Facultatea de Inginerie Medicală

Bioinginerie aplicată pentru medicina regenerativă

Disciplina de Patologii tisulare vizate în medicina regenerativă

CURSUL 2. REGENERAREA APARATULUI CARDIOVASCULAR

În anii 1960 s-a afirmat că inima este un organ postmitotic = funcționează pe parcursul
întregii vieți a individului cu același număr de celule prezent la naștere, sau cu un număr din ce
în ce mai mic. Se presupunea că miocitele sunt celule diferențiate terminal, care nu se
înlocuiesc.
Cu alte cuvinte, inima ar fi trebuit să răspundă la pierderea unor celule numai prin
hipertrofia miocitelor restante, ceea ce ar antrena alterarea progresivă a funcției cardiace.
Miocitele hipertrofiate încep să aibă progresiv un deficit de contractilitate din cauza
alterării metabolismului intracelular al ionilor Ca2+ , ceea ce duce în final la incapacitatea de
pompă a inimii, altfel spus insuficiență cardiacă.
În realitate există o pierdere constantă de miocite pe parcursul vieții, care nu duce la
alterarea funcției cardiace.
Concepția actuală este că inima are capacitate de regenerare. Refacerea masei musculare
se poate face prin hipertrofie și prin proliferarea miocitelor.
În viața embriofetală și imediat după naștere, creșterea masei miocardice se face prin
echilibrul dintre apoptoza celulelor inutile și proliferarea miocitelor.
Postnatal creșterea cordului se face prin ambele procese, creșterea numărului și a
volumului miocitelor, până se ajunge la dimensiunea cordului adult.
S-a dovedit în ultimii ani că inima adultului prezintă un turnover surprinzător de intens
al miocitelor, iar în 2003 s-au pus în evidență celulele stem cardiace = CSC (sinonim –
celulele progenitoare cardiace CPC).
CSC au fost individualizate prin markerii de suprafață:
 negative pentru markerii de leucocite, de progenitori endoteliali / hematopoietici și de linii
sanguine (Lin-)
 pozitive pentru markerii comuni ai celulelor stem: c-kit, Sca-1, MDR-1.
Beltrami et al au schimbat paradigma referitoare la existența CSC: au izolat și au
cultivat celule Lin- c-kit+ și le-au demonstrat capacitatea de reînnoire (self-renewal) și
multipotența. Echipa de cercetare nu a reușit însă să determine proveniența endogenă sau non-
endogenă a CSC.

1
 Ulterior s-au pus în evidență mai multe tipuri de celule stem care oferă perspective
pentru regenerarea cardiacă:
 CSC endogene
 CSC non-endogene
 celule stem embrionare (CSE) și pluripotent induse
CSC endogene sunt considerate mai potrivite pentru regenerarea cardiacă, deoarece
sunt deja specializate pentru a se diferenția ulterior pe linia de cardiomiocite și celule înrudite
(celule endoteliale, celule musculare netede ale vaselor coronare, fibroblaști). Au fost izolate
din cordul de om, șoarece, șobolan, câine. Se găsesc în special la nivelul atriilor și la vârful
inimii.
CSC non-endogene pot fi recrutate în cordul lezat, pentru a contribui la reparația
tisulară. CSC non-endogene sunt:
 BMdCSC (bone marrow-derived CSC): studiile au arătat că transdiferențierea BMdCSC în
CSC este puțin eficientă.
 BM-cSP (bone marrow-derived cardiac side population): s-au obținut rezultate încurajatoare
în regenerarea post-infarct miocardic. Se presupune că aceste celule au un potențial
important de utilizare. Nu se cunosc semnalele care recrutează BM-cSP în inimă.
Celulele stem embrionare (CSE) derivă din masa celulară internă a blastocistului.
Această masă celulară interioară se mai numește embrioblast și va da naștere embrionului.
Blastocistul uman se formează la cca 5 zile după fertilizare și cuprinde 200-300 de celule, aflate
într-un proces de diviziune rapidă.

Trofoblast (viitoarea
placentă)

Cavitatea blastocistului
(blastocel)
Embrioblast (viitorul
embrion)

Figura 1. Blastocistul

Avantajul oferit de celulele stem embrionare este acela că celulele din masa celulară
internă proliferează intens, dar își păstrează pluripotența. Din acest motiv CSE umane au un

2
potențial major pentru terapiile prin transplant, dar sunt limitate de probleme de etică medicală
(utilizarea embrionilor umani).
Celulele stem pluripotent induse (iPSC) nu au limitări etice, deoarece celulele de tip
embrionar se produc prin reprogramarea celulelor adulte somatice din țesuturi diferențiate.
iPSC au fost obținute în premieră în 2006, de Yamanaka et al, pornind de la fibroblaști
din pielea de șoarece. Reprogramarea celulelor diferențiate s-a realizat prin incorporarea
genetică a 4 factori de transcripție, cu ajutorul retrovirusurilor.
În prezent reprogramarea se face prin metode chimice, eliminând astfel riscurile
utilizării retrovirusurilor (mutații genetice, alterarea expresiei genelor).
S-a reușit transdiferențierea fibroblastului din piele în cardiomiocit.
În prezent iPSC sunt utilizate în domeniul regenerării cardiace pe 3 direcții:
 generarea unor noi terapii de înlocuire
 modelarea bolii
 descoperirea de medicamente noi.
Pentru evidențierea proliferării miocitelor se utilizează marcarea preparatelor de
miocard cu BrdU (bromo-deoxiuridină = analog de timidină). Fixarea BrdU pe ADN în curs de
replicare (monocatenar, celula se află în faza S) se pune în evidență cu anticorpi anti-BrdU
(anticorpi monoclonali de șobolan). Aceștia se marchează apoi prin imunohistochimie sau prin
tehnică ELISA (chemiluminiscență).
La animalele de laborator (șoricei) s-au evidențiat proliferarea și modificările fenotipice
ale CSC, de la celule nediferențiate până la miocite specializate.
Un experiment din 2005 a urmărit activarea CSC în inima de șoarece de laborator:
șoriceii au fost injectați cu BrdU la fiecare 12 ore, timp de 2 zile sau 6 zile; un lot a fost
sacrificat după cele 6 zile, iar alt lot a fost sacrificat după 10 săptămâni.
Dinamica celulară observată a sugerat că în perioada de 2 ½ luni s-au înnoit 10-19%
dintre miocitele atriale și ventriculare. Acest fenomen s-a produs în condițiile menținerii
numărului total de miocite, ceea cea sugerat un turn-over crescut al celulelor cardiace. Înnoirea
miocitelor nu s-a făcut omogen, ci predominent în zonele de miocard unde existau cele mai
multe CSC.
S-a determinat și numărul de celule miocardice progenitor-precursor. Împreună cu
numărul CSC, aceste determinări au permis evaluarea T ½ al miocitelor.
S-a constatat că miocitele atriale și cele de la apex au T ½ de două ori mai scurt decât
cele din restul regiunilor miocardului, ceea ce arată că turn-overul celular este heterogen ca
repartizare și mult mai intens decât se presupunea. Pe ansamblul cordului de șoarece, 50% din

3
miocitele ventriculare se pierd în circa 9 luni, iar la nivelul atriilor și apexului acest proces se
produce în numai 4 luni.
Ritmul de turn-over este invers proporțional cu nivelul stressului hemodinamic în
cavitățile cordului, în sensul că celulele supuse unui efort mai mare au o durată de viață mai
mare. Explicația propusă este aceea că ventriculii depun un efort contractil mult mai maredecât
atriile, iar acest efort nu ar putea fi susținut dacă la un anumit moment un număr mare de
miocite s-ar afla în mitoză.
În condiții fiziologice rezerva de CSC endogene este suficientă pentru a menține
homeostazia celulară și performanța contractilă.
Suprasolicitările hemodinamice (creșterea presarcinii sau postsarcinii) induc procese de
remodelare a miocardului (figura 2).

Suprasolicitări
hemodinamice

Hipertrofia și Apoptoza și
proliferarea necroza
miocitelor miocitelor

Remodelarea
miocardului

Figura 2. Factorii care produc remodelarea miocardului

(după Pfeffer și Braunwald, 1990).

S-a dovedit prin argumente indirecte că nu capaciatea scăzută de regenerare a

miocardului este cauza primară a afectării funcției cardiace. Aceste argumente sunt:
 În primele stadii ale insuficienței cardiace non-ischemice inima are în multe cazuri un
număr total de celule superior limitei normale.
 S-au observat cazuri în care numărul total al miocitelor era scăzut, însă funcția ventriculară
era proporțional puțin afectată.
Un exemplu sugestiv, observat pe model animal și la om, este remodelarea miocardului
care apare în cardiopatia hipertensivă sau în stenoza aortică strânsă.
Inițierea și progresia disfuncției cardiace depind în principal de doi factori:
 Acumularea de miocite senescente, cu contractilitate scăzută
 Apariția de focare multiple de țesut cicatricial.

4
 Cercetările ultimilor ani au contrazis noțiunea general acceptată că toate miocitele au
aceeași vârstă. Din contră, pe măsură ce înaintăm în vârstă și în special în cordul patologic,
populația de celule miocardice este heterogenă: celule tinere, adulte, bătrâne și senescente.
Acestea diferă atât prin suprafața de secțiune, care crește cu vârsta (tabelul 1), cât și prin
expresia unor receptori de membrană (tabelul 2).

Tabelul I. Variația suprafeței de secțiune în funcție de vârsta miocitelor (Urbanek et al., 2003).

Vârsta miocitelor Suprafața de secțiune

Celule tinere Sub 180 2

Celule adulte 

Celule bătrâne 

Celule senescente 

Tabelul 2. p16INK4a și p53 sunt markeri caracteristici pentru îmbătrânirea celulară (Urbanek et
al., 2003, Sherr și Roberts, 2004).
Vârsta miocitelor p21Cip1 p53 p16INK4a

Celule tinere - -

Celule adulte + - -

Celule bătrâne + + -

Celule senescente - + +

Î mbătrânirea miocitelor, însoțită de creșterea volumului lor, duc la alterarea

metabolismului Ca și implicit a funcției celulelor.
O serie de boli cardiace apar prin scăderea răspunsului regenerativ (prin deficitul de
morfogene) și limitarea proliferării celulare.
Este posibil ca regenerarea miocardului adult după diverse leziuni să se producă prin
reactivarea unor căi metabolice proprii miocardului embrionar
Experimental, transferul de ADN care conține genele ariciului sonic (human sonic
hedgehog - SHH) în celulele miocardului a avut efect favorabil asupra refacerii tisulare după
leziuni prin ischemie acută și cronică.

5
 Genele din familia ”arici” (hedghehog gene family) codifică proteine de semnalizare
(hedghehog signaling pathway) cu rol important în morfogeneză. Proteinele identificate până
acum sunt:
 ariciul sonic (sonic hedgehog – SHH, denumire inspirată de personajul de desene animate)
 ariciul de deșert (desert hedgehog – DHH)
 ariciul indian (Indian hedgehog - IHH).
Ariciul sonic este un morfogen cu structură proteică, cu rol central în organogeneza
animalelor, de la insecte până la vertebrate. Pe lângă efectele multiple asupra țesuturilor
embrionare, s-a dovedit că ariciul sonic acționează și în organismele adulte, controlând
proliferarea celulelor stem. Această proteină este implicată și în dezvoltarea unor cancere.
Ariciul indian este un morfogen implicat în special în procesul de osificare encondrală.
Ariciul de deșert este o proteină cu roluri complexe în căile de semnalizare
intracelulare. Defectele genei duc la disgenezii gonadale și polineuropatie.
Răspunsul pozitiv al miocardului la transferul genelor SHH a fost mediat prin:
 creșterea angiogenezei
 scăderea depunerii de colagen și a fenomenelor de fibroză
 scăderea proceselor de apoptoză a miocitelor.
Experimentele de acest fel au demonstrat că terapia genică poate fi eficientă în
regenerarea cardiacă, prin stimularea expresiei unor factori trofici și a proceselor de reparație.
În ultimii ani cunoștințele noastre despre biologia cordului s-au modificat în mod
revoluționar. Au apărut perspective de regenerare cardiacă mediată prin activarea, proliferarea
și diferențierea unor celule primitive exogene sau endogene. Problemele care trebuie rezolvate
sunt legate de:
 numărul de celule care trebuie administrate
 procesele de supraviețuire și moarte celulară în zonele de miocard afectat, care constituie n
mediu ostil pentru celule
 grefarea celulelor administrate prin perfuzie în zonele afectate din miocard (homing)
 creșterea, proliferarea și diferențierea acestor celule în zonele respective.
Celulele progenitoare, fie că sunt exogene fie că sunt CPCs (cardiac progenitor cells)
rezidente, participă la procesul de reparație în mod direct și indirect:
 Celulele progenitoare trebuie să dea dovadă de plasticitate, adică să se transforme, conform
necesităților, în celule din linia miocit-mușchi neted vascular sau din linia endotelială. În
acest mod se obține în final o proporție corectă între parenchimul cardiac și rețeaua vaselor
coronare (figura 3).

6
 Celulele progenitoare contribuie indirect la regenerarea cardiacă eliberând proteine cu efect
paracrin asupra miocardului și CPCs rezidente.

Celule progenitoare
exogene sau CPCs
rezidente
Plasticitate

Linia miocit- Linia

mușchi neted endotelială
vascular
Proporție corectă între
miocardul contractil și
rețeaua de vase coronare

Figura 3. Necesitatea plasticității celulelor progenitoare cardiace