală este mare (USA, Australia, Canada, Olanda etc).
Imunizarea activă a adulţilor ar putea fi eficace în stăpânirea unei epidemii izbucnite într-o colectivitate (ex.
personalul unui spital). Utilizarea eritromicinei administrate imediat după contactul cu un bolnav are valoare
profilactică. Se recomandă şi în cazul copiilor vaccinaţi, cu vârsta mai mică de 4 ani, deoarece vaccinarea nu are
o eficacitate de 100%.