Evaluarea imunitatii celulare

Deficitele imunitatii celulare sunt asociate cu infectii grave sau frecvente la nivelul tractului respirator,al
pielii, intestinului, multe dintre ele finnd dificil de tratat cu terapii standard. Infectiile cele mai frecvente
sunt produse de organisme intracelulare , in special virusuri, fungi, care la organismele
imunocompetente nu sunt patogene. Deficitele imunitatii celulare devin manifeste inca din primele luni
de viata si pot asocia deficit de crestere. Transferul transplacentar al anticorpilor materni nu intarzie
aparitia manifestarilor acestor deficite.
O prima evaluare se realizeaza prin hemoleucograma completa cu forma leucocitara, care poate
evidentia o limfopenie in cazurile de deficit imun sever. Poate fi normala in anumite tipuri de deficite ale
imunitatii celulare, fiind necesara o analiza a subtipurilor celulare si a caracteristicilor fenotipice si
functionale ale acestora.
Separarea populatiilor celulare se realizeaza in imunofenotiparea prin citometrie de flux,metoda
utilizata si pentru identificarea prezentei sau absentei anumitor antigeni de suprafata sau intracelulari
importanti pentru functionarea sistemului imun celular.
Numararea celulelor imune este foarte importanta in evaluarea integritatii sistemului imun, dar uneori
nu este suficienta, fiind necesare studii functionale. Exista actual atat metode in vivo cat si metode in
vitro de evaluare a functiei LT.

Teste de activare a LT
LT sunt activate si stimulate sa prolifereze la contactul cu anigenul specific, dar doar o mica fractiune din
LT circulante vor recunoaste un anumit antigen, motiv pentru care se utilizeaza activatori policlonali ai
LT pentru evaluarea in vitro a functiei LT. Acesti activatori poiclonali pot fi concanavalina A sau lectine
fitohemaglutinine, care stimuleaza toate LT, indiferent de TCR.
Anticorpii specifici pentru complexul CD3 asociat TCR pot induce formarea de complexe de molecule
CD3 si sa simuleze astfel recunoasterea fiziologica a antigenului, stimuland in acest fel majoritatea LT.
Activarea LT este ulterior evaluata prin masurarea citokinelor (IL-2,IL-4)din supranatantul culturilor.
Prin analogie cu LB se poate determina cresterea concentratiei de calciu citosolic, dar si cresterea
exprimarii CD69, CD71,CD25 sau specific pentru LT, cresterea exprimarii MHC la 1-3 zile de la activare.
Teste de proliferare a LT
Capacitatea de proliferare celulara este deseori utilizata ca un parametru functional al LT-test de
stimulare limfocitara, test de transformare. Similar testului de proliferare a LB se evalueaza proliferarea
LT prin masurarea incorporarii H-T in ADN.
Functia LT poate fi apreciata in vivo prin injectarea intradermica a unor antigene la care individul a fost
anterior expus, masurandu-se reactia cutanata la 48-72 ore. Cele mai frecvente antigene sunt bacilul
Calmette-Guerin si Candida.
ELISPOT IFN-γ este o metoda imunoenzimatica utilizata pentrua determina numarul de LT specifice
pentru un antigen.

Detectarea citokinelor intracelulare

Spre deosebire de tehnica ELISPOT , care identifica doar numarul de LT secretoare de o anumita citokina,
tehnica de detectare intracelulara a citokinelor permite si identificarea subtipului celular care produce
citokina. Dupa stimulare cu antigen, celulele vor fi incubate cu brefeldina A, care impiedica
exteriorizarea citokinelor secretate, astfel incat o cantitate importanta de citokina va fi depozitata
intracelular. Markerii de suprafata ai celulelor vor fi colorati cu fluorocromi care vor emite in spectrul
rosu, cu lungimi de unda diferite, dupa care se vor permeabiliza celule cu saponina, ceea ce permite
patrunderea anticorpilor anti-citokina in celula si fixarea pe aceasta. Utilizand o combinatie de anticorpi
marcati putem distinge celulele in functie de tipul de citokina sintetizata. Aparatul va detecta simultan
mai multe culori, permitand caracterizarea secretiei de citokine in functie de subtipul celular.

1
Dozarea citokinelor secretate
Un anticorp bispecific va permite captarea citokinelor secretate de catre LT activate, direct la suprafata
LT. anticorpii se fixeaza pe de o parte de CD45-un antigen de suprafata omniprezent, iar pe de alta de
citokina secretata care ne intereseaza. Un anticorp secundar anti-citokina, marcat cu un fluorocrom, se
va fixa pe aceasta. Celulele pot fi triate cu ajutorul unui citometru cu flux, sau cu ajutorul unui camp
magnetic, daca anticorpii sunt cuplati cu fier.
In comparatie cu tehnica de dozare a citokinelor intracelulare, aceasta tehnica permite pastrarea LT
integre, putand astfel fi asociata unor teste functionale.

Evaluarea imunitatii innascute

Evaluarea celulelor NK –celulele NK sunt imporatnte in sistemul imun innascut, fiind capabile sa lizeze
celulele infectate sau celulele tumorale. Deficitele celulelor NK cresc succeptibilitatea la infectiile virale,
dar sunt entitati clinice rare.
Evaluarea numarului de celule NK se realizeaza prin citometrie in flux: in mod normal deviaza lumina
anterior, ca si limfocitele, iar antigenele de suprafata CD56 si CD16 sunt caracteristice celulelor NK.
Utilizarea mai multor parametri permite separarea celulelor NK si evaluarea numarului acestora.
Evaluarea functiei celulelor NK se realizeaza prin abilitatea celulelor mononucleare periferice de a
induce liza celulelor tumorale sensibile la actiunea celulelor NK intr-un test cu eliberare de crom.
Evaluarea PMN –PMN sunt componente esentiale ale sangelui si au un rol central in inflamatia acuta.
Capacitatea PMN de a raspunde la o infectie se de a o elimina este rezultatul mai multor fenomene:
chimiotaxia la locul infectiei, aderenta la locul infectiei, recunoasterea si fagocitarea agentului infectios,
cresterea metabolismului si omorarea agentului infectios fagocitar.
Evaluarea numarului de PMN-numarul redus de PMN(neutropenie) sau deficitul functional al PMN duce
la morbiditate si mortalitate crescute. Neutropenia este usor de depistat printr-o hemoleucograma
completa cu formula leucocitara.
In evaluarea functionala a PMN ar trebui studiate toate etapele raspunsului inflamator. Testele care se
pot utiliza in acest scop sunt in majoritatea lor scumpe si complexe si nu sunt utilizate in mod curent.
Testele pot identifica deficite ale moleculelor de adeziune celulara si defecte ale metabolismului
respirator celular, care apar mai frecvent decat defectele chimiotaxiei si ale fagocitozei.

Fenotiparea prin citometrie de flux

-poate fi utilizata pentru determinarea nivelulu bazal de expresie al integrinelor, iar cu o stimulare
adecvata se poate evalua si capacitatea lor de a-si creste expresia la suprafata celulara.
Dupa recunoasterea si ingestia unui material strain,la nivelul PMN au loc modificari ale metabolismului
care duc la generarea de specii reactive ale oxigenului(metabolismul respirator) care, impreuna cu
mecanismele non – oxidative, vor determina omorarea agentului infectios. Importanta metabolismului
respirator este evidentiata de morbiditatea si mortalitatea importante asociate defectelor acestuia. Mai
multe mutatii au fost identificate ca fiind responsabile de boala cronica granulomatoasa, o boala
caracterizata prin scaderea metabolismului respirator al PMN.
Activitatea metabolismului respirator poate fi evaluata prin mai multe metode:testul de reducere a
colorantului nitroblue tetrazoliu(NBT), citometrie in flux si chemiluminiscenta.
Testul NBT implica preluarea NBT de catre celule, furnizarea unui stimul de activare si monitorizarea in
vederea obiectivarii reducerii colorantului,care devine albastru.
Citometria de flux se bazeaza pe reducerea unui alt colorant-dihidrorodamina-DHR, care este preluat de
catre PMN si este nefluorescent in celulele in repaus, si este redus si fluorescent in momentul in care
este indus metabolismul respirator, astfel facandu-se detectia de citometru.
Ambele metode detecteaza atat pacienti simptomatici cu boala granulomatoasa cronica, cat si purattorii
asimptomatici.

2
Chemiluminiscenta este generarea de lumina prin interactiunea dintre speciile reactive ale oxigenului si
organismul ingerat. Prin adaugarea de agenti de intensificare, lumina generata poate fi detectata de un
contor de scintilatie. Lumina eliberata este proportionala cu activitatea metabolismului respirator al
PMN, fiind redusa la pacientii cu boala granulomatoasa cronica si la purtatorii asimptomatici. Aceasta
metoda are o sensibilitate mai mare decat testul NBT.

Evaluarea complementului
Complementul este o componenta majora a raspunsului imun innascut, care conlucreaza cu alte
componente ale imunitatii innascute, dar si cu sistemul imun dobandit. Sistemul complement este
constituit din 40 de proteine care se activeaza in cascada.
Majoritatea componentelor sistemului complement sunt codificate de gene autozomale, un defect
heterozigot neavand relevanta clinica. Pentru a testa functia complementului total se pot utiliza doua
teste de baza: - CH50-complement hemolitic total-masoara functia complementului pe cale clasica;
-AH50-masoara functia complementului pe cale alternativa.
La pacientii cu un defect total al unui component hemoliza este absenta, in timp ce la cei cu un defect
partial hemoliza este redusa. Pentrua confirma defectul unei componente a complementului trebuie
utilizata o metoda imunochimica de dozare a componentelor individuale. Nefelometria –este metoda
disponibila pentru masurarea concentratiei individuale a componentelor cmplementului. In cazul
suspicionarii unui deficit functional al componentelor complementului se pot doza componentele de
clivare ale complementului, cum ar fi C4a,C4d,Bb. Prezenta componentelor de clivare sugereaza
prezenta complementului functional. Deficitele componentelor complementului sunt rare, iar istoricul si
tabloul clinic sunt foarte importante in stabilirea diagnosticului corect.

Evaluarea imunitatii umorale

Determinarea IgA, IgG, IgM, IgD, IgE
Dezvoltarea unor infectii in primii ani de viata si esecul vindecarii unor infectii chiar si cu terapie corecta
antimicrobiana vor ridica suspiciunea unui deficit imun umoral sau deficit al LB.
Acest deficit poate fi usor si sa creeze rareori probleme sau poate fi sever, pana la imposibilitatea
organismului de a sintetiza anticorpi.
Evaluarea imunitatii umorale va incepe de obicei printr-o hemoleucograma completa cu forma
leucocitara. In caz de deficit al imunitatii umorale numarul de limfocite poate fi usor scazut, dar si
normal.
Urmatorul pas in evaluare va fi dozarea cantitativa a claselor de Ig(imunoglobuline). Determinarea IgA,
IgG si IgM este efectuata de rutina, valorile normale fiind dependente de mai multi factori: varsta, sexul,
etnia, metoda utilizata. Dozarea IgD si a IgE necesita metode mai specializate. In unele situatii poate fi
necesara masurarea subclaselor de IgG.
Exista mai multe metode standardizate de determinare a concentratiei Ig serice. Metoda
clasica(imunodifuzia radiala simpla) a fost standardul utilizat timp indelungat,dar actual majoritatea
laboratoarelor utilizeaza nefelometria. Nefelometria reprezinta o modificare a reactiei de precipitare.
Reactia de precipitare are loc in prezenta anticorpilor in exces, de aceea cresterea cantitatii de antigen
va determina accentuarea disperisi luminii. Metodele nefelometrice automate utilizate actual dau
rezultate inalt reproductibile pentru cunatificarea Ig in ser, dar si in alte fluide.

Masurarea izohemaglutininelor in ser(anti-A,anti-B) este posibila la pacientii cu grup sangvin O,A sau B.
Izohemaglutininele sunt anticorpi predominant de tip IgM. Daca izoaglutininele sunt detectate in ser,
pacientul este capabil sa sintetizeze anticorpi fata de antigeni de grup sangvin. Absenta izoaglutininelor
la un pacient care nu are grupul sangvin AB sau concentratia redusa a izoaglutininelor vor indica sinteza
redusa de IgM si vor sugera necesitatea continuarii investigatiilor.

3
In cazul in care concentratia Ig serice este anormal de mare la un pacient cu infectii repetate, in special
la adulti, se va indica efectuarea unei electroforeze a proteinelor serice pentru a evalua prezenta unei
paraproteine, sugestiva pentru o boala maligna limfocitara. In plus, nivelul seric crescut al Ig poate fi
sugestiv pentru o infectie HIV.
In anumite circumstante poate fi necesara evaluarea numarului de LB circulante.

Izolarea celulelor mononucleate

- se poate realiza prin centrifugarea cu Ficoll-Hypaque a sangelui anticoagulant, metoda care se bazeaza
pe diferenta de densitate intre diversele componente ale sangelui. Substanta Ficoll are o densitate de
1.077g/l, iar dupa centrifugare, celulele cu densitate redusa(limfocite,monocite) vor pluti la suprafata,
iar celelate componente cor forma un cheag la fundul tubului. Celulele mononucleate vor fi recuperate
cu o pipeta , iar prin incubarea acestora intr-un flacon de cultura celulara, monocitele vor adera la
peretele de plastic, in timp ce limfocitele vor ramane mobile, putnd fi astfel izolate.
Separarea LT si LB-formarea de rozete
LT exprima la suprafata molecule de adeziune precum CD2 care interactioneaza cu CD58 de la suprafata
eritrocitelor de oaie. Tratarea enzimatica a eritrocitelor de oaie va expune moleculele de adeziune la
suprafata acestora, facandu-le accesibile pentru a interactiona cu CD2 de la suprafata LT. se formeaza
astfel rozete, compune dintr-un LT si mai multe eritrocite de oaie. Celulele ce formeaza rozetele pot fi
separate prin centrifugare cu Ficoll, urmata de liza hipotona a eritrocitelor, obtinand astfel LT de o
puritate de circa 95%. Celulele care nu formeaza rozete(in majoritate LB si monocite) vor pluti deasupra
Ficoll-ului si vor putea fi recuperate si separate.
Separarea populatiilor celulare cu ajutorul anticorpilor
Flacoanele de cultura pot fi acoperite cu anticorpi in prezenta unui pH alcalin. Punerea in contact a
acestor suprafete cu un amestec de celule va determina fixarea celulelor care exprima un anumit
antigen la suprafata tubului, iar celulele care nu se fixeaza vor fi eliminate prin decantare si spalare.
Celulele fixate vor fi recuperate prin manipulari mecanice si digestie enzimatica.
Cuplarea anticorpilor cu bile feromagnetice permite, de asemenea, izolarea unor celule care exprima un
antigen. Cu ajutorul unui magnet, celulele vor fi izolate din amestec. Aceasta este o metoda utila de
izolare a unor celule aflate in concentratii foarte mici in amestec, fiind potrivita pentru eliminarea
celulelor nedorite-selectie negativa.

Separarea populatiilor celulare cu ajutorul citometriei in flux

LB exprima la suprafata celulara antigene specifice. Anticorpii monoclonali fata de markeri de suprafata
ai celulelor sangvine au fost obtinuti, ceea ce permite identificarea tipurilor si subtipurilor celulare.
Imunofenotiparea prin citometria in flux se bazeaza pe utilizarea anticorpilor monoclonali care sunt
marcati cu fluorocromi diefriti. Anticorpii monoclonali care se leaga specific de structuri de suprafata sau
de antigeni intracelulari se utilizeaza pentru a defini stadiul de maturare,activare si capacitatea
functionala a tipurilor celulare specifice. Pentru izolarea LB se utilizeaza anticorpi anti-CD19.
Spre deosebire de citometrul clasic, un citometru care permite separarea subpopulatiilor celulare
contine un aparat de triaj celular activat de fluorescenta(FACS-fluorescence activated cell sorter), care
poate incarca electric o picatura in functie de fluorescenta sa:picatura cu o celula fluorescenta va fi
incarcata pozitiv, iar cea fara fluorescenta va fi incarcata tot pozitiv. Fluxul celular trece apoi printre
doua placi electrice de deviere, celulele pozitive si negative fiind deviate in sensuri opuse, putand astfel
fi colectate separat. Aceasta metoda permite obtinerea unor populatii celulare cu puritate 99%.