Facultatea de Inginerie Medicală

Bioinginerie aplicată pentru medicina regenerativă

Disciplina de Patologii tisulare vizate în medicina regenerativă

CURSUL 4. APLICAȚII ALE MEDICINEI REGENERATIVE ÎN INSUFICIENȚA

CARDIACĂ DE CAUZĂ ISCHEMICĂ

Medicina regenerativă și insuficiența cardiacă

Insuficiența cardiacă (IC) este una din cazele importante de mortalitate și morbiditate pe
plan mondial, iar în multe cazuri ea apare ca o consecință a pierderii de miocard contractil
printr-un infarct.
Se estimează că, în SUA, IC provoacă 55000 de decese și costă sistemul de sănătate
circa 34 x 109 $ anual. În ciuda tratamentelor moderne și a tehnicilor de transplant, circa ½
dintre pacienți decedează în interval de 5 ani de la diagnostic.
Tratamentul cu celule stem se conturează ca o opțiune atractivă în tratamentul
insuficienței cardiace severe (figura 1).

Figura 1. Aspecte de semiologie în insuficiența cardiacă globală: cianoză (stânga) și edeme

cardiace (dreapta). (Colecția Prof. Dr. S. Aramă - Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie,
Facultatea de Medicină Dentară, UMF ”Carol Davila și colecția Dr. P. Mustățea - Clinica de
Chirurgie, Sp. Cl. ”Dr. I. Cantacuzino”București)

S-a dovedit experimental că transplantul de celule provenite din măduva hematogenă

ameliorează discret funcția cardiacă la animalele de experiență și la pacienții cu IC, dar
mecanismele nu sunt cunoscute. Procesul de transdiferențiere a acestor celule în miocite
cardiace este slab, iar majoritatea celulelor transplantate dispar din miocard în circa 7 zile după
transplant.

1
 Există dovezi care sugerează că efectele benefice asupra funcției cardiace s-ar datora
stimulării celulelor stem cardiace (CSC) endogene de către celulele transplantate. Cordul adult
conține o populație mică de celule stem cardiace (CSC), care sunt adaptate la micromediul
cardiac și participă în timpul vieții la procesele de reparație în condiții fiziologice și patologice.
Există numeroase tehnici prin care CSC sunt izolate, înmulțite în cultură și introduse în
organism în scop terapeutic. Deși deocamdată rezultatele clinice nu se ridică la înălțimea
așteptărilor, acestea sunt încurajatoare.
Mai multe trialuri clinice care au utilizat CSC autologe la pacienții cu cardiomiopatie
ischemică au demonstrat un profil bun de siguranță și eficacitate terapeutică în diverse grade.
Sunt necesare studii suplimentare pentru optimizarea metodelor de recoltare a CSC (acestea se
recoltează în prezent prin proceduri invazive), de izolare, preparare și administrare la pacienți.
Potențialul terapiilor cu CSC este foarte mare și poate să schimbe radical abordarea terapeutică
a IC refractare.
Markerii de suprafață ai CSC depind de metoda de izolare și de expansionare in vitro,
ceea ce explică rezultatele experimentale parțial discordante citate în literatură. Încă nu există o
opinie unitară cu privire la cei mai potriviți markeri fenotipici care să identifice CSC cu
potențialul optim pentru regenerarea cardiacă.
Metodele utilizate pentru izolarea CSC sunt variate:
 sortare activată magnetic sau prin fluorescență bazată pe expresia unor markeri specifici
 separarea celulelor pe baza unor proprietăți de agregare (cardiosferele)
 izolarea celulelor progenitoare Isl-1+ (Islet-1) prin knock-in genetic la nivelul genelor
reporter
 tehnologie microfluidică
 tehnologie de explantare tisulară – extragere au unor țesuturi embrionare și cultivarea lor
separată, pentru a urmări organogeneza, rolul genelor și al moleculelor de semnalizare.
Nu se știe exact care este originea CSC. De fapt CSC nu sunt un singur tip de celule ci
un spectru de celule, care prezintă unele deosebiri și capacități funcționale diferite. Unele
deosebiri depind de tehnicile prin care aceste celule sunt izolate (tabelele 1 și 2).
Mai mult, rezultatele experimentelor pe model animal trebuie extrapolate cu prudență la
om, deoarece majoritatea studiilor sunt efectuate pe modele de boală cardiacă ischemică indusă
la animalul tânăr, fără alte patologii, astfel că rezultatele sunt greu de aplicat la pacienții umani,
de obicei în vârstă și cu co-morbidități (HTA, diabet, dislipidemii etc).

2
 Tabelul 1. Caracteristicile CSC (după Yaoliang et al, 2013)

Tipul de Tehnologia de Sursa celulelor Caracteristici

celulă izolare

Celule Digestie + Cord de șobolan • Autoreînnoire, clonogenică,

cardiace c- MACS/FACS multipotentă
kit+

Celule Digestie + Cord de șoarece • Expresia factorilor de

progeni- MACS Cord de șoarece transcripție cardiacă;
toare Tehnica în 2 Cord uman diferențiere cardiacă după
Sca-1+ timpi patologic inducție cu 5-ază
MACS • Autoreînnoire, clonogenică,
multipotentă
• Clonogenică, diferențiere
miocitară indusă de TGF-b și
MBP6
cSPC Eliminare Cord de șoarece • Capabilă de diferențiere și
Hoechst proliferare
FACS

CDC Explante Biopsii cord • Clonogenice

cardiace uman
(cardiosfere) Cord de șoarece

Celule Digestie Cord de șoarece • Diferențiere în cardiomiocite

Isl1+ transgenic Isl1-
mCrem

Tabelul 2. Markerii CSC (după Yaoliang et al, 2013)

Tipul de celulă Tehnologia de izolare Markerii de identificare

Celule cardiace Digestie + • Lin- c-kit+

c-kit+ MACS/FACS
Celule Digestie + MACS • Lin-, Sca-1+, CD31+, CD38+, c-
progenitoare Tehnica în 2 timpi kit-, Flk-1-, CD45 –
Sca-1+ MACS • Sca-1+, c-kit+, CD45 –
• Sca-1+

cSPC Eliminare Hoechst • Abcg2+, Sca-1+, c-kit+, CD34+,

FACS CD45–

3
CDC Explante cardiace • KDR+, CD31+, CD34+, c-kit+,
(cardiosfere) Sca-1+

Celule Isl1+ Digestie • Expresia unor factori de transcripție

progenitor-specifici

Celulele c-kit+
Celulele c-kit+ au fost descrise de Beltrami et al. în 2003. Acestea prezintă proprietățile
de autoreînnoire și sunt clonogenice și multipotente, astfel că se pot diferenția în miocite, celule
endoteliale și celule de mușchi neted.
Injectarea celulelor c-kit+ la animalul cu ischemie miocardică a dus la regenerarea de
miocard funcțional, format din miocite tinere și rețea vasculară.
Nu se cunoaște originea acestora. Datele disponibile sugerează că celulele progenitoare
c-kit+ rezidente în cordul adult sunt o populație heterogenă, care diferă prin origini, funcții și
capacitatea de diferențiere. Sandstedt et al. (2010) susțin că celulele c-kit+ CD45– sunt celule
progenitoare endoteliale prezente în cordul adult.
Hattori et al. (2010) au demonstrat că celulele c-kit+ reprezintă o populație de celule
epicardice de origine mezotelială, în timp ce Zhou et al. (2010) au presupus că celulele c-
kit+/CD45 (moderat) sunt o varietate de mastocite.
Fazel et al. (2006) susțin că celulele c-kit+ provin din măduva hematogenă și au rol de
reglare a echilibrului de citokine angiogenice la nivelul miocardului (VEGF, angiopoietină).
Există opinii divergente asupra rolului c-kit+ în inima ischemiată. Jesty et al. (2012)
consideră că:
 precursorii c-kit+ din perioada neonatală contribuie la regenerarea cardiomiocitelor post-
IMA
 precursorii c-kit+ din cordul adult participă numai la regenerarea vaselor sanguine.

Celulele Sca-1+
Acestea sunt CSC endogene ce pot fi izolate din cordul adult și apoi se pot
transdiferenția in vitro în:
 cardiomiocite
 celule endoteliale
 celule de mușchi neted

4
 Dacă aceste celule sunt administrate la modelul animal cu ischemie/reperfuzie cardacă,
ele se localizează (homing) în zona infarctului și în zona de graniță (la limita între zona de
infarct și țesutul sănătos), unde se diferențiază în miocite.
Wang et al. (2006) au arătat că transplantarea de celule Sca-1+/CD31− în cordul de
șoarece cu infarct miocardic acut (IMA) a încetinit alterarea funcțională și remodelarea
cardiacă, cu următorii parametri demonstrabili:
 A crescut fracția de ejecție (FE) a ventriculului stâng (VS).
 Au scăzut volumului telesistolic și telediastolic al VS.
 Procesul de neovascularizație miocardică a fost mai intens.
 Au apărut fenomene modeste de regenerare a miocitelor.
Din contră, alterarea genetică a celulelor Sca-1+ a produs la animalele de experiență
tulburări ale proceselor de reparație a miocardului caracteristice pentru alterarea proliferării
celulelor progenitoare cardiace rezidente.

cSPC (Cardiac side population cells)

SPC se pun în evidență prin capacitatea lor de a elimina colorantul Hoechst 33342,
evidențiată prin cu citometrie de flux cu două lungimi de undă.
SPC sunt celule prezente în măduva hematogenă, cord, mușchii scheletici, plămân, ficat, țesut
adipos.
cSPC este o subpopulație a SPC, Abcg2+, cu caractere de celulă stem, care a demonstrat
experimental capacitatea de a contribui la regenerarea cordului lezat. De fapt cSPC este o
populație heterogenă care cuprinde celule endoteliale, musculare netede și mezenchimale (cu
potențial de diferențiere în cardiomiocite). De aceea rolul lor în regenerarea cardiacă ae încă
multe necunoscute.

EPDC (Epicardium-derived cells)

Cai et al. au raportat în 2008 existența EPDC, care sunt progenitori existenți în pro-
epicardul embrionar care exprimă factorul de transcripție Tbx18. Din păcate nu se cunosc încă
markeri de suprafață pentru EPDC, ceea ce îngreunează mult studierea acestor celule.
EPDC au următoarele roluri demonstrate:
 Migrează spre exteriorul inimii și formează epicardul.
 Contribuie la formarea miocitelor din septul interventricular și a pereților liberi ai atriilor și
ventriculilor.
 Participă la formarea rețelei vasculare coronare.

5
 La peștii-zebră o subpopulație din EPDC transdiferențiază în celule mezenchimale,
migrează în țesuturile lezate și produce vase de neoformație.
Este posibil ca transformarea EPDC în celule mezenchimale să fie unul dintre
mecanismele importante de generare a celulelor progenitoare cardiace, care ulterior devin
cardiomiocite, celule endoteliale și celule de mușchi neted vascular.
Smart et al. (2007) au demonstrat că Tbeta-4 (timozin beta-4 sau proteina de legare a
monomerilor de actină), o proteină foarte importantă pentru dezvoltarea inimii și cu efecte
cardioprotective, este secretată în exces de miocardul ischemic și stimulează EDPC pentru a
migra și a genera vase coronare (figura 2). În același context, Gajzer et al. (2012) au raportat că
procesul de priming al celulelor EPDC cu Tbeta-4 favorizează diferențierea lor în
cardiomiocite.

Miocard ischemic

Hipersecreție de
Tbeta-4

EPDC

Diferențiere în endoteliu și
Migrare spre interior
mușchi neted

Regenerare de vase coronare

Figura 2. Evoluția EPDC sub influența Tbeta-4

CDC (Cardiospheres-derived cells)

Cardiosferele sunt grupuri de celule care au tendința să se auto-asanbleze, formate prin
proliferarea unor explante cardiace cultivate pe substrat non-aderent. Masa celulară centrală a
cardiosferelor conține celule primitive, cu proliferare intensă, și este înconjurată spre exterior
de un înveliș de celule mezenchimale/ stromale și celule în curs de diferențiere, care au fenotip
de cardiomiocit.
Cardiosferele conțin atât celule primitive, cât și progenitori pentru principalele linii
celulare prezente în inimă: cardiomiocite, celule de mușchi neted, celule endoteliale.

6
 Messina et al. au demonstrat în 2004 că CDC pot fi multiplicate pornind de la biopsii de
miocard de om și șoarece, care formează cardiosfere.
A apărut problema populației heterogene conținută în cardiosfere: fibroblaștii cresc mai
rapid decât CDC utilizate pentru regenerare. Contaminarea cu fibroblaști afectează utilitatea
terapeutică a CDC, deoarece fibroblaștii pot duce la formarea de țesut cicatricial. S-au dezvoltat
tehnici de purificare a CDC de contaminarea cu fibroblaști (Tang et al., 2007), astfel că se obțin
CDC Sca-1+ care formează agregate sferoide în cultură și au capacitatea de diferențiere în
celule endoteliale, celule musculare netede și miocite în cordul ischemic.
Un studiu comparativ publicat în 2012 de Li et al. a arătat că CDC au adus beneficii
funcționale comparativ cu alte tipuri de celule stem. Autorii au presupus că avantajul CDC se
datorează mai multor elemente:
 secreție de factori paracrini care stimulează angiogeneza și scad apoptoza
 potențial superior pentru grefare locală
 capacitate crescută de diferențiere.
Un alt avantaj este reprezentat de obținerea relativ ușoară a cardiosferelor, prin biopsii
de miocard percutane. Din aceste motive ele reprezită o sursă avantajoasă de celule cu potențial
pentru regenerarea cardiacă.

Celulele Isl-1+ (Islet-1+ cells)

Populația celulară care exprimă factorul de transcripție Islet-1 (Isl-1) are o importanță
deosebită în dezvoltarea cordului embrionar. Celulele Isl-1+ provin din creasta neurală sau din
linia cardiomiocitelor și se găsesc în număr mic în cordul adult, în zone greu accesibile pentru
recoltare.
Domian et al. (2009) au descris în cadrul populației Isl-1+ o celulă progenitoare pentru
ventriculi, care proliferează și se diferențiază in vitro , producând țesut ventricular funcțional.
Itzhaki-Alfia et al. (2009) au studiat comparativ progenitori Isl-1+ obținuți din țesutul
atrial și ventricular de cord uman, de la 94 de pacienți cu vârste între 23-80 de ani, cu ocazia
unor intervenții chirurgicale, transplant sau biopsii endomiocardice. Principalele concluzii ale
autorilor au fost:
 Cea mai bună sursă de progenitori Isl-1+ este atriul drept.
 Celulele Isl-1+ sunt multipotente și se pot diferenția în adipocite, osteoblaste și miocite.
 Cardiosferele ar putea fi o nișă intermediară pentru celule stem, de unde să se recolteze
celule Isl-1+.

7
 Ye et al. (2012) au arătat că populația de celule Sca-1+ derivate din cardiosfere
provenite din inimi de vărstă medie care au suferit infarct conțin numeroși precursori Isl-1+,
care se diferențiază în țesut miocardic și vase coronare.

Concluzii și perspective
Inima adultă conține CSC cu fenotipuri diferite în funcție de metoda de izolare. Aceste
celule oferă o serie de avantaje pentru regenerarea cardiacă, comparativ cu celulele stem
mezenchimale obținute din măduva hematogenă sau din țesutul adipos.
CSC prezintă însă și unele dezavantaje:
 Se recoltează prin proceduri invazive
 Izolarea CSC presupune proceduri laborioase
 Numărul de CSC rezidente scade odată cu vârsta.
O sursă potențială foarte bună de CSC alogenice este cordul de nou-născut, care conține
progenitori cu capacitate foarte bună de regenerare.
Una din principalele dificultăți care trebuie învinse de aceste celule este supraviețuirea
lor în miocardul ischemic, care este un mediu extrem de neprietenos pentru celule.
Cercetătorii caută moduri de creștere a supraviețuirii CSC transplantate. Una din soluții
este precondiționarea hipoxică, procedeu prin care s-au obținut inhibarea apoptozei, creșterea
supraviețuirii și a recrutării CSC în miocardul ischemic (Tang et al., 2009, Yan et al., 2012).
Alte probleme care trebuie rezolvate în viitor:
 Stabilirea variantelor optime de asociere a fenotipului de CSC cu modul de administrare
 Standardizarea procedeelor de izolare și purificare a CSC
 Studii pe modele experimentale de animal mare, care pot fi extrapolate la om.