Curs 9

Creşterea microorganismelor

3.1. Cinetica creşterii microorganismelor în cultura discontinuă Spre

deosebire de organismele superioare la care creşterea poate fi diferenţiată,
atât la nivel individual cât şi populaţional, creşterea microroganismelor se
apreciază în special sub raport populaţional, ca mărire a numărului de
indivizi şi/sau a biomasei totale. Organismele unicelulare se divid prin
fisiune binară, fiecare celulă creşte până la dimensiunea maximă, are loc
replicarea materialului genetic după care se divide în două celule-fiice
identice. Prin urmare, două celule care se divid dau naştere la patru, cele
patru la 8 ş.a.m.d., ducând la creşterea exponenţială a numărului de celule: 1
 2  4  8  2 n . Dacă dorim să reprezentăm grafic numărul de celule în
raport cu timpul obţinem o curbă exponentială. Adesea însă este mult mai
convenabil să reprezentăm creşterea numărului de celule în timp sub formă
logaritmică, caz în care curba de creştere apare ca o linie dreaptă. Creşterea
nu poate avea loc pentru o perioadă de timp nelimitată, ci ea scade ca
intensitate fie ca urmare a epuizării nutrienţilor, fie ca urmare a acumulării
produşilor rezultaţi din metabolism. În consecinţă, creşterea organismelor
unicelulare prezintă o serie de faze distincte (Fig. 3.1): (i) faza de lag. După
transferul pe un mediu de cultură proaspăt, celulele bacteriene necesită o
perioadă de adaptare mai mult sau mai puţin îndelungată. Această perioadă de
timp este necesară pentru ca celulele să poată sintetiza enzimele active în
metabolizarea substraturilor prezente în mediu de cultură [ 1 2 ] .
Durata fazei de lag depinde de vârsta şi starea celulelor din inoculum. În
cursul acestei etape nu se observă o creştere a numărului de celule, deşi
acestea sunt metabolic active; (ii) faza logaritmică sau exponenţială. Ca
urmare a adaptării, celulele încep să se multiplice prin fisiune binară, ducând
la creşterea exponentială a numărului lor. În condiţii optime, populaţia
celulară se va dubla într-un interval de timp constant şi predictibil, numit
timp de generaţie. În funcţie de specie, timpul de generaţie poate varia de la
câteva minute până la câteva ore. De exemplu, la E. coli, bacterie larg
folosită în laborator, are un timp de generaţie egal cu 20 min.

1
(iii) faza staţionară. Pe măsură de rata de creştere scade cultura intră în faza
staţionară. Diviziunea celulară nu a încetat complet, dar numărul de bacterii
nou apărute prin diviziune echilibrează numărul celor care lizează şi mor;
(iv) faza de declin [ 1 2 , 1 3 , 1 4 ] . Pe măsură ce rata mortalităţii creşte, numărul total
de celulele viabile scade.

3.2. Creşterea diauxică

Modelul descris mai sus caracterizează creşterea unei culturi bacteriene în
prezenţa unui singur substrat. Există, însă şi situaţii particulare când
creşterea unei culturi are loc în prezenţa mai multor substraturi care sunt
utilizate diferenţiat. Astfel, E. coli cultivată pe un mediu ce conţine glucoză
şi lactoză va metaboliza preferenţial glucoza întrucât este mai eficient din
punct de vedere energetic. Celulele au mecanisme de reglare care împiedică
sinteza enzimelor implicate în metabolizarea lactozei până când toată
cantitatea de glucoză a fost consumata. După epuizarea glucozei cultura intră
într-o nouă fază de lag necesară sintezei enzimelor implicate în metabolizarea
lactozei. Un astfel de mod creştere este numit diauxie, caracterizată de o
curbă de creştere bifazică [ 1 3 , 1 4 ] .

3.3. Cultura continuă şi cultura discontinuă

Fazele de creştere descrise anterior sunt tipice pentru cultura discontinuă a
microorganismelor. Inoculul este adăugat unui mediu nutritiv, iar cultura este
incubată în condiţii specifice fără să fie adăugaţi nutrienţi proaspeţi sau
îndepărtaţi produşii rezultaţi din metabolism. Condiţiile din mediul de cultura
se schimbă continuu, iar creşterea activă este limitată în timp de epuizarea
nutrienţilor sau acumularea deşeurilor metabolice. În unele cazuri
(producerea de alcool sau antibiotice) este avantajos ca celulele să fie
menţinute în faza logaritmică de creştere care se poate realiza prin adăugarea
continuă de mediu de cultură proaspăt cu îndepărtarea unor cantităţi egale din
mediul vechi. În acelaşi timp, o serie de parametri (pH, aerare) sunt
monitorizaţi şi ajustaţi permanent [ 1 4 ] .
Menţinerea în faza logaritmică a culturilor microbiene se realizează în
sisteme de cultură speciale, numite chemostate. Densitatea populaţională este

2
menţinută constantă prin controlul ratei fluxului de nutrienţi, ca şi a
concentraţiei acestora (Fig. 3.2.).
3.5. Determinarea cantitativă a microorganismelor
Metodele utilizate pentru estimarea creşterii microorganismelor unicelulare
pot fi exprimate fie ca o creştere a numărului de indivizi, fie ca biomasă
totală. Ele pot fi grupate în două mari categorii: (i) metode de determinare a
numărului total de celule; (ii) metode de determinare a numărului de celule
viabile.
Determinarea numărului total de celule se realizează prin examinarea
microscopică directă. În acest scop, se utilizează o lamă microscopică
specială ce prezintă un caroiaj gravat cu o arie cunoscută. Întrucât grosimea
probei de lichid este cunoscută, pe baza numărării celulelor vizibile în
câmpul microscopului se poate determina numărul de celule pe unitate de
volum. Tehnica poate deveni mai precisă prin utilizarea unor coloranţi
fluorescenţi apţi să se fixeze de ADN, evitând astfel confuzia cu alte
particule. Tehnica are un dezavantaj major şi anume nu poate face distincţie
între celulele moarte şi cele vii. Utilitatea ei este, de asemenea, limitată de
faptul că cele mai mici bacterii nu pot fi vizualizate clar ca celule individuale
la microscopul optic [ 1 2 ] . Alte variante ale tehnicii utilizează dispozitive de
sortare, folosite iniţial pentru sortarea celulelor sanguine, numaratoare
Coulter. Celulele trec printr-o duză foarte fină, iar un detector înregistrează
modificările de conductivitate de fiecare dată când trece o particulă. Deşi
rapidă, tehnica nu poate distinge între celulele vii şi cele neviabile [ 1 2 ] .
Determinarea numărului de celule viabile se bazează pe evidenţierea celulelor
apte de multiplicare şi producere a unor colonii vizibile [ 1 3 , 1 4 ] . Se realizează
prin etalarea unui volum cunoscut de probă pe suprafaţa unui mediu nutritiv,
urmată de numărarea coloniilor după incubare (Fig. 3.8.). Tehnica se bazează
pe presupunerea că fiecare colonie apare prin diviziunea repetata a unei
singure celule.

În realitate însă, unele specii se organizează în grupări caracteristice (de ex.,

stafilococul) stabile care fiecare generează o colonie; de aceea rezultatele se
exprimă ca Unităţi Formatoare de Colonii (UFC) pe unitate de volum [ 1 2 ] .
Înainte de inoculare se procedează la diluarea probelor astfel încât coloniile

3
să poată fi numărate cu uşurinţă. În acelaşi timp, pentru a mări acurateţea
statistică a datelor, plăcile se inoculează în duplicat sau triplicat, fiind
reţinută doar valoarea medie. O variantă a tehnicii determinării bacteriilor
viabile se poate efectua în medii lichide cu estimarea Numărului celui Mai
Probabil (engl. MPN – Most Probable Number) de celule apte să crească pe
respectivul mediu de cultură. În acest scop, mai multe eprubete cu mediu
nutritiv sunt inoculate cu proba diluată progresiv, urmată de incubare şi
examinarea vizuală pentru evidenţierea creşterii. Tehnica se bazează pe
estimarea probabilităţii statistice a prezenţei celulelor viabile în probele
respective [ 1 2 , 1 3 , 1 4 ] . Altă metodă pentru determinarea cantitativă a bacteriilor,
în special în probe de apă, este cea care foloseşte membranele filtrante. Un
volum cunoscut de apă este trecut printr-o membrană filtrantă cu porozitate
(0,45 sau chiar 0,22 um) aptă să reţină bacteriile. Membrana este apoi aşezată
pe suprafaţa unui mediu nutritiv solid şi incubată pentru a permite
dezvoltarea coloniilor. Metodele descrise mai sus necesită un timp relativ
lung necesar incubării şi exprimării rezultatelor [ 1 3 , 1 4 ] .
O tehnică utilă pentru estimarea rapidă a densităţii celulare într-o probă se
bazează pe gradul de turbiditate determinat de densitatea celulelor
microbiene. Metodele turbidimetrice măsoară modificările densităţii optice
sau absorbanţa unui mediu, adică gradul de dispersie al unui fascicul de
lumină la trecerea printr-un mediu lichid ce conţine substanţa particulată.
Determinările se pot realiza rapid prin utilizarea unui spectrofotometru (Fig.
3.9.). Valorile densităţii optice pot fi convertite în valori de densitate
celulară sau masă prin utilizarea unei curbe standard de calibrare. În acest
fel, aprecierea numărului de celule bacteriene prezente într-un mediu poate fi
făcută aproape instantaneu în cursul unui experiment.
Alte metode indirecte de estimare a densităţii celulare se bazează pe
determinarea greutăţii uscate sau umede, precum şi a unor componente
celulare bine definite (azot total, proteine sau acizi nucleici) [ 1 2 , 1 3 , 1 4 ] .