Informatii generale

Genetica complexului major de histocompatibilitate

Complexul major de histocompatibilitate (MHC) reprezinta un grup de gene situat pe bratul

scurt al cromozomului 6, care produce markeri celulari de suprafata ce detin un  rol important
in procesul de recunoastere a self-ului: molecule de clasa I si de clasa II. La om moleculele
MHC de clasa I includ antigenele leucocitare (HLA = human leukocyte antigen) HLA-A,
HLA-B si HLA-C, in timp ce moleculele MHC de clasa II includ HLA-DR, HLA-DQ si
HLA-DP. Aceste molecule constituie antigenele clasice implicate in transplant. La nivelul
MHC mai sunt codificate si molecule de clasa III: componentele legate de MHC ale
complementului (C2, C4 si Bf), 21-hidroxilaza (CYP21), proteina de soc termic (Hsp) 70 si
factorul de necroza tumorala (TNF).

MHC se intinde pe o lungime de 3600 kb si include 224 de gene identificate, dintre care este
prevazuta exprimarea unui numar de 128; aproximativ 40% dintre genele exprimate au o
functie legata de sistemul imun. Genele HLA sunt localizate in 6 sub-regiuni care se succed in
urmatoarea ordine: HLA-A, HLA-C, HLA-B, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-A fiind
distal de centromer. Fiecare sub-regiune codifica cel putin o glicoproteina de suprafata (vezi
figura 1).

Figura 1: Succesiunea genelor HLA I si II pe cromozomul 6

<img src="/wp-content/uploads/2009/08/fig-12.jpg" alt="Tipaj HLA-DR - Synevo"

width="715" height="337" data-eio="l">

Cu o singura exceptie, genele HLA se caracterizeaza printr-un polimorfism inalt, mai exact
fiecare gena prezinta alele multiple in populatie. Avand in vedere rolul important al sistemului
HLA in raspunsul imun, se pare ca acest polimorfism este esential pentru supravietuirea
speciilor si este mentinut in populatie prin selectie.
Genele MHC sunt strans asociate intre ele (linkate), adica segrega in bloc in cursul meiozei.
Complexul de gene linkate care sunt localizate pe una din perechile de cromozomi omologi si
care segrega in bloc la urmasi este denumit haplotip. Fiecare individ mosteneste doua
haplotipuri HLA – cate unul de la fiecare parinte – si are astfel doua alele pentru fiecare gena
ce se exprima codominant (vezi figurile 2,3).

Figura 2: Alele-perechi mostenite de la mama si tata pentru fiecare locus HLA

<img src="/wp-content/uploads/2009/08/fig-2.jpg" alt="Tipaj HLA-DR - Synevo"

width="703" height="380" data-eio="l">

Observatia ca alelele de pe diverse locusuri genetice apar in populatie in cadrul aceluiasi

haplotip, cu o frecventa semnificativ mai mare decat cea prevazuta numai pe baza intamplarii,
defineste dezechilibrul de linkaj – caracteristica sistemului HLA – care se intinde de la HLA-
A pana la HLA-DQ inclusiv. Cel mai cunoscut dezechilibru de linkaj este haplotipul A1,
Cw7, B8, DR17(3), DR52, DQ2 intalnit in populatia caucaziana cu o frecventa de 4 ori mai
mare decat cea asteptata2.

Figura 3: Modul de transmitere a haplotipurilor HLA la copiii unei familii

 <img src="/wp-
content/uploads/2009/08/fig-3.jpg" alt="Tipaj HLA-DR - Synevo" width="450" height="337"
data-eio="l">

Rolul moleculelor HLA clasa I si II

Moleculele clasice apartinand clasei I MHC, denumite la om HLA-A, HLA-B si HLA-C, sunt
heterodimeri alcatuiti dintr-un polipeptid transmembranar glicozilat asociat cu β2-
microglobulina, ce se exprima pe toate celulele nucleate si detin roluri-cheie in raspunsul
imun:

● Prezinta antigene peptidice derivate din proteine citoplasmatice  (de exemplu, un virus sau o
proteina anormala dintr-o celula maligna) receptorilor clonali specifici fiecarui peptid ai
limfocitelor T CD8+. Aceste peptide rezulta in urma digerarii proteinelor la nivelul
lizozomilor, avand in general o lungime de aproximativ 9 aminoacizi. Fiecare alotip MHC I
isi selecteaza celulele T proprii; astfel exista 6 subseturi de celule T, fiecare fiind specializat
pentru alotipurile HLA-A, HLA-B si HLA-C de provenienta materna sau paterna. In urma
recunoasterii peptidelor celulele T CD8+ lizeaza celulele-tinta.

● Exprimarea lor pe suprafata celulelor exercita o functie protectoare in cadrul raspunsului

imun innascut prin impiedicarea lizarii celulelor-tinta de catre celulele NK („natural killer”).
In mod specific, NK pot recunoaste si liza celulele tinta care nu exprima pe suprafata lor
moleculele HLA de clasa I, detinand astfel un rol important in supravegherea impotriva
virusurilor si celulelor tumorale. Nivelul exprimarii moleculelor HLA de clasa I pe suprafata
celulelor este maxim pe celulele limfoide; in cursul raspunsului imun exprimarea este crescuta
sub actiunea citokinelor (interferon γ si TNF); pe de alta parte, tumorile si anumite virusuri
(cum ar fi HIV) pot suprima exprimarea HLA I.

Alaturi de genele clasice, in regiunea MHC I mai sunt incluse gene cu un polimorfism redus
desemnate ca HLA-E, HLA-F si HLA-G2;8.
Moleculele apartinand clasei II MHC, HLA-DR, HLA-DQ si HLA-DP, sunt heterodimeri
alcatuiti din doua glicoproteine transmembranare asociate non-covalent – un lant α (33-35
kDa) si un lant β (26-28 kDa).

Fiecare din cele 3 sub-regiuni, DR, DQ si DP, include cel putin o gena A (care codifica lantul
α) si o gena B (care codifica lantul β). Sub-regiunea DR codifica fie una, fie doua molecule
DR, in functie de haplotip. Contine o singura gena DRA exprimata care este similara in mai
multe haplotipuri. Gena DRB cea mai apropiata de centromer, DRB1, codifica un lant β
extrem de polimorf care, asociat cu lantul α, formeaza molecula de clasa II ce predomina pe
suprafata celulelor si care exprima specificitatile serologice DR1-DR18. Cea de a doua gena
DRB exprimata, care este prezenta doar in anumite haplotipuri, este localizata intre locusurile
DRB1 si DRA si, in functie de alelele DRB1 exprimate, este denumita DRB3, DRB4 sau
DRB5. Moleculele DR rezultate poarta specificitatile serologice DR52, DR53 si respectiv
DR51. Sub-regiunea DQ include genele polimorfe DQA1 si DQB1 care codifica
heterodimerul DQ ce poarta specificitatile serologice DQ1-9. Sub-regiunea DP contine 2
seturi de gene A si B: un set DPA1 si DPB1 cu polimorfism inalt, codifica produsul proteic
DP; celalalt set este alcatuit din pseudogene2.

Spre deosebire de moleculele clasei I, cele din clasa II sunt exprimate numai pe suprafata
celulelor prezentatoare de antigen (APC): monocite, macrofage, celule dendritice, limfocite B
si, in plus, pe limfocitele T activate si celulele epiteliale timice8.

Moleculele clasei II prezinta limfocitelor T helper CD4+ fragmente antigenice peptidice

procesate din antigene exogene, cum ar fi bacteriile. Receptorii pentru antigen ai limfocitelor
T CD4+ interactioneaza cu complexul fragment antigenic-molecule HLA clasa II si
declanseaza activarea celulelor. Ca si in cazul clasei I, recunoasterea fragmentului antigenic
de catre celulele T efectoare este influentata de polimorfismul alelelor MHC. Astfel, celula T
efectoare este specifica pentru peptidul antigenic in conjunctie cu produsul alelic particular de
clasa II care a prezentat initial antigenul (restrictie MCH). In urma recunoasterii antigenului
fiecare celula T CD4+ activata stimuleaza diferentierea celulelor B in plasmocite
producatoare de anticorpi si faciliteaza diferentierea altor limfocite T in celule citotoxice sau
cu functii supresoare.

Figura 7: Prezentarea fragmentelor antigenice celulelor T de catre moleculele HLA I si II

exprimate pe APC
 <img
src="/wp-content/uploads/2009/08/fig-7.jpg" alt="Tipaj HLA-DR - Synevo" width="547"
height="316" data-eio="l">

Atat moleculele de clasa I cat si cele de clasa II pot lega alternativ peptide proprii („self”)
provenite din degradarea fiziologica a proteinelor celulare. In mod obisnuit acestea nu
declanseaza activarea limfocitelor T deoarece sunt tolerate de sistemul imun individual; in
unele situatii insa se pot declansa reactii imune care initiaza un proces de distrugere a self-ului
ce conduce la autoimunitate2.

Nomenclatura HLA

Nomenclatura HLA este elaborata de catre un comitet OMS constituit in acest sens.
Identificarea initiala a moleculelor HLA a implicat folosirea de aloseruri umane obtinute ca
urmare a aloimunizarii produse in cursul sarcinii sau a efectuarii diverselor transplante.
Astfel, nomenclatura rezultata reflecta istoria acestui efort de descoperire, aceasta fiind
stabilita in cadrul unor workshop-uri internationale. Alotipurile au fost desemnate prin
numere, cum ar fi HLA-A2, HLA-B27 si HLA-Cw6, iar numerele antigenelor HLA-A si
HLA-B nu se suprapun (vezi figura 4). Litera „w” folosita initial pentru a desemna o anume
categorie de workshop a fost pastrata pentru alotipurile HLA-C cu scopul de a le distinge de
componentele complementului C2 si C4 care de asemenea sunt mapate in cadrul MHC8.

Figura 4: Tipaj HLA serologic

 <img
src="/wp-content/uploads/2009/08/fig-4.jpg" alt="Tipaj HLA-DR - Synevo" width="525"
height="349" data-eio="l">

La testarea serologica unele aloseruri interactioneaza cu mai mult de un produs alelic HLA,
fenomen denumit reactivitate incrucisata. In cazul produsilor alelici corespunzatori
locusurilor HLA-A si HLA-B acest fenomen a fost mult studiat si utilizat pentru a clasifica
moleculele in grupuri antigenice care reactioneaza incrucisat (CREGs). Moleculele de clasa I
din cadrul unui CREG au in comun unul sau mai multi determinanti antigenici care nu se
regasesc la nivelul moleculelor unui alt CREG. Un determinant antigenic (epitop) care este
intalnit la membrii unui CREG este denumit specificitate publica (de exemplu: HLA-Bw4 si
HLA-Bw6)2.

Metodele serologice de tipaj HLA sunt inlocuite din ce in ce mai mult cu metode de biologie
moleculara (electroforeza de acizi nucleici, tehnici de hibridizare, precum si de secventiere),
care au condus la modificarea nomenclaturii prin luarea in considerare a alelelor ADN. Astfel,
o singura specificitate definita serologic poate fi  exprimata de doua sau mai multe (>25) alele
diferite (vezi figura 5).

Figura 5: Tipaj HLA – de la serologie la biologie moleculara

 <img src="/wp-
content/uploads/2009/08/fig-5.jpg" alt="Tipaj HLA-DR - Synevo" width="496" height="310"
data-eio="l">

In cadrul nomenclaturii bazate pe ADN fiecare alela HLA este desemnata prin numele
locusului genei urmat de un asterisc * si un numar de 4-7 cifre care indica alela (de exemplu,
A*0201 este o alela a genei HLA-A si B*2701 este o alela a genei HLA-B). Primele 2 cifre in
denumirea fiecarei alele se bazeaza frecvent pe tipul serologic al moleculei rezultate si/sau
similaritatea secventelor nucleotidice la alte alele din cadrul grupului (vezi figura 6).

Figura 6: Tipaj HLA prin biologie moleculara

<img src="/wp-content/uploads/2009/08/fig-6.jpg" alt="Tipaj HLA-DR - Synevo"

width="599" height="246" data-eio="l">

Unele alele difera prin secventa ADN a exonilor, dar nu si prin secventa de aminoacizi
rezultata (datorita unor substitutii silentioase sau sinonime); aceste alele sunt identificate prin
adaugarea unei a 5-a cifre la cele 4 cifre comune (de exemplu, B*27051 si B*27052). In plus,
cifrele 5-7 adaugate in denumire indica faptul ca 2 alele difera numai prin secvente la nivelul
intronilor (de exemplu, DRB4* 0103101 si DRB4* 0103102). In exemplul dat DRB4*
0103102 prezinta un  situs de splicing al ARN-ului modificat care conduce la pierderea
expresiei alelei; alelele care nu se exprima ca proteine pot avea un N adaugat la numele lor
(de exemplu, A*215N si DRB4* 0103102N)2;3.

Spre deosebire de tehnicile serologice, tipajul HLA bazat pe ADN prezinta net avantaje:

● este specific (fiecare reactiv pentru tipaj este clar definit si se bazeaza pe o secventa
nucleotidica specifica);

● este flexibil (pe masura ce sunt descoperite alele noi pot fi preparati reactivi noi);

● este mai robust decat alte tehnici (nu necesita limfocite viabile);

● poate fi aplicat pe scara larga;

● poate face o discriminare intre alelele ADN care specifica proteine HLA ce nu pot fi
diferentiate serologic; de exemplu, o persoana care prezinta alela DRB1* 0401 are acelasi tip
serologic DR4 ca si un individ care este purtator al alelei DRB4* 04122.

Prin tehnicile moleculare sunt identificate la ora actuala 4447 alele HLA clasa I si II: 965
HLA-A, 1543 HLA-B, 626 HLA-C, 9 HLA-E, 21 HLA-F, 46 HLA-G, 855 HLA-DRB, 35
HLA-DQA1, 107 DQB1, 28 HLA-DPA1, 138 HLA-DPB3. Noille alele descoperite sunt
prezentate in rapoarte periodice ale Comitetului OMS, iar secventele nucleotidice ale tuturor
alelelor sunt depozitate intr-o baza de date computerizata (GenBank, EMBL, IMGT/HLA
databases)2.

Din aprilie 2010 intra in vigoare o modificare in nomenclatura HLA: ca urmare a numarului
de alele HLA in crestere s-a decis sa se introduca „:” in denumirea alelor pentru a delimita
campuri separate. Astfel:

A*01010101  → A*01:01:01:01

A*260101 →A*26:01:01

A*3301 → A*33:01

B*0808N → B*08:08N

DRB1*01010101 → DRB1*01:01:01:01
Sunt de asemenea preconizate si alte modificari, printre care si aceea ca litera „w” va fi scoasa
din denumirea alelelor HLA-C, dar va fi mentinuta in cea a antigenelor HLA-C4.

Boli asociate cu sistemul HLA

Exista un numar semnificativ de afectiuni care prezinta o asociere cu genele MHC; in cele
mai multe cazuri este vorba de boli autoimune care nu au un mod de transmitere mendelian
clasic.  De exemplu, spondilita ankilopoietica se asociaza in 95% din cazuri cu HLA-B27.

O problema majora in legatura cu asocierile de gene MHC este penetranta lor incompleta,
ceea ce face ca studiile formale de segregare si linkaj sa fie foarte dificil, daca nu imposibil,
de efectuat. O alta necunoscuta este numarul alelelor predispozante pentru o anumita boala
intr-o populatie specifica; se pare ca multe boli asociate cu sistemul HLA sunt poligenice.

Asocierea genetica este reflectata in termenul de „risc relativ”, care reprezinta raportul
statistic intre riscul individual de boala la purtatorii unui marker genetic si riscul la indivizii
aceleiasi populatii care nu au acest marker. Un risc relativ mai mare decat 1 indica o asociere
pozitiva intre HLA si boala respectiva6.

Printre afectiunile asociate cu HLA care au fost studiate extensiv se numara diabetul zaharat
tip 1. Cea mai puternica asociere este cea cu alelele clasei II HLA DR si DQ. Genotipul
heterozigot DR3/DR4 confera cel mai mare risc de diabet, urmat de genotipurile homozigote
DR4 si DR3.

La caucazieni heterodimerii HLA-DQ (lanturile alfa DQA1 si lanturile beta DQB1) codificati
de alelele DQA1*0301, DQB1*0302, DQA1*0501, DQB1*0201 prezinta cea mai mare
asociere cu diabetul de tip 1. S-a observat ca DQB1*0302 difera de DQB1*0301 in pozitia 57,
unde lipseste un rest de acid aspartic. Aceeasi lipsa a acidului aspartic in pozitia 57 apare si la
alela DQB1*0201 si s-a sugerat ca restul de aminoacid ar fi implicat in mecanismul molecular
al susceptibilitatii fata de diabet3.

Alte haplotipuri ale genelor HLA clasa II au rol protector fata de dezvoltarea diabetului:
DQA1*0102/DQB1*0602/DRB1*1501. In special alela DQB1*0602 confera protectie, chiar
si la rudele de gradul I ale pacientilor diabetici care prezinta anticorpi anti-celule insulare
pancreatice9.

Riscul absolut pentru diabet zaharat tip 1 in functie de genotipul HLA este prezentat in tabelul
de mai jos1:

DR3/DR3 1/125

DR3/DRX 1/500
 DR4/DR4 1/147

DR4/DRX 1/476

DR3/DR4 1/42

DRX/DRX 1/5565

Testarea HLA este utila pentru evaluarea riscului de a dezvolta diabet zaharat la persoane cu
istoric familial pozitiv.

Pacientii purtatori ai markerilor HLA DQB1*0201 si/sau *0302 sau ai alelelor predispozante
DR4 (DRB1*0405, DRB1*0402) ar trebui urmariti biochimic si imunologic5.

Ca urmare a introducerii tehnicilor bazate pe ADN in tipajul HLA au fost depistate cateva
asocieri clare intre progresia infectiei HIV-1 catre sindromul imunodeficientei dobandite
(SIDA) si unele antigene HLA clasa II. Astfel, in prezenta HLA-B27 se constata o absenta a
progresiei catre SIDA pe termen lung, in timp ce asocierea cu HLA-B35 denota o progresie
rapida. Diferenta intre cele 2 alele consta in numarul diferit de peptide virale care se pot lega
de cele 2 molecule HLA-B exprimate; molecula HLA-B27 leaga 15 tipuri diferite de peptide
provenite din anvelopa virusului, pe cand nici un peptid viral nu contine secvente de
aminoacizi care sa se lege preferential de HLA-B35. Prin urmare, incarcarea moleculelor
HLA cu peptide in vederea prezentarii antigenului constituie o etapa critica. Infectia HIV este
controlata de catre celulele T CD8+ o perioada de timp variabila; marimea acestei perioade
depinde de numarul peptidelor virale recunoscute8.

In ceea ce priveste asocierea HLA cu borrelioza, conform datelor din literatura sunt raportate:

– HLA asociate cu boala Lyme refractara la tratament, adica cu autoimunitate indusa de

agentul patogen:

DR1 (HLA-DRB1*0101)

DR2 (HLA-DRB1*1501)

DR4 (HLA-DRB1*0401,*0402,*0403,*0404,*0405,*0407)

– HLA asociate cu productie scazuta de anticorpi specifici de Borrelia, in prezenta infectiei

certe:
 alele DR1 (HLA-DRB1*0101,*0102,*0103,*0104,*0105).

In concluzie, determinarea antigenelor HLA poate fi folosita astazi ca marker pentru

diagnosticul diferenţial al multor afecţiuni. In tabelul de mai jos sunt prezentate exemple de
afecţiuni asociate cu anumite constelaţii HLA, impreuna cu riscul relativ de boala7.

Boala  Antigen HLA Risc relativ

Alergia la latex DR4, DQB1*0302 (DQ3) 2.4
Alergia la insulina B7, B21 5.4
Alopecia areata B12 5.4
Alveolita alergica exogen-
DR6 16.5
allergischexogena
Anemia  aplastica DR2 2.2
Anemia pernicioasa DR5 5.4
DR8 8.0
Artrita cronica juvenila
DR5 3.3
B27 10.7
Artrita psoriazica
B38 9.1
Artrita reactiva – infectii cu: Shigella,
B27 40.0
Yersinia, Salmonella
Artrita Lyme (infectie cu Borrelia) DR2/DR4 22.0
Astm indus de aspirina DQ2 4.1
Boala Addison (idiopatica) DR3 6.3
Boala Alzheimer B7/Cw3 28.0
Boala Basedow DR3 4
Boala Behcet B51 6.3
Boala M. Behcet (forma muco-cutanata) B12 5.6
Boala Bechterew B27 87.4
Boala celiaca DQ2/DQ7/DQ8 52.0
Boala Crohn DR1, DR4, DR7 2.0-7.0
Boala mixta de tesut conjunctiv DR4 3
Ciroza  biliara primara (PBC) DR3, DRB1*0803 (DR8) 3-6.8
Corioretinopatie “birdshot” A29 224
Colangita sclerozanta primitiva (CSP) DR3, DR8 4.5-15
Dermatita herpetiforma DR3/DR7 17.3
Dermatomiozita DR3/DR52 5
DQ2/DQ3 subtipuri
DRB1*0405
> 50
Diabet zaharat tip I (DR4)DQ*0602
Protectiv
(DQ6)DQB1*0602
(DQ6)
Deficit  selectiv de IgA, DR3 17.0
Glomerulonefrita membranoasa
DR3 12.0
idiopatica
Granulomatoza Wegener DR9 6.7
Hemocromatoza idiopatica A3/B7/B14 90.0
 Hepatita cronica autoimuna DR3, DR4, DR8, DR52 4.7
Hepatita B, evolutie cronica B35 158.0
Ag Hbs – purtatori sanatosi B41 11.2
B47 15.4
Hiperplazia CSR congenitala
DR3 6.3
HIV – hipersensibilitate la Abacavir B * 5701 117
B27 Protector
HIV – evolutie lenta
B57 Protector
Lichen plan DR1 11.8
Litiaza biliara A19 131
Lupus eritematos sistemic (LES) DR2/DR3 5.8
Lupus iatrogen DR4 5.6
DR3 3.9
Miastenia gravis
DR5 3.6
DQB1*0602,
Narcolepsie 130.0
DRB1*1501
Nefrita lupica DR2/DQ1 14.0
Nefropatia IgA DR4 5.5
Nefropatia membranoasa  idiopatica DR3 3-12
Panencefalita sclerotica subacuta
A29 3.6
(SSPE)
Pemfigus vulgar DR3, DR4 14.4
Pemfigus foliaceu DR1 7.3
Poliartrita reumatoida DR1/DR4 subtypes 10.2
DR3 2.3
Polimialgia reumatica
DR4 5.7
Polimiozita DR3/DR52
B17, B37 6.7
Psoriazis vulgar
Cw6 33.0
Purpura trombocitopenica autoimuna DR2 9.2
Sindrom Reiter B27 37.0
Retinopatia diabetica B8 4.0
Sarcoidoza B7/B8DR2, DR3, DR5 8.5
Sarcom Kaposi DR5 5.3
A9/B27 11.9
Schizofrenie
A2/A11 9.8
DR3 16.7
Sclerodermie (PSS)
DR5 10,0 10.0
Scleroza  multipla DR2/DQ6 subtypes 4.1
Sindrom androgenital – forma cu debut
B14 48.5
tardiv
Sindrom androgenital – forma cu
B47 51.0
pierdere de sare
Sindrom antifosfolipidic DR4, DR7 5.1
Sindrom astmatiform indus de
A1/B8/DR3 28.9
analgezice
 Sindrom CREST DR5 8.1
Sindrome Goodpasture DR2 15.9
Sindrom Sjögren DR2/DR3 9.7
Stomatita,  aftoza recurenta B7 6.0
Tiroidita Hashimoto DR3, DR5 3.2
Tiroidita de Quervain (subacuta) B35 13.7
Tiroidita postpartum DR4/DR5 8.0
Trombocitopenia neonatala aloimuna DR3 9.2
Uveita anterioara acuta B27 10-50

Pregatire pacient – nu este necesara o pregatire speciala; pe formularul de trimitere se va

preciza afectiunea suspectata pentru care se solicita testarea HLA7.

Specimen recoltat – sange venos7.

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant7.

Cantitate recoltata – cat permite vacuumul7.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau

hemolizate; probe refrigerate sau congelate7.

Stabilitate proba – 7 zile la 2-8ºC7.

Metoda – Metoda – reactie de polimerizare in lant (PCR) cu detectie prin electroforeza in gel
de agaroza7.