Descoperirea și dezvoltarea enzimelor

1.Screening enzimatic

 Prezentare generală

Screeningul și selecția sunt procese timpurii în ciclul de cercetare și dezvoltare al unui produs.
În esență, aceasta înseamnă căutarea unei anumite gene care codifică enzima țintă. În trecut,
aceasta a implicat exclusiv screeningul microorganismelor vii (screening microbian clasic), dar
cu aplicarea instrumentelor moderne de biologie moleculară, screeningul poate fi efectuat fără a
fi nevoie să cultive organismele implicate. Ca și în cazul tuturor metodelor, există limitări și o
combinație de tehnici (screening combinatorial) oferă adesea cel mai mare succes.

Cel mai satisfăcător punct de plecare pentru procesul de căutare și descoperire este bogata
diversitate de microorganisme din natură . Rareori se apreciază că pentru 85% din istoria
Pământului, viața a fost limitată la forme microbiene. Diversitatea metabolică creată de aceasta
este cu adevărat imensă. Pe parcursul a peste patru miliarde de ani de evoluție, au apărut enzime
care sunt perfect adaptate pentru menținerea proceselor celulare. Cu toate acestea, multe enzime
trebuie să funcționeze într-un mediu care este departe de condițiile fiziologice naturale și poate
implica chiar expunerea la substanțe chimice cunoscute că degradează sau denaturează enzimele,
ceea ce duce la pierderea activității. De obicei, strategiile de screening și selectare a enzimelor se
bazează pe cunoașterea aplicației și a condițiilor fizice și chimice în care enzima trebuie să
funcționeze. Prin urmare, selecția pentru performanța enzimei în condițiile de aplicare este un
pas esențial timpuriu în procesul de screening. Accesul la un fond mare de gene este o altă
condiție prealabilă pentru un program de screening de succes. Abordările pot implica examinarea
nediscriminatorie a materialului eterogen (de exemplu, solul) adunat din mediu sau o abordare
ecologică cu o examinare țintită a habitatelor specifice în care este probabil să se găsească o
anumită activitate.

Strategiile pot fi adoptate pentru a căuta în mod specific în zonele prost explorate medii în scopul
de a accesa o variație mai mare a genomilor de la microbi noi. În căutarea unor gene noi,
explorarea mediilor extreme, cum ar fi izvoarele termale vulcanice, lacurile hipersaline și solurile
polare, au produs multe microorganisme noi cu proprietăți deosebite. Alternativ, o abordare
bazată pe taxonomie care implică un studiu sistematic al organismelor cunoscute poate fi, de
asemenea, plină de satisfacții. Prin combinarea screeningului enzimatic cu tehnici moderne, cum
ar fi ingineria proteinelor și evoluția dirijată, moleculele hibride cu o performanță îmbunătățită în
condiții specifice de aplicarepoate fi găsit. Acest capitol va descrie diferitele metode de screening
utilizate în prezent în industrie pentru a obține enzime cu proprietățile dorite.

 Screening natural izolat

Materialul sursă pentru descoperirea enzimelor poate fi materia vegetală sau animală și
microbii, atât procariotele (de exemplu, bacterii și arhee), cât și eucariotele (de exemplu, drojdii
și ciuperci). Microorganismele sunt sursa principală pentru enzimele industriale. Metoda clasică
de screening a izolatelor microbiene naturale este un proces bine stabilit care își are rădăcinile în
descoperirea antibioticelor (de exemplu, peniciline, streptomicină) în deceniile de după 1945.
Aceasta implică examinarea a mii de probe de soluri, materiale vegetale etc., și izolarea aleatorie
și screeningul florei microbiene rezidente. Deși este capabil de automatizare semnificativă,
capacitatea de transfer determină în mare măsură viteza de progres. În trecut, strategiile de
screening folosind eșantioane de sol ca punct de plecare erau extrem de empirice, dar se poate
face mult pentru a reduce necesitatea unei experimentări extinse. Aceste procese implică
supunerea unui eșantion de mediu (de exemplu, sol) la presiune selectivă folosind principiile
culturii de îmbogățire prin manipularea condițiilor de creștere astfel încât numai
microorganismele care exprimă o anumită enzimă să poată crește și supraviețui.

Un rezultat reușit poate fi îmbunătățit printr-o alegere judicioasă a mediului pentru examinare, de
exemplu, soluri acide, turbării și gunoi de pădure.

O abordare ecologică profită de presiunea naturală selectivă a mediului. De exemplu, un mediu

alcalin, cum ar fi un lac de sodă la pH 9, este locuit doar de microorganisme alcalifile. Este
probabil ca aceste organisme să aibă enzime extracelulare care sunt stabile și au performanțe
optime la pH ridicat, iar acesta este într-adevăr cazul. Pentru screeningul enzimelor furajere,
astfel de considerații sunt adesea mai puțin clare. Care este, de exemplu, habitatul natural pentru
un microorganism producător de fitază?
Fitatul, un fosfat de stocare, este adesea o componentă majoră a unor semințe, iar screening-ul
microorganismelor în asociere intimă cu rădăcinile semințelor germinative (rizosfera) ar fi o nișă
adecvată de examinat. Timpul dintre colectarea eșantionului de mediu și examinarea acestuia în
laboratorul poate fi critic, deoarece schimbările vor avea loc inevitabil. Chiar și în cele mai bine
conservate probele, modificările chimice și fizice pot duce la moartea unor organisme și la
viabilitatea redusă a altora. Cu cât scade timpul, cu atât mai grave pot fi aceste schimbări. Există
multe avantaje în tratarea eșantionului imediat pe teren, deoarece acest lucru poate duce la
izolarea unei populații total diferite de microbi. Poate fi util să se furnizeze „momeală” pentru
microbi specifici sau tipuri de activități microbiene.

Un exemplu al acestei îmbogățiri in situ este plasarea scamelor de bumbac într-un mediu precum
sedimentul lacului și preluarea probei la o dată ulterioară. Eșantionul poate fi apoi dus înapoi la
laborator și testat pentru activitate celulolitică. Multe alte tehnici de îmbogățire au fost dezvoltate
empiric, cum ar fi utilizarea apei sau a chitinei-agar pentru izolarea actinomicetelor cu creștere
lentă și astfel de idei sunt nelimitate.

În plus față de îmbogățirea microorganismelor dorite, numărul de microbi nedoriti poate fi redus.
De fapt, prima problemă în procesarea eșantioanelor este adesea una de numere. Composturile și
solurile bogate în materie organică conțin un număr enorm de microbi. Este necesară o anumită
formă de diluare sau de direcționare a unor grupuri specifice. Tehnicile selective pot implica, de
exemplu, uscarea atentă a aerului a probei (solului), ceea ce reduce numărul de bacterii Gram
negative sau un scurt tratament termic la 80 °C, care ucide majoritatea microorganismelor, dar
lasă sporii rezistenți ai bacteriilor, cum ar fi Bacillus intact. Antibioticele pot fi încorporate în
mediul de creștere. De exemplu, bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile la penicilină decât
bacteriile Gram negative. Indiferent de strategia de screening adoptată, toate aceste abordări se
bazează pe o anumită formă de criterii de selecție pentru combinația organism-activitate căutată.
Cea mai largă metodele aplicate implică creșterea microbilor pe o placă de agar care conține
substratul enzimatic adecvat pentru detectarea activității enzimei dorite. Adesea metodele
utilizate sunt proprietare și constituie frecvent mai mult o artă decât o știință exactă. Cu toate
acestea, unele metode sunt bine înțelese. De exemplu, încorporând cazeina ca sursă unică de
carbon într-un mediu agar cu o suprafață opacă va dezvălui organismele secretoare de protează
ca un halou clar de cazeină hidrolizată în jurul coloniei în creștere. În mod similar, activitatea
lipazei poate fi monitorizată printr-o schimbare de culoare a unui indicator care vizualizează
scăderea pH-ului datorită eliberării acizilor grași dintr-un substrat lipidic.

Selecția microorganismelor este o etapă foarte critică în procesul de screening și poate fi destul
de subiectivă, mai ales dacă numărul implicat este foarte mare. Chiar dacă screening-ul a urmat o
anumită formă de proces de selecție, deseori nu este ușor de realizat distinge diferitele tipuri de
microorganisme care cresc pe un mediu agar. Acest lucru este valabil mai ales pentru bacterii,
care, cu excepția cazului în care sunt clar colorate, toate arată la fel. Acest lucru dă naștere unuia
dintre cele mai mari dezavantaje ale abordării aleatorii a izolării și screeningului tulpinilor
naturale: problema redundanței. Același microb va reapărea de mai multe ori din diferite
eșantioane colectate din locații diferite, iar acest lucru poate explica de ce atât de multe produse
provin dintr-o gamă foarte limitată de microbi. Până relativ recent, majoritatea strategiilor de
screening erau destul de conservatoare. Tendința de a utiliza medii bogate care favorizează
organismele cu creștere rapidă, care nu necesită nutriție, a dus la o accentuare excesivă a
anumitor grupuri de microorganisme. Acest lucru este asociat cu faptul că anumite genuri
fungice, cum ar fi speciile Aspergillus și Trichoderma, și speciile Bacillus și Pseudomonas
printre bacterii, au fost în mod tradițional o sursă bogată și dovedită de enzime comerciale.

Pentru a asigura o mai mare diversitate și ca măsură a cât de extins a fost un screening, este
necesară o estimare a biodiversității populației examinate. În urmă cu un deceniu, aceasta a fost o
sarcină descurajantă care a presupus o examinare detaliată a fiecărui organism, dar în zilele
noastre sunt disponibile metode moleculare rapide. O serie de tehnici grupează rapid colecțiile de
tulpini necunoscute în grupuri de organisme înrudite. Modelele de proteine celulare totale,
polimorfismul amplificat al lungimii fragmentelor, ribotiparea, analiza restricționată a ADN-ului
ribozomal amplificat, regiunea distanțieră transcrisă PCR, polimorfismul conformațional
monocatenar combinat cu metode sofisticate de electroforeză și analiza imaginilor pentru
achiziția și calculul datelor pot furniza informații despre diversitatea o colecție de tulpini. Astăzi,
ușurința cu care se poate realiza secvențierea genei ARN ribozomal subunitar mic (ssu rRNA),
combinată cu o bază de date mare și în creștere pentru comparație, înseamnă că anumite
organisme pot fi deseori repartizate rapid unor grupuri taxonomice cunoscute, sau noi
microorganismele pot fi recunoscute. Gruparea organismelor în grupuri conexe de tulpini poate
fi combinată cu screeningul datelor de selecție, permițând astfel identificarea atributelor specifice
cu grupuri recunoscute de organisme. Aceste informații permit să se elaboreze proceduri speciale
pentru izolarea unui anumit grup țintă și impunerea unor criterii de selecție mai stricte. Chiar și
așa, este încă prea ușor să treceți cu vederea potențialele noi izolate, mai ales când vă confruntați
cu multe sute de feluri de mâncare culturale, fiecare conținând câteva sute de colonii microbiene
cu aspect similar. În zilele noastre, sarcina poate fi realizată de roboți de colectare a coloniilor și
sisteme de imagistică vizuală cuplate la computere. O problemă întâlnită adesea la începutul
procesului de screening este că izolatele microbiene naturale produc de obicei enzime importante
din punct de vedere comercial în concentrații extrem de scăzute. Manipularea mediului care
optimizează condițiile de creștere și producție este limitată de capacitatea maximă intrinsecă a
organismului de tip sălbatic. Manipularea genetică clasică prin selectarea mutanților cu
proprietăți îmbunătățite poate duce la o creștere a randamentului potențial. Tehnicile clasice de
mutație și selecție pentru microorganisme cu atribute îmbunătățite au fost aplicate de mai multe
decenii. Metodele moderne de biologie moleculară au accelerat posibilitățile de a crea în
laborator microorganisme cu activități noi sau îmbunătățite.

 Dezvoltare de molecule

Dacă o enzimă de plumb adecvată, de exemplu, o xilanază acidă, a fost identificată într-o
anumită specie, atunci se poate căuta enzime omoloage în specii înrudite. Procesul necesită
aplicarea geneticii inverse. Enzimele sunt polimeri ai aminoacizilor legați covalent într-o
secvență definită. Ordinea în care aminoacizii sunt aranjați în enzimă poate fi analizată printr-un
proces cunoscut sub numele de secvențiere N-terminală. Deoarece codul genetic este universal,
este posibil să se prezică secvența probabilă a bazelor nucleotidice din gena care codifică enzima
specifică. Folosind această informație se poate construi o sondă formată din 15 până la 20 de
nucleotide (set de primer) în secvența corectă, care, datorită naturii cu dublă helică a ADN-ului,
se va lega de catena complementară. Prin utilizarea grundului setat în reacția în lanț a
polimerazei (PCR) pe ADN-ul cromozomial de la organisme înrudite, o genă omologă poate fi
amplificată și transferată la un organism gazdă, cum ar fi E. coli pentru exprimarea produsului
genetic, adică o enzimă omologă. În practică, procedura poate fi puțin mai complexă decât este
descrisă aici, dar este posibilă depistarea enzimelor cu funcționalitate identică (de exemplu, o
xilanază), dar cu o secvență semnificativ diferită de aminoacizi, prin care doar elementele
cruciale ale enzimei precum site-ul activ au fost conservate prin evoluție. În testele de aplicare,
aceste „noi” enzime pot avea proprietăți semnificativ diferite, cum ar fi temperatura îmbunătățită
sau stabilitatea pH-ului în comparație cu molecula de plumb. În acest fel, familii întregi de
organisme înrudite poate fi ecranat. Alternativ, ADN-ul microbian poate fi sondat cu ADN care
poartă o etichetă radioactivă sau fluorescentă printr-o tehnică numită hibridizare. Cu toate
acestea, toate metodele moleculare bazate pe screening-ul similarității au un mare dezavantaj. Se
bazează pe o comparație cu datele care au fost deja înregistrate.

 Screening genetic de mediu

Chiar dacă screeningul molecular este o tehnică foarte puternică, pare limitat de capacitatea de a
crește și extrage ADN adecvat din organismele țintă. De asemenea, este limitat la
microorganisme cunoscute care au fost izolate, descrise și depozitate în colecțiile de cultură. Cu
toate acestea, s-a estimat că mai puțin de 1% din toate microorganismele care există în natură au
fost izolate și chiar mai puține au fost caracterizate și descrise în mod adecvat. Se crede că mai
puțin de 25% din microbii dintr-o probă prelevată din mediu pot fi de fapt cultivate în laborator.
Pot exista numeroase motive pentru această porțiune „inculturabilă” a comunității microbiene.
Unele celule pot fi într-o fază de repaus, deteriorate sau moribunde; este posibil ca unii să nu fie
rezidenți adevărați și să nu facă parte din populația activă; alții pot fi oportunisti care așteaptă o
schimbare a condițiilor de mediu în favoarea lor; în timp ce altele pot avea cerințe necunoscute
pentru cultură care rămân nesatisfăcute în laborator.

Cultivarea în laborator are o puternică părtinire selectivă; tehnicile sunt foarte conservatoare și
abia s-au schimbat de 100 de ani. Cu toate acestea, suntem închiși în cadrul acestor constrângeri,
deoarece nu avem răspunsuri intelectuale la această problemă. Principala biodiversitate a vieții
este microbiană, distribuită în trei grupuri sau domenii de relaționare primare: Archaea, Bacteria
și Eukarya. Numărul speciilor de procariote valid descrise este de aproximativ 4500 și crește cu o
rată de 100-200 pe an. În 1987, WOESE a descris domeniul bacterian ca fiind format din
aproximativ 12 grupuri (diviziuni) legate în mod natural pe baza analizei secvenței ssRNA a
organismelor cultivate familiare și a arătat că acestea au afișat o profunzime evolutivă mai mare
(biodiversitate genetică) decât plantele, animalele și ciupercile. Studiile filogenetice ale
secvențelor cultivate și de mediu ne-au extins în mod substanțial aprecierea față de domeniul de
aplicare al biodiversității bacteriene. Trei rapoarte de cercetare seminale, publicate în 1990, au
indicat că biodiversitatea bacteriană bazată pe studii moleculare a fost semnificativ mai mare
decât cea cunoscută din culturile pure. Dintr-un studiu de reasociere ADN-ADN s-a estimat că
un singur eșantion de sol forestier conține aproximativ 12 000 de specii bacteriene. Celelalte
două studii au raportat recuperarea independentă de cultivare a secvențelor parțiale 16S rADN
din bacterioplanctonul marin și din izvoarele termale. Secvențele 16R rNAr tratate nu s-au
potrivit cu cele ale bacteriilor cultivate cunoscute și, prin urmare, au furnizat dovezi pentru
numeroase bacterii încă necunoscute. O examinare mai recentă a ADN-ului de mediu derivat din
diverse habitate a relevat, pe lângă o vastă biodiversitate a microorganismelor care nu au fost
încă cultivate, că este posibil ca microorganismele cultivate să nu fie flora dominantă în aceste
medii și acest lucru oferă o provocare suplimentară metode de cultura de imbogatire.

Acum, după aproape un deceniu de recuperare directă a secvenței ARNr din mediul natural, sunt
rezolvate aproape 40 de diviziuni bacteriene distincte. Doar patru dintre aceste diviziuni
reprezintă 90% din totalul bacteriilor cultivate (Proteobacteria). Nu este de mirare că majoritatea
biotehnologiei microbiene este dedicată organismelor care se încadrează în aceste grupuri. Pentru
peste 15 dintre diviziunile bacteriene, nu se cunoaște niciun organism în cultură, iar pentru alte
15 diviziuni, unul sau doi reprezentanți cultivi sunt susținuți doar de amprenta secvenței de
mediu. Diferențele filogenetice dintre diviziunile bacteriene se reflectă probabil în diferențe
fiziologice substanțiale.

Din fericire, evoluțiile tehnologice recente au permis accesul la cel puțin o parte din acești
microbi necultivați. Este posibil să se extragă ADN sau chiar ARN direct din comunitatea
microbiană prezentă într-o probă luată din mediu. Deși există multe tehnici de extragere a ADN-
ului cromozomial din comunitățile microbiene naturale, nu toate celulele sunt la fel de
susceptibile la liză, iar ADN-ul nu se recuperează niciodată la 100%. O altă preocupare este
detectarea organismelor care formează doar o proporție minoră din comunitatea totală. ADN-ul
lor va fi subreprezentat, cu excepția cazului în care se depun eforturi pentru a normaliza proba.
ADN-ul din mediu poate fi testat pentru gene cunoscute utilizând tehnicile moleculare descrise
mai sus. Acest lucru necesită ADN de bună calitate, deoarece screening-ul PCR este deosebit de
sensibil la perturbarea substanțelor contaminante din mediu. Alternativ, ADN-ul din mediu poate
fi tăiat în fragmente mai mici utilizând enzime de restricție, iar fragmentele clonate într-o gazdă
de expresie, cum ar fi E. coli. La fel, ARN de mediu poate fi utilizat pentru a construi biblioteci
de expresie ADNc. Clonele pot fi apoi testate pentru gene care codifică enzimele într-un mod
similar cu multe dintre tehnicile descrise pentru screeningul izolatelor microbiene naturale,
permițând astfel detectarea activităților dorite codificate de gene care ar putea prezenta doar o
similitudine limitată sau gene deloc cunoscute.
  Genomic Screening
S-au făcut progrese spectaculoase în secvențierea directă a nucleotidelor unei catene de ADN.
Deja există milioane de secvențe genetice în bazele de date publice. Întregul genomilor din peste
800 de organisme poate fi găsit în baze de date publice precum Entrez Genomi. Genomii
reprezintă atât organisme complet secvențiate, cât și cele pentru care secvențierea este în curs.
Toate cele trei domenii principale ale vieții - bacterii, arheele și eucariote - sunt reprezentate,
precum și mulți viruși și organite. În prezent (2006) 302 procariote (279 bacterii și 23 arhaea)
genomii și mai multe genomuri eucariote microbiene au fost secvențiate în întregime, iar
secvențierea a mai mult de 20 de genomi microbieni este în desfășurare. Inițial, speciile patogene
erau principalul obiectiv al proiectelor de secvențiere microbiană, dar și mulți microbi cu
potențial industrial sunt secvențați. De exemplu, genomii microbilor termofili, alcaliphilici,
acidofili și toleranți la sare au fost secvențați. Acest lucru ilustrează convingerea generală că
analiza genomului va dezvălui mecanismele care stau la baza stilurilor de viață respective ale
acestor microbi, ajută la identificarea enzimelor extremofile relevante din punct de vedere
industrial și, posibil, permit recunoașterea regulilor generale ale proteinelor care duc la
performanțe enzimatice în condiții extreme. Analiza globală a proteinelor termofile arată, de
exemplu, o tendință de reducere a dimensiunii proteinelor; legătura crescută de hidrogen,
conținutul de beta-catenă și stabilizarea helixului prin perechi de ioni; și preferința pentru
reziduurile încărcate față de reziduurile polare neîncărcate.

Atunci când este disponibilă o secvență de genom microbian, genele care codifică proteinele pot
fi identificate pe bază de calcul prin esențial două metode diferite.O metodă de calcul mai fiabilă
folosește similitudinea cu o genă proteincodificatoare într-un alt organism pentru a identifica
gene noi. Această din urmă metodă depinde, totuși, de disponibilitatea genelor omoloage, dar are
ca avantaj adăugat capacitatea de a indica funcția genei. Deoarece genele procariote se suprapun
frecvent unele cu altele, predicția exactă este notoriu dificilă și, ca rezultat, numărul real de gene
de codificare proteică pentru genomii microbieni secvențați rămâne discutabil. O altă complicație
care se adaugă la discrepanța dintre predicțiile genei și proteinele exprimate este prezentată de
splicing alternativ, care poate apărea în eucariote microbiene.

Cantitatea enormă de date de secvență din domeniul public a condus la apariția bioinformaticii,
care poate fi definită ca interfața dintre științele biologice și științele computaționale.
Bioinformatica utilizează instrumente de calcul pentru a organiza și analiza datele biologice și își
propune să extragă informații și cunoștințe biologice. Exemple tipice includ identificarea genelor
omoloage sau a domeniilor proteice specifice și transferul de cunoștințe funcționale asociate cu
acești omologi sau domenii pentru a prezice funcția noilor gene. De exemplu, căutarea
similarității la nivelul genei permite screening-ul in silico pentru enzime. Rețineți, totuși, că
datele secvenței nu sunt cu siguranță impecabile și, prin urmare, o rată considerabilă de eroare ar
trebui luată în considerare în analiză. Frecvența erorilor poate fi redusă prin integrarea
informațiilor suplimentare care pot fi extrase din date genomice sau experimentale. Alte metode
de calcul care folosesc secvențele genomice disponibile pentru a deduce funcția se bazează pe,
de exemplu, gruparea genomică a genelor funcționale, filogenetică, alinierea căii metabolice și
abordări combinate. În ciuda unor astfel de instrumente puternice, aproximativ 25% din genele
putative dezvăluite de proiectele totale de secvențiere a genomului nu pot fi atribuite în prezent o
funcție deoarece arată doar omologie altor gene neanotate. Alți 25% din gene au o funcție
necunoscută și par a fi unice pentru speciile lor. În schimb, aproape 40% din activitățile
enzimatice bine definite cărora li s-au atribuit numere specifice de E.C. nu sunt încă asociate cu
secvențele genetice publicate. Aceste date indică faptul că resursele pentru screeningul enzimelor
noi sunt încă în mare parte neexploatate. Au fost dezvoltate mai multe noi tehnologii
experimentale cu randament ridicat care vizează identificarea funcțiilor acestor gene
orfane.Printre altele, au fost inițiate studii de expresie și structurale pentru a determina dacă
astfel de gene codifică proteine ‘‘ ipotetice ’’ cărora li se poate atribui o funcție specifică .

Au fost dezvoltate multe metode care utilizează pierderea funcției, localizarea celulară,
interacțiunea proteinelor sau momentul exprimării pentru a prezice funcția pentru proteinele noi
și pot fi revendicate ca instrumente pentru așa-numita genomică funcțională. În esență,
majoritatea acestor metode deduc funcția indirectă ca „vinovăție prin asociere” în timp sau spațiu
cu proteine caracterizate. De exemplu, o mare varietate de tehnici sunt disponibile pentru a
perturba genele, aleatorii sau dirijate, la scară largă în practic orice organism . Analiza fenotipică
ulterioară, destul de similară cu screeningul izolat natural, permite determinarea funcțiilor
biologice putative ale proteinele inactivate. Unele dintre metodele de întrerupere a genelor
permit, de asemenea, analiza localizării proteinelor, ceea ce poate ajuta la adnotarea funcțională.
Analiza la scară largă a interacțiunilor proteice prin abordări genetice cu 2 hibrizi sau biochimice
/ spectrometrice de masă a fost, de asemenea, utilizată pentru a atribui funcția. În plus, metodele
de calcul s-au dovedit reușite în prezicerea interacțiunii funcționale între proteine.
Până în prezent, totuși, analiza transcrierii la nivelul genomului a apărut ca cel mai utilizat
instrument pentru genomica funcțională. Pe baza presupunerii că proteinele cu funcții similare
prezintă o reglare similară, datele de transcriere pot fi utilizate pentru clasificarea funcțională a
genelor. Microarrays-urile de oligonucleotide sau gene întregi care reprezintă genomul complet
pot fi hibridizate cu ADNc marcate diferențial obținute din celule separate sau stări celulare.
Comparația profilurilor de transcriere indică reglarea expresiei genelor ca urmare a modificărilor
condițiilor celulei. Alternativ, expresia diferențială a proteinelor poate fi urmărită, de asemenea,
direct la nivelul proteinelor - deși încă cu un debit mai mic - în loc de evaluare indirectă prin
analiza transcripției. Co-reglarea genelor (sau proteinelor) poate fi apoi utilizată pentru a
identifica gene relevante pentru un anumit proces celular. Proiectarea unui microarray de ADN
cu genom întreg pentru un microb complet secvențiat este simplă din punct de vedere
conceptual. Aranjarea simultană a mai multor matrici de ADN poate crește și mai mult fluxul de
analiză a expresiei. De exemplu, nivelurile de expresie a peste 6000 de gene umane în 49 de
tipuri de celule diferite au fost detectate recent într-un singur experiment de hibridizare. Există
multe alte aplicații pentru utilizarea microarrays-urilor de ADN pe lângă profilul de transcriere.

 Proteomic Screening

Abordările de genomică funcțională menționate mai sus sunt în mod clar foarte valoroase, dar ele
încă deduc funcția proteinelor indirect. Testele directe pentru funcție necesită expresia
highthroughput a genelor identificate, urmată de analiza funcțională a proteinelor purificate.
Această abordare introduce noi provocări în ceea ce privește exprimarea proteinelor, inclusiv
necesitatea clonării și purificării cu debit ridicat. Multe tehnologii noi care facilitează astfel de
abordări la scară largă nu se limitează la întregul complement al genomului secvențial,
proteomul, dar pot fi adaptate pentru analiza funcțională a unui număr mare de proteine
recombinante, de exemplu, cele codificate de cDNA sau de bibliotecile de mediu. Deși orice
genă poate fi proiectată pentru a modifica anumite locuri de restricție și pentru a facilita

clonarea într-un vector adecvat, acest proces nu poate fi efectuat în mod eficient atunci când se
ocupă cu seturi mari de gene. Pentru a eluda acest lucru, au fost elaborate mai multe strategii de
clonare mediate de recombinare, care permit clonarea flexibilă în mai mulți vectori diferiți.
Purificarea proteinelor cu debit ridicat necesită fuziune cu etichete specifice de afinitate care
facilitează purificarea, imunolocalizarea și/sau imuno-precipitarea. De exemplu, fuziunea la nivel
de genom cu diferite etichete a permis purificarea paralelă și caracterizarea a mii de proteine
diferite. Fuziunile proteice au fost, de asemenea, utilizate pentru a îmbunătăți secreția și
solubilitatea proteinelor mici sau cu solubilitate scăzută. Deși adăugarea de etichete ar putea
afecta funcția proteinelor, ele facilitează puternic detectarea și purificarea și pot permite afișarea
sau imobilizarea suprafeței celulare pe margele sau orice alt suport. Câteva exemple interesante
de screening proteomic au fost raportate la sfârșitul anilor 1990 și începutul anilor 2000. Peste
6000 de gene de drojdie topite glutationului S-transferază (GST) au fost exprimate și purificate
[377]. Bazine de proteine de fuziune purificate au fost evaluate pentru diferite activitățile
enzimatice, iar după deconvoluție, activitățile specificate ar putea fi atribuite genelor orfane. Într-
o abordare legată de aproape toate kinazele proteice din drojdie de panificație au fost arrayed în
microwells și analizate simultan prin utilizarea a 17 substraturi diferite. Aceiași autori au
exprimat, de asemenea, cele mai multe gene de drojdie cu o etichetă 6xHIS, care a permis
legarea proteinelor de fuziune la diapozitive acoperite cu nichel. Proteinele purificate au fost
imprimate pe aceste diapozitive și ecranate pentru capacitatea lor de a interacționa cu proteinele
și fosfolipidele.Sondarea cipurilor proteome a dat multe interacțiuni funcționale noi [378]. În
două studii ndependente proteinele de fuziune au fost, de asemenea, folosite pentru a purifica și
caracteriza complexele multiproteine la o scară fără precedent [379], [381]. Într-un studiu
asociat, s-a demonstrat că un complex multiproteină marcat cu TAP purificat cu afinitate și-a
păstrat activitatea .

Multe idei pentru a construi cipuri de proteine sunt urmărite [383], dar dintr-o perspectivă de
screening enzimatic atenția ar trebui să se concentreze asupra metodelor care sunt cele mai
susceptibile de a păstra activitatea enzimatică. Într-o alternativă interesantă [384], în loc să
imprime proteine, o bibliotecă de expresii este imprimată și suprapusă cu celule competente,
rezultând o expresie localizată de către transformanți. Clusterele de celule pot fi apoi ecranate
pentru proprietăți dependente de clone. Afișarea suprafeței celulare a bibliotecilor de proteine a
fost utilizată pentru selectarea lianților noi sau îmbunătățiți, dar poate fi utilizată și pentru a
verifica activitatea enzimatică . De exemplu, mutanții cu activitate catalitică îmbunătățită au fost
identificați prin afișarea la suprafață a celulitei și a subtiligase.

Afișajul combinat al unui substrat fluorescent stins și al unei biblioteci de variante de protează a
fost utilizat pentru a verifica specificitatea substratului nou. Astfel de abordări ar trebui, de
asemenea, să facă posibilă depistarea bibliotecilor de expresii ale diversității naturale.