Descoperirea și dezvoltarea enzimelor

1.Screening enzimatic
 Prezentare generală

Screeningul și selecția sunt procese timpurii în ciclul de cercetare și dezvoltare al unui produs.
În esență, aceasta înseamnă căutarea unei anumite gene care codifică enzima țintă. În trecut,
aceasta a implicat exclusiv screeningul microorganismelor vii (screening microbian clasic), dar
cu aplicarea instrumentelor moderne de biologie moleculară, screeningul poate fi efectuat fără a
fi nevoie să cultive organismele implicate. Ca și în cazul tuturor metodelor, există limitări și o
combinație de tehnici (screening combinatorial) oferă adesea cel mai mare succes.

Cel mai satisfăcător punct de plecare pentru procesul de căutare și descoperire este bogata
diversitate de microorganisme din natură . Rareori se apreciază că pentru 85% din istoria
Pământului, viața a fost limitată la forme microbiene. Diversitatea metabolică creată de aceasta
este cu adevărat imensă. Pe parcursul a peste patru miliarde de ani de evoluție, au apărut enzime
care sunt perfect adaptate pentru menținerea proceselor celulare. Cu toate acestea, multe enzime
trebuie să funcționeze într-un mediu care este departe de condițiile fiziologice naturale și poate
implica chiar expunerea la substanțe chimice cunoscute că degradează sau denaturează enzimele,
ceea ce duce la pierderea activității. De obicei, strategiile de screening și selectare a enzimelor se
bazează pe cunoașterea aplicației și a condițiilor fizice și chimice în care enzima trebuie să
funcționeze. Prin urmare, selecția pentru performanța enzimei în condițiile de aplicare este un
pas esențial timpuriu în procesul de screening. Accesul la un fond mare de gene este o altă
condiție prealabilă pentru un program de screening de succes. Abordările pot implica examinarea
nediscriminatorie a materialului eterogen (de exemplu, solul) adunat din mediu sau o abordare
ecologică cu o examinare țintită a habitatelor specifice în care este probabil să se găsească o
anumită activitate.

Strategiile pot fi adoptate pentru a căuta în mod specific în zonele prost explorate medii în
scopul de a accesa o variație mai mare a genomilor de la microbi noi. În căutarea unor gene noi,
explorarea mediilor extreme, cum ar fi izvoarele termale vulcanice, lacurile hipersaline și solurile
polare, au produs multe microorganisme noi cu proprietăți deosebite. Prin combinarea
screeningului enzimatic cu tehnici moderne, cum ar fi ingineria proteinelor și evoluția dirijată,
moleculele hibride cu o performanță îmbunătățită în condiții specifice de aplicarepoate fi găsit.
Acest capitol va descrie diferitele metode de screening utilizate în prezent în industrie pentru a
obține enzime cu proprietățile dorite.

 Screening natural izolat

Materialul sursă pentru descoperirea enzimelor poate fi materia vegetală sau animală și
microbii, atât procariotele (de exemplu, bacterii și arhee), cât și eucariotele (de exemplu, drojdii
și ciuperci). Microorganismele sunt sursa principală pentru enzimele industriale. Metoda clasică
de screening a izolatelor microbiene naturale este un proces bine stabilit care își are rădăcinile în
descoperirea antibioticelor (de exemplu, peniciline, streptomicină) în deceniile de după 1945.
Aceasta implică examinarea a mii de probe de soluri, materiale vegetale etc., și izolarea aleatorie
și screeningul florei microbiene rezidente. Deși este capabil de automatizare semnificativă,
capacitatea de transfer determină în mare măsură viteza de progres. În trecut, strategiile de
screening folosind eșantioane de sol ca punct de plecare erau extrem de empirice, dar se poate
face mult pentru a reduce necesitatea unei experimentări extinse. Aceste procese implică
supunerea unui eșantion de mediu (de exemplu, sol) la presiune selectivă folosind principiile
culturii de îmbogățire prin manipularea condițiilor de creștere astfel încât numai
microorganismele care exprimă o anumită enzimă să poată crește și supraviețui. Un rezultat
reușit poate fi îmbunătățit printr-o alegere judicioasă a mediului pentru examinare, de exemplu,
soluri acide, turbării și gunoi de pădure.

O abordare ecologică profită de presiunea naturală selectivă a mediului. De exemplu, un mediu

alcalin, cum ar fi un lac de sodă la pH 9, este locuit doar de microorganisme alcalifile. Este
probabil ca aceste organisme să aibă enzime extracelulare care sunt stabile și au performanțe
optime la pH ridicat, iar acesta este într-adevăr cazul. Pentru screeningul enzimelor furajere,
astfel de considerații sunt adesea mai puțin clare. Care este, de exemplu, habitatul natural pentru
un microorganism producător de fitază? Fitatul, un fosfat de stocare, este adesea o componentă
majoră a unor semințe, iar screening-ul microorganismelor în asociere intimă cu rădăcinile
semințelor germinative (rizosfera) ar fi o nișă adecvată de examinat. Timpul dintre colectarea
eșantionului de mediu și examinarea acestuia în laboratorul poate fi critic, deoarece schimbările
vor avea loc inevitabil. Chiar și în cele mai bine conservate probele, modificările chimice și
fizice pot duce la moartea unor organisme și la viabilitatea redusă a altora. Cu cât scade timpul,
cu atât mai grave pot fi aceste schimbări. Există multe avantaje în tratarea eșantionului imediat
pe teren, deoarece acest lucru poate duce la izolarea unei populații total diferite de microbi. Poate
fi util să se furnizeze „momeală” pentru microbi specifici sau tipuri de activități microbiene.

În plus față de îmbogățirea microorganismelor dorite, numărul de microbi nedoriti poate fi

redus. De fapt, prima problemă în procesarea eșantioanelor este adesea una de numere.
Composturile și solurile bogate în materie organică conțin un număr enorm de microbi. Este
necesară o anumită formă de diluare sau de direcționare a unor grupuri specifice. Tehnicile
selective pot implica, de exemplu, uscarea atentă a aerului a probei (solului), ceea ce reduce
numărul de bacterii Gram negative sau un scurt tratament termic la 80 °C, care ucide majoritatea
microorganismelor, dar lasă sporii rezistenți ai bacteriilor, cum ar fi Bacillus intact. Antibioticele
pot fi încorporate în mediul de creștere. De exemplu, bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile
la penicilină decât bacteriile Gram negative. Indiferent de strategia de screening adoptată, toate
aceste abordări se bazează pe o anumită formă de criterii de selecție pentru combinația organism-
activitate căutată. Cea mai largă metodele aplicate implică creșterea microbilor pe o placă de
agar care conține substratul enzimatic adecvat pentru detectarea activității enzimei dorite. Adesea
metodele utilizate sunt proprietare și constituie frecvent mai mult o artă decât o știință exactă. Cu
toate acestea, unele metode sunt bine înțelese. De exemplu, încorporând cazeina ca sursă unică
de carbon într-un mediu agar cu o suprafață opacă va dezvălui organismele secretoare de
protează ca un halou clar de cazeină hidrolizată în jurul coloniei în creștere. În mod similar,
activitatea lipazei poate fi monitorizată printr-o schimbare de culoare a unui indicator care
vizualizează scăderea pH-ului datorită eliberării acizilor grași dintr-un substrat lipidic.

Selecția microorganismelor este o etapă foarte critică în procesul de screening și poate fi destul
de subiectivă, mai ales dacă numărul implicat este foarte mare. Chiar dacă screening-ul a urmat o
anumită formă de proces de selecție, deseori nu este ușor de realizat distinge diferitele tipuri de
microorganisme care cresc pe un mediu agar. Acest lucru este valabil mai ales pentru bacterii,
care, cu excepția cazului în care sunt clar colorate, toate arată la fel. Acest lucru dă naștere unuia
dintre cele mai mari dezavantaje ale abordării aleatorii a izolării și screeningului tulpinilor
naturale: problema redundanței. Același microb va reapărea de mai multe ori din diferite
eșantioane colectate din locații diferite, iar acest lucru poate explica de ce atât de multe produse
provin dintr-o gamă foarte limitată de microbi. Până relativ recent, majoritatea strategiilor de
screening erau destul de conservatoare. Tendința de a utiliza medii bogate care favorizează
organismele cu creștere rapidă, care nu necesită nutriție, a dus la o accentuare excesivă a
anumitor grupuri de microorganisme. Acest lucru este asociat cu faptul că anumite genuri
fungice, cum ar fi speciile Aspergillus și Trichoderma, și speciile Bacillus și Pseudomonas
printre bacterii, au fost în mod tradițional o sursă bogată și dovedită de enzime comerciale.

Pentru a asigura o mai mare diversitate și ca măsură a cât de extins a fost un screening, este
necesară o estimare a biodiversității populației examinate. O serie de tehnici grupează rapid
colecțiile de tulpini necunoscute în grupuri de organisme înrudite. Modelele de proteine celulare
totale, polimorfismul amplificat al lungimii fragmentelor, ribotiparea, analiza restricționată a
ADN-ului ribozomal amplificat, regiunea distanțieră transcrisă PCR, polimorfismul
conformațional monocatenar combinat cu metode sofisticate de electroforeză și analiza
imaginilor pentru achiziția și calculul datelor pot furniza informații despre diversitatea o colecție
de tulpini. Astăzi, ușurința cu care se poate realiza secvențierea genei ARN ribozomal subunitar
mic (ssu rRNA), combinată cu o bază de date mare și în creștere pentru comparație, înseamnă că
anumite organisme pot fi deseori repartizate rapid unor grupuri taxonomice cunoscute, sau noi
microorganismele pot fi recunoscute. Gruparea organismelor în grupuri conexe de tulpini poate
fi combinată cu screeningul datelor de selecție, permițând astfel identificarea atributelor specifice
cu grupuri recunoscute de organisme. Aceste informații permit să se elaboreze proceduri speciale
pentru izolarea unui anumit grup țintă și impunerea unor criterii de selecție mai stricte. Chiar și
așa, este încă prea ușor să treceți cu vederea potențialele noi izolate, mai ales când vă confruntați
cu multe sute de feluri de mâncare culturale, fiecare conținând câteva sute de colonii microbiene
cu aspect similar. În zilele noastre, sarcina poate fi realizată de roboți de colectare a coloniilor și
sisteme de imagistică vizuală cuplate la computere. O problemă întâlnită adesea la începutul
procesului de screening este că izolatele microbiene naturale produc de obicei enzime importante
din punct de vedere comercial în concentrații extrem de scăzute. Manipularea mediului care
optimizează condițiile de creștere și producție este limitată de capacitatea maximă intrinsecă a
organismului de tip sălbatic. Manipularea genetică clasică prin selectarea mutanților cu
proprietăți îmbunătățite poate duce la o creștere a randamentului potențial. Tehnicile clasice de
mutație și selecție pentru microorganisme cu atribute îmbunătățite au fost aplicate de mai multe
decenii. Metodele moderne de biologie moleculară au accelerat posibilitățile de a crea în
laborator microorganisme cu activități noi sau îmbunătățite.
  Dezvoltare de molecule

Dacă o enzimă de plumb adecvată, de exemplu, o xilanază acidă, a fost identificată într-o
anumită specie, atunci se poate căuta enzime omoloage în specii înrudite. Procesul necesită
aplicarea geneticii inverse. Enzimele sunt polimeri ai aminoacizilor legați covalent într-o
secvență definită. Ordinea în care aminoacizii sunt aranjați în enzimă poate fi analizată printr-un
proces cunoscut sub numele de secvențiere N-terminală. Deoarece codul genetic este universal,
este posibil să se prezică secvența probabilă a bazelor nucleotidice din gena care codifică enzima
specifică. Folosind această informație se poate construi o sondă formată din 15 până la 20 de
nucleotide (set de primer) în secvența corectă, care, datorită naturii cu dublă helică a ADN-ului,
se va lega de catena complementară. Prin utilizarea setului de primeri în reacția de polimerizare
în lanț a polimerazei (PCR) pe ADN-ul cromozomial de la organisme înrudite, o genă omologă
poate fi amplificată și transferată la un organism gazdă, cum ar fi E. coli pentru exprimarea
produsului genetic, adică o enzimă omologă. În practică, procedura poate fi puțin mai complexă
decât este descrisă aici, dar este posibilă depistarea enzimelor cu funcționalitate identică (de
exemplu, o xilanază), dar cu o secvență semnificativ diferită de aminoacizi, prin care doar
elementele cruciale ale enzimei precum site-ul activ au fost conservate prin evoluție. În testele de
aplicare, aceste „noi” enzime pot avea proprietăți semnificativ diferite, cum ar fi temperatura
îmbunătățită sau stabilitatea pH-ului în comparație cu molecula de plumb. În acest fel, familii
întregi de organisme înrudite poate fi ecranat. Alternativ, ADN-ul microbian poate fi sondat cu
ADN care poartă o etichetă radioactivă sau fluorescentă printr-o tehnică numită hibridizare. Cu
toate acestea, toate metodele moleculare bazate pe screening-ul similarității au un mare
dezavantaj. Se bazează pe o comparație cu datele care au fost deja înregistrate.

 Screening genetic de mediu

Chiar dacă screeningul molecular este o tehnică foarte puternică, pare limitat de capacitatea de
a crește și extrage ADN adecvat din organismele țintă. De asemenea, este limitat la
microorganisme cunoscute care au fost izolate, descrise și depozitate în colecțiile de cultură. Cu
toate acestea, s-a estimat că mai puțin de 1% din toate microorganismele care există în natură au
fost izolate și chiar mai puține au fost caracterizate și descrise în mod adecvat. Se crede că mai
puțin de 25% din microbii dintr-o probă prelevată din mediu pot fi de fapt cultivate în laborator.
Pot exista numeroase motive pentru această porțiune „inculturabilă” a comunității microbiene.
Unele celule pot fi într-o fază de repaus, deteriorate sau moribunde; este posibil ca unii să nu fie
rezidenți adevărați și să nu facă parte din populația activă; alții pot fi oportunisti care așteaptă o
schimbare a condițiilor de mediu în favoarea lor; în timp ce altele pot avea cerințe necunoscute
pentru cultură care rămân nesatisfăcute în laborator.

Cultivarea în laborator are o puternică părtinire selectivă; tehnicile sunt foarte conservatoare și
abia s-au schimbat de 100 de ani. Cu toate acestea, suntem închiși în cadrul acestor constrângeri,
deoarece nu avem răspunsuri intelectuale la această problemă. Principala biodiversitate a vieții
este microbiană, distribuită în trei grupuri sau domenii de relaționare primare: Archaea, Bacteria
și Eukarya. Numărul speciilor de procariote valid descrise este de aproximativ 4500 și crește cu o
rată de 100-200 pe an. Studiile filogenetice ale secvențelor cultivate și de mediu ne-au extins în
mod substanțial aprecierea față de domeniul de aplicare al biodiversității bacteriene. Trei
rapoarte de cercetare seminale, publicate în 1990, au indicat că biodiversitatea bacteriană bazată
pe studii moleculare a fost semnificativ mai mare decât cea cunoscută din culturile pure. Dintr-
un studiu de reasociere ADN-ADN s-a estimat că un singur eșantion de sol forestier conține
aproximativ 12 000 de specii bacteriene. Celelalte două studii au raportat recuperarea
independentă de cultivare a secvențelor parțiale 16S rADN din bacterioplanctonul marin și din
izvoarele termale. Secvențele 16R rNAr tratate nu s-au potrivit cu cele ale bacteriilor cultivate
cunoscute și, prin urmare, au furnizat dovezi pentru numeroase bacterii încă necunoscute. O
examinare mai recentă a ADN-ului de mediu derivat din diverse habitate a relevat, pe lângă o
vastă biodiversitate a microorganismelor care nu au fost încă cultivate, că este posibil ca
microorganismele cultivate să nu fie flora dominantă în aceste medii și acest lucru oferă o
provocare suplimentară metode de cultura de imbogatire.

Acum, după aproape un deceniu de recuperare directă a secvenței ARNr din mediul natural,
sunt rezolvate aproape 40 de diviziuni bacteriene distincte. Doar patru dintre aceste diviziuni
reprezintă 90% din totalul bacteriilor cultivate (Proteobacteria). Pentru peste 15 dintre diviziunile
bacteriene, nu se cunoaște niciun organism în cultură, iar pentru alte 15 diviziuni, unul sau doi
reprezentanți cultivi sunt susținuți doar de amprenta secvenței de mediu. Diferențele filogenetice
dintre diviziunile bacteriene se reflectă probabil în diferențe fiziologice substanțiale.

Din fericire, evoluțiile tehnologice recente au permis accesul la cel puțin o parte din acești
microbi necultivați. Este posibil să se extragă ADN sau chiar ARN direct din comunitatea
microbiană prezentă într-o probă luată din mediu. Deși există multe tehnici de extragere a ADN-
ului cromozomial din comunitățile microbiene naturale, nu toate celulele sunt la fel de
susceptibile la liză, iar ADN-ul nu se recuperează niciodată la 100%. O altă preocupare este
detectarea organismelor care formează doar o proporție minoră din comunitatea totală. ADN-ul
lor va fi subreprezentat, cu excepția cazului în care se depun eforturi pentru a normaliza proba.
ADN-ul din mediu poate fi testat pentru gene cunoscute utilizând tehnicile moleculare descrise
mai sus. Acest lucru necesită ADN de bună calitate, deoarece screening-ul PCR este deosebit de
sensibil la perturbarea substanțelor contaminante din mediu. Alternativ, ADN-ul din mediu poate
fi tăiat în fragmente mai mici utilizând enzime de restricție, iar fragmentele clonate într-o gazdă
de expresie, cum ar fi E. coli. La fel, ARN de mediu poate fi utilizat pentru a construi biblioteci
de expresie ADNc. Clonele pot fi apoi testate pentru gene care codifică enzimele într-un mod
similar cu multe dintre tehnicile descrise pentru screeningul izolatelor microbiene naturale,
permițând astfel detectarea activităților dorite codificate de gene care ar putea prezenta doar o
similitudine limitată sau gene deloc cunoscute.

 Genomic Screening

S-au făcut progrese spectaculoase în secvențierea directă a nucleotidelor unei catene de ADN.
Deja există milioane de secvențe genetice în bazele de date publice. Întregul genomilor din peste
800 de organisme poate fi găsit în baze de date publice precum Entrez Genomi. Genomii
reprezintă atât organisme complet secvențiate, cât și cele pentru care secvențierea este în curs.
Toate cele trei domenii principale ale vieții - bacterii, arheele și eucariote - sunt reprezentate,
precum și mulți viruși și organite. În prezent (2006) 302 procariote (279 bacterii și 23 arhaea)
genomii și mai multe genomuri eucariote microbiene au fost secvențiate în întregime, iar
secvențierea a mai mult de 20 de genomi microbieni este în desfășurare. Inițial, speciile patogene
erau principalul obiectiv al proiectelor de secvențiere microbiană, dar și mulți microbi cu
potențial industrial sunt secvențați. De exemplu, genomii microbilor termofili, alcaliphilici,
acidofili și toleranți la sare au fost secvențați. Acest lucru ilustrează convingerea generală că
analiza genomului va dezvălui mecanismele care stau la baza stilurilor de viață respective ale
acestor microbi, ajută la identificarea enzimelor extremofile relevante din punct de vedere
industrial și, posibil, permit recunoașterea regulilor generale ale proteinelor care duc la
performanțe enzimatice în condiții extreme. Atunci când este disponibilă o secvență de genom
microbian, genele care codifică proteinele pot fi identificate pe bază de calcul prin esențial două
metode diferite.O metodă de calcul mai fiabilă folosește similitudinea cu o genă
proteincodificatoare într-un alt organism pentru a identifica gene noi. Această din urmă metodă
depinde, totuși, de disponibilitatea genelor omoloage, dar are ca avantaj adăugat capacitatea de a
indica funcția genei. Deoarece genele procariote se suprapun frecvent unele cu altele, predicția
exactă este notoriu dificilă și, ca rezultat, numărul real de gene de codificare proteică pentru
genomii microbieni secvențați rămâne discutabil.

Cantitatea enormă de date de secvență din domeniul public a condus la apariția bioinformaticii,
care poate fi definită ca interfața dintre științele biologice și științele computaționale.
Bioinformatica utilizează instrumente de calcul pentru a organiza și analiza datele biologice și își
propune să extragă informații și cunoștințe biologice. Exemple tipice includ identificarea genelor
omoloage sau a domeniilor proteice specifice și transferul de cunoștințe funcționale asociate cu
acești omologi sau domenii pentru a prezice funcția noilor gene. De exemplu, căutarea
similarității la nivelul genei permite screening-ul in silico pentru enzime. Rețineți, totuși, că
datele secvenței nu sunt cu siguranță impecabile și, prin urmare, o rată considerabilă de eroare ar
trebui luată în considerare în analiză. Frecvența erorilor poate fi redusă prin integrarea
informațiilor suplimentare care pot fi extrase din date genomice sau experimentale. Alte metode
de calcul care folosesc secvențele genomice disponibile pentru a deduce funcția se bazează pe,
de exemplu, gruparea genomică a genelor funcționale, filogenetică, alinierea căii metabolice și
abordări combinate. În ciuda unor astfel de instrumente puternice, aproximativ 25% din genele
putative dezvăluite de proiectele totale de secvențiere a genomului nu pot fi atribuite în prezent o
funcție deoarece arată doar omologie altor gene neanotate. Alți 25% din gene au o funcție
necunoscută și par a fi unice pentru speciile lor. În schimb, aproape 40% din activitățile
enzimatice bine definite cărora li s-au atribuit numere specifice de E.C. nu sunt încă asociate cu
secvențele genetice publicate. Aceste date indică faptul că resursele pentru screeningul enzimelor
noi sunt încă în mare parte neexploatate. Au fost dezvoltate mai multe noi tehnologii
experimentale cu randament ridicat care vizează identificarea funcțiilor acestor gene
orfane.Printre altele, au fost inițiate studii de expresie și structurale pentru a determina dacă
astfel de gene codifică proteine ‘‘ ipotetice ’’ cărora li se poate atribui o funcție specifică .

Au fost dezvoltate multe metode care utilizează pierderea funcției, localizarea celulară,
interacțiunea proteinelor sau momentul exprimării pentru a prezice funcția pentru proteinele noi
și pot fi revendicate ca instrumente pentru așa-numita genomică funcțională. De exemplu, o mare
varietate de tehnici sunt disponibile pentru a perturba genele, aleatorii sau dirijate, la scară largă
în practic orice organism . Analiza fenotipică ulterioară, destul de similară cu screeningul izolat
natural, permite determinarea funcțiilor biologice putative ale proteinele inactivate. Unele dintre
metodele de întrerupere a genelor permit, de asemenea, analiza localizării proteinelor, ceea ce
poate ajuta la adnotarea funcțională. Analiza la scară largă a interacțiunilor proteice prin abordări
genetice cu 2 hibrizi sau biochimice / spectrometrice de masă a fost, de asemenea, utilizată
pentru a atribui funcția. În plus, metodele de calcul s-au dovedit reușite în prezicerea interacțiunii
funcționale între proteine.

Până în prezent, totuși, analiza transcrierii la nivelul genomului a apărut ca cel mai utilizat
instrument pentru genomica funcțională. Pe baza presupunerii că proteinele cu funcții similare
prezintă o reglare similară, datele de transcriere pot fi utilizate pentru clasificarea funcțională a
genelor. Microarrays-urile de oligonucleotide sau gene întregi care reprezintă genomul complet
pot fi hibridizate cu ADNc marcate diferențial obținute din celule separate sau stări celulare.
Comparația profilurilor de transcriere indică reglarea expresiei genelor ca urmare a modificărilor
condițiilor celulei. Alternativ, expresia diferențială a proteinelor poate fi urmărită, de asemenea,
direct la nivelul proteinelor - deși încă cu un debit mai mic - în loc de evaluare indirectă prin
analiza transcripției. Co-reglarea genelor (sau proteinelor) poate fi apoi utilizată pentru a
identifica gene relevante pentru un anumit proces celular. Proiectarea unui microarray de ADN
cu genom întreg pentru un microb complet secvențiat este simplă din punct de vedere
conceptual. Aranjarea simultană a mai multor matrici de ADN poate crește și mai mult fluxul de
analiză a expresiei. De exemplu, nivelurile de expresie a peste 6000 de gene umane în 49 de
tipuri de celule diferite au fost detectate recent într-un singur experiment de hibridizare. Există
multe alte aplicații pentru utilizarea microarrays-urilor de ADN pe lângă profilul de transcriere.

 Proteomic Screening

Abordările de genomică funcțională menționate mai sus sunt în mod clar foarte valoroase, dar
ele încă deduc funcția proteinelor indirect. Testele directe pentru funcție necesită expresia
highthroughput a genelor identificate, urmată de analiza funcțională a proteinelor purificate.
Această abordare introduce noi provocări în ceea ce privește exprimarea proteinelor, inclusiv
necesitatea clonării și purificării cu debit ridicat. Multe tehnologii noi care facilitează astfel de
abordări la scară largă nu se limitează la întregul complement al genomului secvențial,
proteomul, dar pot fi adaptate pentru analiza funcțională a unui număr mare de proteine
recombinante, de exemplu, cele codificate de cDNA sau de bibliotecile de mediu. Deși orice
genă poate fi proiectată pentru a modifica anumite locuri de restricție și pentru a facilita clonarea
într-un vector adecvat, acest proces nu poate fi efectuat în mod eficient atunci când se ocupă cu
seturi mari de gene. Pentru a eluda acest lucru, au fost elaborate mai multe strategii de clonare
mediate de recombinare, care permit clonarea flexibilă în mai mulți vectori diferiți. Purificarea
proteinelor cu debit ridicat necesită fuziune cu etichete specifice de afinitate care facilitează
purificarea, imunolocalizarea și/sau imuno-precipitarea. Fuziunile proteice au fost, de asemenea,
utilizate pentru a îmbunătăți secreția și solubilitatea proteinelor mici sau cu solubilitate scăzută.
Deși adăugarea de etichete ar putea afecta funcția proteinelor, ele facilitează puternic detectarea
și purificarea și pot permite afișarea sau imobilizarea suprafeței celulare pe margele sau orice alt
suport. Câteva exemple interesante de screening proteomic au fost raportate la sfârșitul anilor
1990 și începutul anilor 2000. Bazine de proteine de fuziune purificate au fost evaluate pentru
diferite activitățile enzimatice, iar după deconvoluție, activitățile specificate ar putea fi atribuite
genelor orfane. Într-o abordare legată de aproape toate kinazele proteice din drojdie de
panificație au fost aranjate în microwells și analizate simultan prin utilizarea a 17 substraturi
diferite. Proteinele purificate au fost imprimate pe aceste diapozitive și ecranate pentru
capacitatea lor de a interacționa cu proteinele și fosfolipidele.Sondarea cipurilor proteome a dat
multe interacțiuni funcționale noi. În două studii independente proteinele de fuziune au fost, de
asemenea, folosite pentru a purifica și caracteriza complexele multiproteine la o scară fără
precedent. Într-un studiu asociat, s-a demonstrat că un complex multiproteină marcat cu TAP
purificat cu afinitate și-a păstrat activitatea .

2. Ingineria proteinelor

 Introducere

Ingineria proteinelor utilizează o combinație de seturi de instrumente care permit înlocuirea

oricărui aminoacid din secvența de aminoacizi a unei proteine cu unul dintre ceilalți 19
aminoacizi naturali ai proteinelor pentru a-și schimba proprietățile. Codul genetic poate fi, de
asemenea, extins prin introducerea de aminoacizi nenaturali într-o proteină. Aceste modificări
pot fi direcționate către o poziție sau pot fi de-a lungul întregii secvențe primare.

Stabilirea ingineriei proteinelor ca tehnologie nouă a fost permisă prin apariția tehnologiei
ADN-ului recombinant, însoțită de îmbunătățirea continuă a determinării structurii 3D prin
cristalografie cu raze X și spectroscopie RMN. Până în 1980, posibilitățile de schimbare a unei
enzime s-au limitat la modificări chimice, care sunt limitate la lanțurile laterale reactive ale
aminoacizilor și nu sunt nici regio- nici specifice locului.

Tehnologia ADN-ului recombinant a revoluționat modificarea proteinelor în mai multe moduri.

Acum nu este posibil doar să înlocuiți un anumit aminoacid cu unul dintre ceilalți nouăsprezece,
dar aceste modificări sunt, de asemenea, permanente. Materialul nou al proteinei modificate de
aceeași calitate este disponibil pur și simplu prin fermentarea repetată a organismului de
producție, urmată de purificare. În plus, enzimele produse în sistemele recombinante sunt
disponibile în cantități mai mari și puritate mai mare. Acest lucru, la rândul său, facilitează
determinarea structurilor proteice 3D și, astfel, crește baza de cunoștințe pentru experimente
suplimentare de inginerie a proteinelor.

Ambele tehnologii pentru determinarea structurii proteinelor, cristalografia cu raze X și

spectroscopia RMN au beneficiat de disponibilitatea unor cantități mai mari de proteine pure, dar
fără dezvoltarea simultană a metodelor fizice, cantitatea uriașă de date structurale nu ar fi
disponibilă în prezent. Calitatea datelor cu raze X a fost îmbunătățită prin evoluția hardware a
surselor tradiționale de fascicule cu raze. Spectroscopia RMN a câștigat din dezvoltarea unor
magneți mai buni care permit o mai bună separare a semnalelor și determinarea mai fină a
schimbărilor chimice ale atomilor. Sistemele informatice grafice au deschis calea pentru
stabilirea bazei de cunoștințe importante pentru ingineria proteinelor, stabilirea relației funcției
de structură. Până atunci a fost posibilă doar studierea evenimentelor din jurul catalizei
enzimatice prin interpretarea datelor cinetice în diferite condiții, dar cu disponibilitatea datelor
structurale și a computerelor grafice mai ieftine pentru vizualizare,a devenit posibil să se
raționalizeze observarea la detaliu atomic prin combinarea datelor experimentale și structurale.

Pe lângă cunoștințele structurale, generarea mutanților este un aspect major al experimentelor

de inginerie proteică. În zilele mai vechi, majoritatea experimentelor mutaționale au fost
efectuate prin așa-numita mutageneza casetei, o tehnică cu care toți cei nouăsprezece aminoacizi
naturali posibili ar putea fi substituiți într-un anumit loc. Din aceste studii s-au constatat variante
care au modificat specificitatea substratului care au arătat o specificitate crescută de până la 1000
de ori prin introducerea unei singure mutații. În plus, valorile pK ale reziduurilor catalitice ar
putea fi modificate, iar profilurile ratei pH-ului ar putea fi adaptate la modelul de performanță
dorit. Această tehnică a permis generarea de mutații orientate către site și de mici bănci de
mutageneză aleatorie în regiuni definite ale moleculelor. Folosind această tehnică, numeroase
site-uri din apropierea subsite-urilor critice au fost determinate și evaluate în subtilizină. Trei
modificări ale aminoacizilor au fost suficiente pentru a interschimba specificitățile dintre
subtilizinele conexe, în timp ce în tripsină au fost necesare numeroase modificări în plus față de
poziția 189 de lanțuri laterale pentru a interschimba specificitățile tripsină și chymotripsină.

Aceste eforturi indică o altă temă recurentă în ingineria proteinelor moderne, și anume
exploatarea diversității naturale pentru orientare în selectarea siturilor și a substituțiilor.
Diversitatea naturală este rezultatul a milioane de ani de adaptare la diferite extreme ale
condițiilor, ar fi temperatura, pH-ul și substraturile. Într-o anumită clasă de enzime, modelul
general de pliere terțiară este adesea foarte conservat și, prin urmare, este posibil să se asocieze
modificări care pot fi adesea introduse în anumite poziții și să se asocieze substituții specifice cu
modificări specifice ale profilurilor de performanță și ale specificităților substratului. Tema
exploatării diversității naturale reapare în tehnicile utilizate cel mai frecvent, fie pentru selectarea
rațională a siturilor și substituțiilor, fie prin recombinare ca mijloc de extindere a diversității.

 Tehnici de mutageneză
După recunoașterea faptului că tehnologia ADN-ului recombinant ar putea fi folosită pentru a
modifica secvența și, prin urmare, funcția unei enzime prin modificarea codificării secvenței
ADN pentru proteină, următoarea avansare a venit odată cu apariția mutagenezei casetei.
Prelevarea completă de probe a tuturor substituțiilor naturale de aminoacizi a devenit realizabilă.
Cu acest instrument, repertoriul complet al diversității a fost acum disponibil pentru evoluția
moleculară, cel puțin un site la un moment dat.Cam în același timp, a fost introdusă ideea
scanării alaninului. În acest model, multe site-uri ar putea fi examinate prin înlocuirea
reziduurilor de aminoacizi existente cu alanin. În acest caz, diversitatea caută să identifice site-
uri care pot juca un rol important pentru funcționarea enzimei. În această abordare, site-urile
potențiale sunt analizate, care pot fi explorate ulterior prin analiza structurală și/sau generarea
diversității.

Descoperirea reacției în lanț a polimerazei predispuse la erori (PCR) a fost prima revoluție în
generarea de variante enzimatice. De fapt, PCR permite atât producerea de variante de proteine
orientate spre site-ul și generarea de biblioteci variante aleatorii peste întreaga genă sau părți
definite ale acesteia. Frecvența mutațiilor experimentelor PCR predispuse la erori poate fi
determinată de condițiile de reacție și de alegerea polimerazei.O altă metodă pentru generarea
diversității moleculare la nivel genetic este amestecarea genelor . În experimentele de amestecare
a genelor, un set de gene omogene este grupat și tăiat în bucăți. În cele din urmă fragmentele sunt
recombinate aleatoriu într-o PCR. Ca rezultat, se obține o bibliotecă de variante enzimatice care
permite explorarea combinațiilor tuturor variațiilor naturale care au fost distribuite de-a lungul
genelor din setul de intrare. Variațiile nu permit numai testarea variațiilor aminoacizilor
individuali, ci și efectul inserțiilor sau ștergerilor de aminoacizi între diferitele proteine.

Capacitatea de a identifica variantele potrivite pentru un anumit scop determină succesul un

experiment de inginerie a proteinelor. O variantă orientată spre site este, desigur, ușor de
caracterizat, dar proiecția unei biblioteci aleatorii necesită cunoștințe excelente despre test care
este utilizat pentru screening.

Afișarea de proteinelor fage a devenit un instrument important pentru screening-ul și selectarea

proteinelor. Într-o abordare de afișare a fagului, gena care codifică proteina care urmează să fie
proiectată este legată de una dintre genele care codifică proteinele de suprafață ale
fagului.Deoarece este la suprafață, proteina afișată poate fi selectată pentru legarea la o anumită
țintă. Afișajul Phage permite selectarea a peste 109 variante pentru legare într-un singur
experiment. În plus, proteina selectată este întotdeauna izolată în combinație cu gena care o
codifică. Gena poate fi înmulțită cu infecția unui organism gazdă cu fagul, urmată fie de
secvențiere, fie de un ciclu ulterior de mutageneză/selecție.

În cele din urmă, importanța tehnologiei de screening a crescut în ultimii ani. În principal,
automatizarea în combinație cu miniaturizarea testelor până la scale microscopice a dus la
trecerea de la mutații pure orientate către experimente de mutageneza aleatorie dirijate de regio,
urmate de screening-ul intensiv al bibliotecii de variante. Utilizarea cea mai cuprinzătoare de
inginerie de proteine este cunoscut sub numele de evoluția dirijată, evoluția moleculară și
reproducerea moleculară. Comună acestor abordări este urmărirea iterativă a etapelor de
randomizare și selecție. Evoluția dirijată imită procesul evolutiv natural în laborator. Acesta
poate fi foarte de succes, deoarece laboratorul permite o presiune selectivă nenaturală să fie
aplicate pentru a direcționa îmbunătățirea succesivă a unei anumite enzime pentru a îmbunătăți
performanța sa într-un mediu tehnic. Evoluția dirijată s-a dovedit a fi foarte reușită. Adesea, trei
sau mai puține cicluri iterative de randomizare și selecție pentru o proprietate dorită poate realiza
îmbunătățiri enorme. Acest succes poate fi explicat în principal prin faptul că influențele
directivei evoluției naturale nu forțează o moleculă să funcționeze bine, de exemplu, într-o
mașină de spălat rufe.

 Aplicarea ingineriei proteinelor în mediul academic și industrial

Atât comunitatea științifică academică, cât și oamenii de știință industriali au îmbrățișat noile
tehnologii de inginerie a proteinelor atunci când acestea au devenit disponibile în a doua
jumătate a anului 1980. În mediul academic, ingineria proteinelor este utilizată pe scară largă
pentru elucidarea proprietăților intrinseci ale proteinelor și enzimelor, ar fi stabilitatea,
mecanismul catalitic și activitatea în diferite condiții. Oamenii de știință industriali se
concentrează pe inginerie pentru îmbunătățirea performanței enzimelor în aplicații industriale.

 Descifrarea mecanismului catalitic

Ingineria proteinelor poate fi utilizată pentru a identifica aminoacizi care participă la mecanismul
catalitic, înainte sau chiar după disponibilitatea informațiilor structurale 3D. Cele mai
cuprinzătoare studii privind mecanismele enzimatice prin inginerie proteică au fost efectuate pe
tirozil-ARNt sinteza începând cu anul 1980 [408]. Ancheta completă a fost rezumată în altă
parte. Ingineria proteinelor a fost, de asemenea, utilizată pentru identificarea siturilor active în
proteine, de exemplu, în lipaze. Principiul nucleofil în lipaza sensibilă la hormoni a fost
identificat prin analiza secvențială a segmentului caracteristic GXSXG al pliului α/βhidrolazei și
înlocuirea ulterioară a serinei 423 cu mai mulți alți aminoacizi. Deoarece toate variantele nu au
avut deloc activitate, autorii au putut concluziona că serine 423 este într-adevăr site-ul activ
serine al acestei lipaze . Alte grupuri au identificat în experimente similare întreaga triadă
catalitică de lipaze diferite.

 Stabilitatea enzimelor

Stabilitatea intrinsecă a proteinelor și influența aminoacizilor unici asupra stabilității proteinelor

au fost investigate cu inginerie proteică. Deoarece efectul de a schimba un aminoacid asupra
structurii proteinelor depinde de poziția sa în structura proteinelor, este necesar să se utilizeze
modelul potrivit și să planifice mutația pe baza structurii 3D a proteinei respective.O cale către o
proteină mai stabilă este introducerea legăturilor disulfurice prin mutageneza direcționată pe site.
În subtilizină, o enzimă fără reziduuri de cisteină,introducerea cisteinei pentru serine sau alanin
la pozițiile 22 și 87 sau 24 și 87 a dus la formarea de punți disulfide, dar a produs enzime cu
puține sau deloc îmbunătățirea stabilității globale. Influența înlocuirilor de aminoacizi unici a
fost studiată în detaliu cu mai multe proteine model. Studiile arată în mod clar că influența unui
aminoacid asupra stabilitatea helixului depinde de poziția sa intrahelică, poziția helixului în
structura proteinelor globulare și accesibilitatea solvenților la locul mutației. Doar 17 aminoacizi,
împrăștiate pe întreaga secvență, diferă în aceste proteine, care au aceeași structură 3D, dar diferă
în stabilitate. Cu toate acestea, o combinație de doar șase dintre aceste mutații a creat o proteină
mai stabilă decât oricare dintre moleculele mamă, fără a afecta activitate. Acest studiu arată că o
simplă comparație a secvențelor și structurilor 3D ale enzimelor din organismele mezofilice și
termofile nu vor conduce la identificarea stabilizarea modificărilor aminoacizilor, deoarece
natura echilibrează mai multe efecte în timpul evoluției pentru a obține un set de enzime care
este suficient de bun pentru scopul său.

 Aplicații industriale

Enzimele au fost încorporate cu succes în prelucrarea amidonului. În prima etapă, a-amilaza

este utilizată pentru a descompune amidonul în oligozaharide. În procesul comercial enzima
trebuie să supraviețuiască trecerii prin un jet de abur la 105 ˚C, care este necesar pentru a
exploda granule de amidon, și funcția de la 90 ˚C timp de 1–2 ore. Cu amilaza naturală preferată,
B. licheniformis a-amilază (BLA), pH-ul trebuie ajustat la 6 și apoi reajustat în etapele
următoare. O a-amilază proiectată care ar funcționa la un pH mai scăzut ar economisi timp și
bani considerabili, eliminând necesitatea ajustării pH-ului. Analiza BLA în funcție de pH a
indicat faptul că stabilitatea enzimei a fost redusă la un pH mai mic.Inițial, mutageneza aleatorie
și screening-ul a fost efectuat în absența unui model fiabil al și au fost identificate mai multe
variante. Odată ce o structură a devenit disponibilă s-a observat că variantele reprezentau
substituiri care existau între a-amilaze. Surprinzător, a-amilazele asociate au avut o stabilitate
generală mai mică decât BLA. Au fost identificate alte cinci reziduuri, fiecare dintre acestea a
crescut stabilitatea enzimei și ar putea fi combinată cu o creștere cumulativă a stabilității prin un
factor de 23. Astfel, enzima a fost proiectată pentru a fi mai activă și stabilă sub aceste condiții.
Unul dintre cele mai benefice rezultate a fost mutațiile din care susceptibilitatea la oxidanții
găsiți în agenții comerciali de albire a fost eliminată. Acest lucru a fost realizat în primul rând
prin înlocuirea unui reziduu de metionină sensibil la înălbitor.

 Investigații privind plierea proteinelor

Aplicarea ingineriei proteinelor pentru disecția căilor de pliere a proteinelor a fost revizuită.
Numărul de tehnici experimentale diferite care au fost utilizate în acest scop în mod clar
subliniază natura interdisciplinară a ingineriei proteinelor.

 Schimbarea specifiității substratului enzimelor

Utilizarea enzimelor ca biocatalizatori pentru reacțiile chimice și-a recăpătat recent interesul.
Au fost realizate cu succes mai multe proiecte de inginerie proteică. Aceștia au aplicat în
principal diferite abordări de evoluție direcționată pentru a-și demonstra capacitățile pentru
dezvoltarea și îmbunătățirea noilor biocatalizatori. Activitatea subtilizinei E în DMF apos a fost
îmbunătățită prin ingineria proteinelor. Subtilisinele au doar activitate scăzută și stabilitate
redusă în DMF. Autorii au reușit să sporească stabilitatea în 40% DMF mai mult decât dublu.
Dar și mai important este îmbunătățirea activității care a fost realizată de ciclurile de evoluție
ulterioare. Molecula finală a arătat o îmbunătățire a activității de 471 de ori în 60% DMF pe un
substrat testat comparativ cu molecula de tip sălbatic. Capacitatea de a modifica gama
substratului și selectivitatea prin metode de inginerie proteică a fost demonstrată de mai mulți
autori. Succesul ingineriei enzimelor enantioselective demonstrează în cele din urmă că
tehnologiile de inginerie a proteinelor din zilele noastre pot chiar aborda cele mai subtile
probleme din sinteza chimică. În mai multe studii pe diferite enzime s-a demonstrat că este
posibil să se protejeze enzimele pentru a obține o enantioselectivitate îmbunătățită, în principal
pentru reacțiile de hidroliză.

 Perspective

Există asemănări între evoluția naturală și cea dirijată, diferența fiind în mare parte în
gestionarea diversității. Ingineria proteinelor a fost întotdeauna o evoluție direcționată, unde
screeningul și gestionarea diversității intervin în locul selecției naturale. Chiar și acum
cunoașterea structurii tridimensionale și a relației acesteia cu funcția este adesea esențială în
localizarea siturilor și regiunilor critice pentru diversitate concentrată și recrutare. Tehnicile de
amestecare a ADN-ului folosesc din nou strategii de screening pentru a combina caracteristicile
dintre genele naturale selectate într-un efort de recombinare sau recrutare a caracteristicilor
dorite într-o familie de enzime. Acum, având cunoștințe despre genomii întregi și compararea
așteptată a genomului speciilor înrudite, ar putea fi posibil să se realizeze amestecarea silico și
probabil să se înțeleagă preferințele inerente asupra evoluției moleculare individuale impuse de
metabolomul organismelor - ansamblul funcțiilor moleculare necesare pentru menținerea
metabolismului și reproducerea în întregul organism. Un alt element al evoluției direcționate in
silico este cerința de a putea prevedea structura tridimensională și cu aceasta în continuare să
poată recunoaște potențialele catalitice și chiar să deducă rolul fiziologic probabil al acelei
molecule în cadrul metabolomului.

Bibliografie:

1. Enzymes in Industry, Edited by W. Aehle