Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
ŞCOALA DOCTORALĂ
TEZĂ DE DOCTORAT
REZUMAT
CONDUCĂTOR DE DOCTORAT
Prof. univ. dr. Maria Vrabete
STUDENT - DOCTORAND
Mitran Smaranda Ioana
CRAIOVA
2013
1
CUPRINS
LISTA DE ABREVIERI
2
Introducere
Accidentul cerebral ischemic focal (stroke-ul) este echivalentul cerebral al
infarctului de miocard. Conform ultimelor date furnizate de către Organizaţia
Mondială a Sănătăţii, aproximativ 15 milioane de oameni din lumea întreagă suferă un
atac cerebral. Dintre aceştia 1/3 mor (3 milioane femei şi 2,5 milioane bărbaţi) şi 1/3
rămân cu sechele permanente, devenind o adevărată povară pentru familie şi societate
(WHO, The Atlas of Heart Disease and Stroke, 2011).
Datorită creşterii speranţei de viaţă şi a îmbătrânirii populaţiei toate acestea sunt
apanajul vârstnicilor, dealtfel, chiar vârsta înaintată reprezintă un factor de risc pentru
accidentul vascular cerebral ischemic (Barnett HJ, 2002). Astfel, orice model de
stroke ce foloseşte animale bătrâne este benefic, atât pentru evidenţierea
mecanismelor celulare declanşate de ischemie/reperfuzie, dar şi a capacităţii de
răspuns şi apărare a neuronului la vârstnic.
3
în diferite regiuni ale creierului. Astfel, la valori mai mici de 18-20 ml/min/100g apare
ischemia cerebrală, iar la FCS de 8-10 ml/min/100g, depolarizarea spontană a
neuronilor este rapidă datorită pierderii potasiului din celulă şi trecerii lui în spaţiul
extracelular, în final ajungându-se la moarte celulară.
4
Capitolele 3. şi 4. prezintă activitatea fiecăreia gene analizate, conform celor mai noi
date din literatură.
6. Material şi metode
Experimentele pentru realizarea acestui studiu au fost efectuate în Laboratorul de
Neurobiologie Moleculară, din cadrul Clinicii de Neurologie a Universităţii Ernst-
Moritz-Arndt din Greifswald, Germania, în perioada iulie 2007 – septembrie 2010
(perioadă în care am beneficiat de un grant de mobilitate ERASMUS-PHARE din
partea U.M.F. din Craiova şi de o Bursă Guvernamentală Guvernul României pentru
doctoranzi), precum şi în cadrul unui Grant de cercetare - Disciplina Biochimie
proiect PN-II-PT-PCCA-2011-3.1-0222.
Aprobarea pentru derularea tuturor experimentelor a fost garantată de către
Comisia de Etică a Experimentelor pe Animale (Federal Animal Care Comittee) din
cadrul universităţii menţionată anterior, în concordanţă cu cerinţele legislaţiei germane
şi europene în ceea ce priveşte experimentele pe animale, precum şi de Comisia de
Etică şi Deontologie Universitară şi Ştiinţifică a Universităţii de Medicină şi Farmacie
din Craiova (raport de avizare nr 104/19.12.2012). Experimentele au fost realizate sub
atenta coordonare a Prof. univ. dr. Aurel Popa-Wagner.
Studiul a fost efectuat folosin un lot de 78 de şobolani rasa Sprague Dawley, de
sex masculin, tineri (3 luni) şi bătrâni (vârsta cuprinsă între 19-20 luni), ţinuţi în
condiţii stricte de laborator (Tabel nr. 1).
5
Şobolani tineri 3zile 14zile Control
OACM OACM
Număr de 15 15 10
animale
Şobolani 3zile 14zile Control
bătrâni OACM OACM
Număr de 15 15 8
animale
TOTAL ANIMALE = 78
Tabel nr. 1. Distribuţia animalelor în funcţie de vârstă şi perioada de supravieţuire
6
Detectarea, analizarea şi identificarea proteinelor a fost făcută prin Dot Blot,
tehnică similară cu tehnica Western blot, dar mult mai eficientă ca timp. Identificarea
proteinelor a fost făcută cu ajutorul anticorpilor specifici (în cazul de faţă pentru
identificarea proteinelor ID3 - rabbit anti ID3, ABCAM).
Tehnica de imunohistochimie şi respectiv de imunofluorescenţă au fost folosite
pentru detectarea neuronilor apoptotici prin intermediul cleaved caspazei 3, Cell
Signaling şi a neuronilor aflaţi în diviziunea şi diferenţierea celulară prin ID3; totodată
s-a utilizat un alt anticorp, DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol dilactat, un anticorp
fluorescent des folosit în marcarea celulelor vii, dar şi a celor fixate, neafectate în
momentul recoltării), pentru evidenţierea neuronilor viabili.
7. Rezultate
S-a obţinut o medie a volumului infarctului de 36.36 ± 5.731 mm3 pentru
şobolanii vârstnici, respectiv 33.33 ± 4.084 mm3 pentru cei tineri. Diferenţa dintre cele
două grupuri de animale nu a fost semnificativă statistic (p=0,3374) (Figura nr. 1.).
S-au făcut remarcate mai multe modele de reglare a genelor detectate prin
microarray şi qPCR; au fost gene supra-exprimate:persistent (la 3 zile, dar şi la 14 zile
de la OACM), tranzitor, numai în faza acută (la 3 zile) şi tardiv, la14 zile după
ischemia focală; de asemenea, gene sub-exprimate persistent/ tranzitor/tardiv.
Antiapoptoză/protecţie neuronală
Tpp1, Hmox1, Id3 au prezentat acelaşi comportament genic: au fost
supraexprimate permanent, dar cu o mai bună protecţie la tineri în faza acută şi la
şobolanii bătrâni la 14 zile. Grupul de animale tinere a beneficiat de o protecţie
neuronală suplimentară şi rapidă prin supraexprimarea E2f5 şi mai ales a Serpine 1
(6x), iar cei vârstnici prin Ddr1.
Modificări ADN
La nivelul cerebral al animalelor de experienţă s-a observat o protecţie exercitată
de Xrcc6bp1, Brca1şi Mapkapk supraexprimate, cu excepţia grupului de tineri 14 zile.
Deteriorarea ADN a fost prelungită de activitatea Sp100 şi Irf1 (la lotul de şobolani
bătrâni, 14 zile, de 4x mai exprimate), precum şi de Ripk3 la tineri, în faza acută (5x).
Limitarea răspunsului inflamator
Procesul inflamator pare să fi fost limitat prin supraexprimarea Cd36 (mai ales în
faza acută, la tineri de 4 ori faţă de lotul de şobolani vârstnici) şi a Twist1(3 zile -
tineri, 14 zile - bătrâni).
Remodelarea SNC
7
Capacitatea de remodelare a zonei lezate a fost mai intensă de 5 ori la grupul de
şobolani tineri, în faza acută post-ischemie, prin supraexprimarea Flna; diferenţele pe
grupe de vârstă sunt semnificative şi corelate cu prezenţa altei gene implicată în
determinarea liniei de celule și diferenţiere: Twist1.
Ube2c a prezentat o supraexprimare genică permanentă, dar mai accentuată în
primele 3 zile după leziune, la ambele grupuri de animale.
Metabolismul proteic
Sinteza proteică a fost urmărită prin trei gene (Ap3b1, Necap2, Picalm). S-au observat
niveluri crescute ale acestora doar la şobolanii bătrâni, la 14 zile (Ap3b1 şi Picalm).
Degradarea proteică evidenţiază o valoare mai mare pentru Ube2t la animalele din
faza acută şi pentru Cndp1 la vârstnici, 14 zile.
Metabolismul glucidic
A fost urmărit prin analiza unei singure gene Pygl care a fost supraexprimată
numai în faza acută, la şobolanii tineri.
Metabolismul lipidic
Datorită leziunilor induse experimental, gena a fost subexprimată în faza acută la
toate animalele, iar la 14 zile, doar la şobolanii tineri.
Metabolismul energetic
Supraexprimarea Rab 32, implicată în fisiunea mitocondrială şi în metabolismul
energetic, la toate grupele de animale studiate, dar mai ales la cele vârstnice, pare a fi
un mecanism de protecţie împotriva stresului oxidativ.
Transportul intracelular şi semnalizarea
Ehd4 şi Scamp2 implicate în transporturi proteice intracelulare au fost
supraexprimate la toţi şobolanii, cu precădere la cei bătrâni. În schimb transducţia
semnalului celular şi reglarea dinamicii microtubulilor a fost, în general, nemodificată;
doar lotul de şobolani tineri a prezentat gena Stmn3 subexprimată.
Transportul membranar
Rab27a s-a intensificat tardiv, la lotul de vârstnici şi a rămas nemodificată la
restul animalelor.
Rezultatele obţinute prin Dot Blot arată o creştere a sintezei proteice de ID3 în
ambele grupe de vârstă faţă de blanc (lysis buffer). Totuşi, valorile au fost net mai bine
reprezentate la vârstnici, atât în faza acută, cât şi la 14 zile.
Comparând cu expresia genică a ID3 care era şi ea supraexprimată, dar la tineri
la 3 zile şi la bătrâni la 14 zile, putem concluziona că şobolanii vârstnici prezintă un
posibil mecanism de protecţie prin sinteza efectivă a proteinei ID3, mai ales tardiv, în
ziua a 14-a.
Prin dublă imunofluorescenţă s-a urmărit aspectul celular în aceleaşi zone şi s-au
observat celulele care prezentau colocalizarea celor două tipuri de anticorpi (atât ID3
cât şi cleaved caspase 3). Tot prin dublă imunofluorescenţă s-au colocalizat ID3 şi
DAPI; prezenţa ID3 este marcată cu verde (Figura nr. 2.-A) şi neuronii viabili, marcaţi
cu DAPI - albastru. La şobolanii sacrificaţi la 14 zile, atât tineri cât şi bătrâni,
exprimarea ID3 şi DAPI este intensă. În concordanţă cu rezultatele obţinute prin
qPCR şi Dot blot, cea mai intensă expresie a proteinei ID3 se observă la animalele
bătrâne, la 14 zile (Figura nr. 2.-B).
8
A B
Figura nr. 7.20. Şobolan tânăr (A) şi bătrân (B)-14 zile_id3_dapi_40x_zona cu ischemie focală
8. Discuţii
Date recente, acceptate de toţi cercetătorii, apreciază că stresul oxidativ (Sox)
este generat de acumularea speciilor reactive de O2 (SRO) şi azot (SRN), odată cu
reducerea capacităţii antioxidante a serului. Apariţia SRO este caracteristică pentru
locurile unde se dezvoltă procese reacţionale de tip inflamator, SRO funcţionând ca
molecule semnalizatoare şi reglatori intermediari ai activităţii celulare fundamentale,
cum ar fi creşterea, diferenţierea şi diviziunea celulelor (când sunt în concentraţii
mici); la concentraţii înalte, SRO determină moartea celulară.
De aceea studiul de faţă, prin analiza genomică şi proteomică a 34 de gene
implicate în stres oxidativ şi metabolism celular, după ischemie focală cerebrală,
încearcă să lămurească anumite aspecte patofiziologice ale răspunsului neuronal la
injurie şi mai ales la nivelul ţesutului neurologic îmbătrânit.
9. Concluzii
1. Rezultatele studiului nostru au arătat, pentru prima dată, concordanţa dintre
supraexprimarea genică, determinată prin qPCR, aprecierea sintezei proteice, prin Dot
Blot cantitativ şi marcarea prin dublă imunofluorescenţă a ID3, ca posibil mecanism
de protecţie la animalele vârstnice, mai ales în faza tardivă, după ischemie focală.
2. De asemenea, au fost identificate alte posibile mecanisme protectoare ale
celularităţii şi funcţiei cerebrale la şobolanii vârstnici, după ischemie focală, prin
intermediul supraexprimării următoarelor gene: Tpp1, Hmox, Ddr1, Xrcc6bp1, Brca1,
Mapkapk, Twist1, Ap3b1, Picalm, Rab 32 şi Rab27a.
3. Aceste rezultate sunt importante pentru susţinerea unor studii experimentale
ulterioare, mai ales pentru ID3, în vederea îmbunătăţirii recuperării şi supravieţuirii
după accidentele vasculare cerebrale ischemice, la persoanele în vârstă, după faza
acută a ischemiei focale.
4. Genele exprimate în metabolismul glucidic postischemie, apar la animalele tinere,
în faza acută, în timp ce la animalele vârstnice se exprimă gene Rab32, coordonatoare
ale fisiunii mitocondriale şi ale metabolismului energetic, posibil mecanism protector
împotriva stresului oxidativ.
5. Genele susţinătoare ale proteinelor din căile de semnalizare intracelulară se
conectează la sinapsa imunologică, supraexprimarea lor fiind tardivă, la animalele în
vârstă.
9
6. Pentru animalele tinere, genele reparatoare sunt supraexprimate în faza acută, zona
postischemică remodelându-se mai puternic la acestea, în timp ce, pentru animalele
bătrâne, se exprimă în perioada tardivă.
7. Moartea celulelor alterate (neviabile, necrozate, apoptotice) este esenţială pentru
producerea altora, sănătoase, pentru menţinerea homeostaziei celulare; apariţia unor
dezechilibre, în favoarea pierderii, determină disfuncţiile-insuficienţele ariilor
afectate, în special la animalele vârstnice, în zona de ischemie cerebrală (deşi
nesemnificativ statistic, p=0,3374, animalele bătrâne au dezvoltat un volum al zonei
de infarct mai mare, faţă de cele tinere) .
8. Permisivitatea detectării volumului infarctului cerebral este dată de asocierea a două
metode de investigaţie (metoda Cavalieri şi a diferenţei dintre ariile corticale contra- şi
ipsilaterală), care pun în evidenţă şi forma distrugerii: apoptoza sau degenerarea.
9. Fenomenele de ischemie/reperfuzie (I/R) şi consecinţa lor, hipoxia de diferite grade,
determinată de sistarea fluxului sanguin o perioadă îndelungată de timp (90 de
minute), este cauza morţii neuronale, mai accentuată la animalele vârstnice.
10. Activarea căilor protectoare neuronale la şobolanii tineri poate fi un model pentru
crearea unor terapii anti-stres oxidativ, care se cuplează cu proteinele din căile de
semnalizare celulară şi mai ales cu cele din calea apoptozei.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Barnett H.J., Stroke prevention in the elderly, Clin Exp Hypertens, 2002, 563-571.
2. Lee JM, Grabb MC, Zipfel GJ, Choi DW, Brain tissue responses to ischemia, J Clin Invest, 2000;
106(6):723-31.
3. Li P, Hu X, Gan Y, Gao Y, Liang W, Chen J, Mechanistic insight into DNA damage and repair in
ischemic stroke: exploiting the base excision repair pathway as a model of neuroprotection, Antioxid
Redox Signal, 2011; 14(10):1905-18.
4. Markus T.M., Tsai S.Y., Bollnow M.R. et al., Recovery and brain reorganization after stroke in
adult and aged rats, Ann Neurol, 2005, 950-953.
5. Orlando Regional Healthcare, 2004.
6. Pellegrini L, Bennis Y, Guillet B, Velly L, Bruder N, Pisano P, Cell therapy for stroke: from myth
to reality, Rev Neurol (Paris), 2013; 169(4):291-306.
7. Popa-Wagner A, Schröder E, Schmoll H, Walker LC, Kessler C, Upregulation of MAP1B and
MAP2 in the rat brain after middle cerebral artery occlusion: effect of age, J Cereb Blood Flow
Metab, 1999; 19(4):425-34.
8. Popa-Wagner A, Schröder E, Walker LC, Kessler C,beta-Amyloid precursor protein and ss-
amyloid peptide immunoreactivity in the rat brain after middle cerebral artery occlusion: effect of age,
Stroke, 1998; 29(10):2196-202.
9. Popa-Wagner A., Badan I., Vintilescu R. et al., Premature cellular proliferation following cortical
infarct in aged rats, Rom J Morphol Embryol, 2006, 215-228.
10. Popa-Wagner A., Buga A.M., Kokaia Z., Perturbed cellular response to brain injury during aging,
Ageing Res Rev, 2011, 71-79.
11. Shimizu S, Nagayama T, Jin KL, Zhu L, Loeffert JE, Watkins SC, Graham SH, Simon RP, bcl-2
Antisense treatment prevents induction of tolerance to focal ischemia in the rat brain, J Cereb Blood
Flow Metab, 2001; 21(3):233-43.
12. Vrabete M et al., Could stored blood transfusions (SBT) alter the mechanisms implied in wound
healing, in burned patients? Rom J Morphol Embryol. 2011;52(2):599-604.
13. WHO, The Atlas of Heart Disease and Stroke, 2011.
14. Zaidi A, Plasma membrane Ca-ATPases: Targets of oxidative stress in brain aging and
neurodegeneration, World J Biol Chem, 2010; 1(9):271-80.
10