Genul Brucella (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

58. 1. Definiţie. Încadrare

Genul Brucella cuprinde mai multe specii care infectează animalele şi se pot transmite omului de ex. Brucella
melitensis (capre, oi; 3 serogrupuri), Brucella abortus (vaci; 9 serogrupuri), Brucella suis (porci; 5
serogrupuri), Brucella canis (câini), Brucella ovis (oi), Brucella neotomae (şobolan) şi Brucella maris (mamifere
marine).
Sunt cocobacili Gram-negativi, imobili, eventual prezentând capsulă, nesporulaţi, care parazitează în special
animalele, caracteristic localizaţi intracelular, relativ inactivi metabolic. Primele trei sunt principalele specii
implicate şi în patologia umană.
Primul microorganism al genului a fost izolat în 1887 de Bruce, din piese recoltate anatomopatologic (splină de
la patru soldaţi decedaţi în insula Malta) şi a fost numit Micrococcus melitensis. Denumirile istorice ale bolii
sunt: febra ondulantă, febră de Malta, febră mediteraneană etc (o boală în care febra avea un caracter
„ondulant”, a fost descrisă ca fiind prezentă în zona litoralului Mării Mediterane, încă de pe vremea lui
Hipocrate). Zece ani mai târziu, Wright pune la punct reacţia de aglutinare pentru evidenţierea anticorpilor
anti-M. melitensis. În onoarea şi amintirea lui Sir David Bruce, în anul 1920 se stabileşte încadrarea în
genul Brucella atât pentru germenul descoperit în 1887 cât şi pentru o a doua specie, care producea avort la
capre (descrisă de Alice Evans).

58. 2. Caractere generale

58. 2. 1. Habitat
Habitatul principal al brucelelor este reprezentat de organismul infectat (în sistemul reticuloendotelial, la nivel
genital), dar germenii pot supravieţui şi în mediul înconjurător. Animalele menţionate mai sus reprezintă
gazdele cele mai frecvente, dar infecţia se poate întâlni şi la alte animale. Există o serie de mecanisme care le
asigură persistenţa, dintre care se poate aminti posibilitatea transformării în condiţii nefavorabile în forme L
(„persister”).
58. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
În culturi proaspete, brucelele sunt cocobacili Gram-negativi, imobili (se poate observa o capsulă fină utilizând
tehnici speciale de colorare), nesporulaţi, izolaţi sau mai rar prezenţi în grămezi neregulate. În produsul
patologic sunt găsiţi în special intracelular. În culturi mai vechi prezintă un important grad de polimorfism.
58. 2. 3. Caractere de cultură
Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare, la prima izolare, medii îmbogăţite
cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, factori de creştere etc). Dacă
produsul patologic este potenţial contaminat, se recomandă utilizarea mediilor selective (cu bacitracină,
cicloheximidă, acid nalidixic, nistatină, polimixină B şi vancomicină).
Microorganismele sunt aerobe, facultativ anaerobe. Dintre cele patru specii considerate importante şi pentru
om, numai Brucella abortus necesită la prima izolare o atmosferă cu 5-10% CO 2.
Creşterea este lentă, mai ales la prima cultivare, iar coloniile (de tip S) devin vizibile după 2 sau mai multe zile.
Plăcile cultivate se vor menţine la incubator un timp suficient de lung (uneori câteva săptămâni). Pentru
hemoculturi este utilizat în mod curent mediul bifazic Castaneda (hemocultura trebuie supravegheată
minimum 3-4 săptămâni). Mediul lichid este tulburat uniform (dar pot apărea depozite sau o peliculă la
suprafaţă).
Tulpinile de Brucella spp. au fost implicate de multe ori în „accidente de laborator”, motiv pentru care
manipularea produselor şi culturilor trebuie să se realizeze cu precauţie.
58. 2. 4. Caractere biochimice
Activitatea metabolică este scăzută. Utilizează carbohidraţi, dar nu produc hidrogen sau gaz în cantităţi
suficiente pentru o eventuală utilitate în clasificare. Toate brucelele produc catalază şi descompun în mod
variabil ureea. Se pot folosi o serie de aminoacizi (ex. L-alanina, L-asparagina) şi o serie de carbohidraţi (ex. L-
arabinoza, D-galactoza) pentru evaluarea metabolismului oxidativ al tulpinilor de Brucella spp.
58. 2. 5. Rezistenţa faţă de factorii fizici şi chimici
Brucelele sunt destul de rezistente în mediu, mai ales dacă sunt înconjurate de un strat protector (în ţesuturile
fetale infectate eliminate pot rezista săptămâni de zile; B. melitensis poate rezista 6 zile în urină, 5-6 săptămâni
în praf şi 9-10 săptămâni în apă sau sol). Sunt moderat sensibile la temperatură şi aciditate. Pasteurizarea
laptelui le distruge. Sunt sensibile la majoritatea substanţelor dezinfectante, respectând protocolul de lucru
(concentraţie, timp de expunere etc. stabilit).
58. 2. 6. Structură antigenică
Brucella spp. are o structură antigenică relativ complexă.
Antiserurile de la animale imunizate cu o tulpină de tip S aglutinează cu cele patru specii principale. Au fost
propuşi doi determinanţi antigenici diferiţi, A şi M (polizaharide de suprafaţă). Aceştia sunt prezenţi în
proporţii diferite la speciile studiate. Antigenul abortus (A) este determinantul major de suprafaţă la Brucella
abortus şi Brucella suis şi determinant minor (a) la Brucella melitensis. Antigenul M predomină la Brucella
melitensis şi este determinant minor (m) la celelalte două specii.
A fost descoperit un antigen de suprafaţă L asemănător cu antigenul Vi de la Salmonella.
Tulpinile capsulate prezintă un antigen de tip K.
La nivel parietal există lipopolizaharidul (Ag O, endotoxina), care diferă de Ag O al altor germeni Gram-negativ
prin compoziţia în acizi graşi şi faptul că este strâns legat de proteine, formând împreună un complex, ceea ce
îi determină o activitate biologică distinctă.
58. 2. 7. Răspuns imun
Bruceloza acută, la fel ca şi administrarea de vaccinuri cu tulpini vii atenuate, determină atât un răspuns imun
umoral cât şi un răspuns imun celular.
În principiu, o dată cu apariţia semnelor şi simptomelor se pot detecta anticorpi, dar prezenţa lor nu previne
bacteriemia şi nici reinfecţia (care este relativ frecventă).
Imunitatea celulară are un rol critic în rezistenţa faţă de o nouă îmbolnăvire. Răspunsul imun celular este în
mod cert necesar pentru eradicarea brucelelor situate intracelular.
58. 2. 8. Caractere de patogenitate
Caracterele de patogenitate se manifestă prin capacitatea germenilor de a se multiplica şi de a invada
organismul. Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau pentru om, capabile să
determine infecţii acute, cronice dar şi infecţii inaparente. Dintre animalele de laborator, cobaiul pare să fie
animalul cel mai constant sensibil. Cronicizarea depinde de capacitatea de multiplicare în celule fagocitare.
Cele mai patogene specii sunt Brucella melitensis, urmată de Brucella suis şi de Brucella abortus.
Nu s-au detectat exotoxine; nu s-au pus în evidenţă constituenţi antifagocitari capsulari sau ai peretelui celular.
Brucelele prezintă, însă, un grad de rezistenţă faţă de distrugerea de către PMM explicabilă prin faptul că nu
are loc stimularea metabolismului oxidativ şi este inhibată degranularea neutrofilelor, precum şi descărcarea
enzimelor din granulaţii. Supravieţuirea intracelulară pare să fie favorizată de existenţa: Cu-Zn superoxid-
dismutazei, unor proteine de şoc termic (de „tip” Gro EL, HtrA etc).
Pare să existe şi un factor de patogenitate neprecizat, produs numai in vivo, care ajută supravieţuirea
intracelulară (de ex. tulpini de Brucella abortus virulente provenite din culturi de monocite sau din placentă
bovină infectată supravieţuiesc mai bine decât aceleaşi tulpini cultivate pe medii artificiale).
Endotoxina (antigenul O, LPZ) este implicată în patogenitate.

58. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni

produse
Incubaţia este în medie de 2-3 săptămâni, însă uneori pot trece câteva luni între momentul infectării şi apariţia
fenomenelor clinice.
Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziţie, cefalee, artralgii, febră moderată,
transpiraţii abundente.
În perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de greu de recunoscut
clinic. Febra „ondulantă” (care creşte în cursul după amiezii şi scade în timpul nopţii) însoţită de frisoane are
mai mult o valoare istorică. În realitate, curba febrilă are un aspect variabil (poate fi ondulantă, neregulată,
renitentă şi intermitentă). Transpiraţiile abundente nocturne, cu un miros caracteristic, astenia, durerile sub
diverse forme reprezintă alte elemente care pot fi comune în cursul bolii.
S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare în bruceloză.
Durata bolii poate fi de 3-4 săptămâni, dar cel mai frecvent depăşeşte 3 luni, ajungând în formele cronice la ani
de zile. În formele cronice diagnosticul se stabileşte foarte dificil.
Formele cele mai grave apar ca urmare a infecţiei cu Brucella melitensis, urmată de infecţia cu Brucella
suis, Brucella abortus şi respectiv Brucella canis.

58. 4. Diagnostic de laborator

În principiu, în realizarea diagnosticului se porneşte de la aspecte clinice şi epidemiologice, însă diagnosticul de
laborator este esenţial, reprezentând unica metodă certă („golden standard”) de diagnostic.
Diagnosticul de laborator în bruceloză poate fi bacteriologic (direct) sau imunologic.
58. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic include următoarele etape.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (vezi
anexa nr. 2), în special cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea antibioterapiei. Produsul
patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge, dar s-ar putea recolta şi prin puncţie ganglionară, puncţie
medulară (rata de izolare creşte), puncţie hepatică sau splenică, sau ar putea fi reprezentat de LCR, urină, bilă,
lapte, materiale necroptice etc., în funcţie de simptomatologie şi stadiul bolii. În continuare vom discuta
situaţia în care se realizează o hemocultură prin metode clasice sau în sisteme de cultivare rapide, de tipul
BactAlert, Bactec sau Septi-Chek (vezi şi anexa nr. 6 / A.6.8.).
Tehnica PCR, utilizând un fragment de 223 perechi de baze, ar putea fi utilizată atât în bruceloza acută, cât şi în
bruceloza cronică. Este de luat în considerare la pacienţii care au primit, deja, antibiotice sau chimioterapice.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu aduce de regulă informaţii utile diagnosticului, în special
dacă este vorba de sânge. Se poate folosi tehnica imunofluorescentă care uneori duce la rezultate pozitive.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii
izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Toate speciile au cerinţe nutritive
complexe necesitând pentru dezvoltare medii îmbogăţite cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice,
glucoză, săruri, vitamine, ser, sânge etc). Se recomandă efectuarea hemoculturilor în mediul bifazic (solid-
lichid), ex. tip Castaneda. Cultura se incubează în atmosferă de 5-10% CO 2, la 37ºC pentru o perioadă de minim
2-3 zile; culturile negative trebuie urmărite până la 4 săptămâni. În cazul mediului bifazic, vom însămânţa
panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fără a deschide flaconul.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativicu dimensiuni de 0,5-0,6 mm/ 0,6-1,5 mm, dispuşi
izolat sau în perechi, lanţuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi necesară o prelungire a timpului de
recolorare cu fucsină, altfel sunt palid coloraţi.
Caractere de cultură:
Pe mediile îmbogăţite corespunzătoare nutritiv, pot produce după 2-3 zile colonii de tip S, cu un diametru de
circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se măreşte astfel încât la 1 săptămână de incubare diametrul poate fi de 6-
7 mm; pot fi identificate (în special după incubare prelungită) colonii de tip R sau M;
Examinate folosind o sursă de lumină la 45º, coloniile apar transparente, galben-deschis, asemănător
„picăturilor de miere” în timp ce în lumina reflectată prezintă o transparenţă cenuşiu-albăstruie.
Caractere biochimice:
Brucella spp. după repicare pe un mediu neselectiv prezintă un metabolism oxidativ;
Microorganismele sunt catalază-pozitive, în timp ce testarea reacţiilor oxidazei, ureazei şi producerii de H 2S pot
da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme clasice de testare, dar este posibilă şi utilizarea galeriilor API (ex.
API 20E);
Testăm necesitatea în CO2, pentru izolare;
Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum şi sensibilitatea la diferiţi coloranţi incluşi de ex. în
medii de cultură (ex. tionină sau fucsină bazică).
Caractere antigenice:
Utilizăm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacţii de aglutinare pe lamă (există reacţii încrucişate); în
cazul unei reacţii pozitive, la nivelul laboratoarelor de referinţă se pot realiza reacţii de aglutinare pe lamă cu
seruri imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R în cazul coloniilor de tip R).
Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice sau în scop de cercetare,
fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; spre exemplu fagul Tbilisi lizează tulpinile de B. abortus, poate liza
la concentraţii crescute tulpinile de B. suis, dar nu lizează tulpinile de B. melitensis, B. canis sau tulpinile în
formă R.
Alte teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă:
-          tehnici ale biologiei moleculare (există sonde nucleotidice specifice pentru diferite biotipuri izolate mai
frecvent, de ex. 1 şi 3 aparţinând B. melitensis; s-a pus la punct şi tehnica PCR, pornind de la cultura
bacteriană).
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice) se realizează prin metoda
difuzimetrică standardizată, şi este utilă atât în scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente la
medicamentele antimicrobiene, cât şi pentru stabilirea tratamentului corespunzător în cazul unei maladii
infecţioase în general dificil de tratat.
58. 4. 2. Diagnosticul serologic
Este de multe ori necesar, ţinând cont de dificultăţile obţinerii diagnosticului bacteriologic pozitiv. Utilizăm
antigene cunoscute şi încercăm să determinăm prezenţa anticorpilor specifici în sângele pacientului, valoarea
titrului anticorpilor şi respectiv evoluţia acestui titru în dinamică. Trebuie să menţionăm că anticorpii de tip
IgM cresc în infecţia acută (în câteva săptămâni) dar persistă şi în infecţia cronică sau chiar şi după tratamentul
antibiotic realizat corespunzător (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar după circa 3 săptămâni de la
debutul brucelozei, ating o valoare maximă la 6-8 săptămâni şi persistă în cazul unei infecţii cronice.
În special din punct de vedere istoric discutăm şi putem practica în cadrul lucrărilor practice, aglutinarea pe
lamă (Huddleson, reacţie calitativă, de screening). Cea mai cunoscută şi utilizată tehnică de diagnostic serologic
este reacţia de aglutinare în tuburi (Wright) prin care putem determina atât titrul anticorpilor de tip IgM cât şi
cel al anticorpilor de tip IgG.
Având în vedere faptul că în bruceloză apar şi anticorpi blocanţi (Ac de tip IgA care blochează activitatea
aglutinantă a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, există dificultăţi şi în ceea ce priveşte interpretarea
rezultatelor obţinute în diagnosticul serologic.
Pentru a simplifica, considerăm că un titru ≥ 1/160 este sugestiv, în timp ce o creştere de 4 ori în dinamică a
titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloză.
Există o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare:
diluarea suplimentară a serurilor de cercetat;
testul de blocare (adăugăm tuburilor în care reacţia Wright este negativă câte 1 picătură de ser imun anti-
Brucella; dacă reacţia rămâne negativă şi nici în acest caz nu apare aglutinarea, concluzionăm că în serul de
cercetat există anticorpi blocanţi);
testul Coombs;
utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM şi IgG care apar faţă de proteinele
membranei externe etc.
Un test Wright negativ nu exclude diagnosticul de bruceloză. Există studii în care s-a demonstrat că există
pacienţi la care reacţia de aglutinare a fost negativă, dar Brucella spp. a fost izolată prin hemocultură.
58. 4. 3. Diagnosticul imunobiologic
Datorită faptului că în infecţia cu Brucella spp. este stimulat în special răspunsul imun mediat celular, diferiţi
autori menţionează utilizarea intradermoreacţiei cu brucelină în investigarea unui caz suspect de bruceloză.
IDR cu brucelină poate identifica existenţa unei stări de hipersensibilitate de tip IV, faţă de antigenul brucelos.

58. 5. Tratament
Brucelele pot fi sensibile la tetraciclină sau ampicilină. Se recomandă utilizarea tetraciclinei în combinaţie cu
gentamicina sau varianta recomandată de OMS (rifampicină + doxiciclină, timp de minim şase săptămâni).
Ameliorarea simptomatologiei se poate produce în câteva zile de la începerea tratamentului. Totuşi, datorită
localizării intracelulare a germenului, tratamentul trebuie să fie prelungit (mai multe săptămâni).

58. 6. Epidemiologie
Sursa de microorganisme din genul Brucella este reprezentată de animalele bolnave. Transmiterea infecţiei la
om se realizează prin ingestia de lapte sau de produse contaminate provenite de la animalele bolnave, prin
contactul cu Brucella la nivelul leziunilor tegumentare, la nivelul conjunctivei sau prin inhalarea
microorganismului.
Bruceloza este în principal o boală profesională, apărând la lucrătorii din sectorul zootehnic, fermieri etc.
În România, în anul 1999 au fost raportate 3 cazuri iar în anul 2000, 5 cazuri de bruceloză (incidenţă 0,02 0/0000).
Numărul de cazuri a fost mic şi în următorii ani (de ex. 2 cazuri în 2005 şi 1 caz în anul 2006).
Incidenţa brucelozei s-a menţinut relativ constantă în ultimii 20 de ani în SUA, cu o uşoară scădere; în 1998 şi
1999 valoarea a fost de 0,030/0000, cu 79 şi respectiv 82 de cazuri notificate. Având în vedere sursa de infecţie,
autorităţile de sănătate publică americane includ în raportul anual şi bruceloza la animale (în 2005, 3 cirezi de
cornute şi 2 cirezi de porci au fost identificate cu bruceloză; 48 de state nu au raportat cazuri de bruceloză la
animale). Numărul de cazuri de bruceloză la om, în 2005, a fost 120 (incidenţă 0,04 0/0000).

58. 7. Profilaxie
Elementul esenţial pentru eliminarea brucelozei umane este eradicarea bolii la animale. Acest lucru s-ar putea
realiza folosind un vaccin viu atenuat, care determină imunitate. Animalele bolnave trebuie sacrificate.
Între metode de prevenire a infecţiei cu Brucella se pot aminti şi pasteurizarea laptelui, evitarea contactului cu
produsele animale contaminate şi aplicarea măsurilor de protecţie a personalului aflat la risc pentru
contractarea bolii.