Universitatea Bucureşti

Facultatea de Biologie

Master Biologie Medicală

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator ştiinţific:

Lector dr. Lia-Mara Ditu

Absolvent:

Hagieșteanu Andreea

BUCUREȘTI
Iunie 2017
 Universitatea Bucureşti
Facultatea de Biologie
Master Biologie Medicală

Studiul incidenței infecțiilor cu tulpini de

Pseudomonas aeruginosa izolate din hemoculturi
provenite de la pacienții spitalizați

BUCUREȘTI
Iunie 2017
Cuprins
Introducere..................................................................................................................................2
Capitolul I - Caracterizarea generală a Genului Pseudomonas aeruginosa........................4
Taxonomie...............................................................................................................................4
Scurt istoric.............................................................................................................................4
Habitat.....................................................................................................................................4
Caracteristici morfologice şi genetice de cultură....................................................................6
Factorii de virulență și mecanisme de patogenitate................................................................8
Rezistența la antibiotice........................................................................................................17
Mecanisme de rezistență.......................................................................................................18
Pompele de eflux...............................................................................................................19
Rezistenţa la aminoglicozide (AGZ).................................................................................20
Rezistența la fluorochinolone............................................................................................20
Profilaxie...............................................................................................................................21
Capitolul II - Studiul incidenței infecțiilor cu tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate
din hemoculturi provenite de la pacienții spitalizați...........................................................22
Introducere............................................................................................................................22
Materiale şi metode...............................................................................................................23
Prelevarea probelor............................................................................................................23
Protocol Sistem Automat Bactec.......................................................................................23
Protocol Sistem hemocultură Signal..................................................................................25
Metode de identificare.......................................................................................................27
Materiale pentru antibiograma prin metoda difuzimetrică....................................................29
Metoda automata Vitek 2 Compact.......................................................................................31
REZULTATE ȘI DISCUȚII.................................................................................................33
Concluzii...................................................................................................................................40
Bibliografie...............................................................................................................................41

1
Introducere

Infectia nosocomială este o stare patologică, ce se răspândește în diverse medii

spitalicești și care conduce la o varietate de afecțiuni grave ( pneumonie, infecții urinare,
septis). Acestea au o rată de mortalitate mai mare decât infecția dobândită în comunitate.
În ciuda a 60 de ani de dezvoltare intensivă a antibioticelor, infecțiile bacteriene rămân
o cauză importantă a morbidității și a mortalității. Povara tot mai mare de rezistență erodează
eficacitatea antibioticelor convenționale, în timp ce pacienții critici nu răspund frecvent la
agenții adecvați, chiar și atunci când sunt infectați cu organisme susceptibile.
Studierea infecțiilor nosocomiale include întelegerea cauzelor ce au dus la aceste
infecții, caracteristicile pacienților ce au ajuns infectați și cât de des se întâlnesc.
Infecțiile cauzate de Pseudomonas aeruginosa sunt o problema majoră, ce afectează
pacienții spitalizați, în special pe cei imunocompromiși, aflați într-o stare critică.
Pseudomonas aeruginosa este un bacil Gram-negativ non-fermentativ, care poate
supraviețui în apa bidistilată, în soluția de heparină, în soluțiile antiseptice și dezinfectante.
Virulența este mediată de adezine, toxine, capacitatea de a forma biofilme mai ales, de
multirezistența naturală sau dobândită la antibiotice, ceea ce explică frecvența tot mai mare a
infecțiilor nosocomiale cu Pseudomonas.
Patogenul intraspitalicesc Pseudomonas aeruginosa este implicat în 10% din infecțiile
dobândite în spitalele din UE și SUA, acesta are o incidență puternică în pneumonie.
Principalele clase de antibiotice utilizate pentru tratamentul acesteia sunt piperacilina (singură
sau în combinație cu tazobactam) și ceftazidimă. Aminoglicozide, fluorochinolone și
carbapenemuri. În UE, 15% din tulpinile de P. Aeruginosa prezintă rezistențe combinate la cel
puțin 3 clase, iar 5% sunt rezistente la cele 5 clase. În UE, tulpinile de P. Aeruginosa
rezistente la carbapenem sunt prezente anual la aproximativ 10 000 de persoane. ( Fig 1.)

2
 Fig.1. Pseudomonas aeruginsa incidența rezistenței la carbapeneme în Europa, 2012 sursă : (European Centre

for Disease Prevention and Control, 2012)

Scopul lucrării este studiul incidentei infectiilor cu tulpini de Pseudomonas

aeruginosa izolate din hemoculturi provenite de la pacientii spitalizati.

Obiectivele lucrării au fost :

• izolarea și identificarea tulpnilor microbiene din hemoculturi provenite de la
pacienții internati pe secțiile ATI, Neurologie- terapie acută și Hematologie
• Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor izolate prin
metoda difuzimetră sau automată (Vitek 2 Compact)
• Analiza datelor obținute în vederea stabilirii a incidenței infecțiilor cu tulpini
de Pseudomonas aeruginosa în mediul spitalicesc.

3
 Capitolul I - Caracterizarea generală a Genului Pseudomonas aeruginosa

Taxonomie
Regnul: Bacteria
Filum: Proteobacteria
Clasă: Gamaproteobacterii
Ordin: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Gen: Pseudomonas

Scurt istoric
În anul 1981 se considera că existau circa 800 de specii de Pseudomonas,
contaminând în special plantele. Specia Pseudomonas aeruginosa, a fost izolată pentru prima
oară de către Carle Gessard, la Paris, în anul 1882. Acesta a evidenţiat printr-un experiment
pigmenţii secretaţi de celulele bacteriene, solubili in apă, care în lumină UV apar albastru-
verzui. Acesta a fost subiectul lucrării sale ´´Sur l´opportunite de conserver le nom d´espece
Pseudomonas pyocyanea´´ (Moore & Flaws, 2011).

Habitat
Membrii genului Pseudomonas demonstrează o mare diversitate metabolică și, în
consecință, pot coloniza o gamă largă de medii, cea mai mare afinitate având-o pentru mediul
acvatic.
Sunt reprezentați de bacili ubicuitari (agent de putrefacţie a materiei organice animale
şi vegetale), ce colonizează 15% dintre persoanele sănătoase, la nivel intestinal, axilar,
perineal etc, preferând zonele cu un grad de umiditate ridicat. Sunt bacili Gram negativi
(Fig.1.2.), aerobi, dar se pot adapta la condiţii de micro-aerofilie . Tulpinile acestei specii sunt
omniprezente în mediul acvatic , şi se găsesc adesea pe suprafaţa ţesuturilor vegetale şi
animale, în calitate de contaminanţi.

4
 Fig 1. 2. Frotiu colorat Gram – Bacili Gram-negativi, sp. Ps. Aeruginosa (original)

Cu toate că specia bacteriană este aerobă și nefermentativă, poate crește în absența O2,
doar dacă NO3 este prezent în mediu, având rol de acceptor de electroni la capătul catenei de
respirație. Ps. Aeruginosa este deseori izolat din apă distilă, dovadă ca are necesități nutritive
foarte simple. (Chifiriuc, Lazăr, Mihăescu, Microbiologie si virologie, 2011)
Agentul oportunist major al grupului, este foarte frecvent în mediile umede din spatele
și colonizeaza ca saprobiont organismul uman, dar devine patogen pentru indivii
imunocompromiși, la care poate produce infecții ale tractului urinar, ale aparatului respirator,
ale țesutului conjunctiv, dermatite, bacteriemii și o varietate de infecții sistemice, mai ales la
pacienții cu arsuri severe extinse, cu fibroză chistică, neoplazici sau la pacienții cu SIDA.
Ps. Aeruginosa, poate deveni membru al microbiotei organismului uman. Ratele
reprezentative de colonizare pentru zonele specifice sunt de : ≥2 % piele, ≥ 3,3% mucoasa
nazală, ≥ 6,6% pentru faringe și de la 2,6 – 24% în probele de fecale.

5
Caracteristici morfologice şi genetice de cultură

Pseudomonas este un microorganism ce prezintă dimensiuni variabile, între 0.5-0.8

µm/ 1.5-3.0 µm, mobil, cu 1-3 cili polari (există și tulpini neciliate), nesporulat. Uneori
prezintă capsulă.
Pseudomonas este o bacterie Gram negativă tipică, prezintă două membrane,
membrana externă și membrana internă (citplasmatică). Sunt separate de un spațiu gros,
vâscos periplasmatic, stratul de peptidoglican. Membranele celulare așezate în straturi
limitează mărimea celulelor, protejează de mediul extern, efectuează funcții importante cum
ar fi achiziționarea nutrienților, aderența, secreția, semnalizarea, patogenitatea și efluența
pompelor pentru excluderea antibioticelor (Baron, 1996).
Membrana externă a speciei Ps. aeruginosa are o permeabilitate scăzută, echivalentă
cu aproximativ 8% din cea a tulpinii de E. Coli, dar permite o limită exclusivă mare, adică
permite trecerea moleculelor cu dimensiuni până la 3000 Da comparativ cu 500 Da pentru E.
Coli (Nikaido, 2003).
Structura nucleului bacterian este compus din două lanțuri de polinucleotide, formate
din numeroase mononucleotide care la randul lor sunt compuse dintr-o adenină și o guanină
(baze purinice) și o timină și o citozină (baze pirimidinice).
Prezintă un genom bacterian mare (6-7 Mbp) și codifică aproximativ 6000 de ORF.
Cele 5 genomuri (PA2192, C3719, PA01, PA14, PACS2) , ce cuprind 5021 de gene, au
secvențe asemănătoare de 70%. Tulpinile speciei sunt extrem de diferite din punct de vedere
fiziologic, tocmai din cauza numărului mare de familii genetice.
S-au observat ORF- uri care au fost analizate pe baza asemănării cu secvențele
cunoscute, fără a avea o denumire exactă : reglatori transcripționali(341 gene), molecule
asemănătoare enzimelor (405 gene) și transporti de molecule mici (408 gene).
Izolatele de Ps. Aeruginosa pot produce trei tipuri de colonii. Izolatele naturale din sol
sau apă produc colonii de tip R. Izolatele clinice, produc una dintre cele două tipuri de colonii
netede (de tip S): colonii cu aspect de „ou ochi”, mari netede, cu marginile aplatizate și cu
profil ridicat, sau colonii cu aspect mucoid, izolate de obicei din secrețiile tractului respirator
și urinar, aspect datorat productiei de alginat . (Chifiriuc, Lazăr, Mihăescu, Microbiologie si
Virologie, 2011)
Din punct de vedere nutriţional sunt germeni puţin pretenţioşi. Pentru nutriţie,
folosește aproximativ 75 compuşi în acest scop.Conţine în jur de 300 sisteme citoplasmatice
de transport prin membrană, dintre care 2/3 sunt implicate în importul substanţelor nutritive.

6
Are un număr mare de transportori de mono- , di- şi tri- carboxilaţi însă este deficientă în
transportul zaharurilor.
Deşi dezvoltarea este deficitară pe mediile de cultură ce conțin zaharuri (Fig.1.3.),
fiind membru al grupului de bacili Gram negativi non-fermentativi, celulele bacteriene pot
folosi o mare varietate de compuşi organici. În adiţie la căile şi enzimele cunoscute implicate
în metabolism, există un număr mare de gene care codifică pentru moleculele asemănătoare
enzimelor caracteristice ß-oxidării , având, cu excepţia speciei M. tuberculosis, cel mai mare
număr de astfel de enzime. Se pot cultiva uşor pe medii simple în condiţii aerobe.

Fig.1.3 Aspectul culturii lactozo-negativă de Pseudomonas aeruginosa pe mediul Geloză Cled, la 24 de h de la

incubare (original)
Unele specii din genul Pseudomonas se pot multiplica la 4°C, dar cele mai multe au
temperatura optimă de multiplicare cuprinsă între 30 şi 37°C (Pseudomonas aeruginosa se
poate multiplica şi la 42°C). Pot apărea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dând impresia
prezenţei concomitente de bacterii diferite. Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor
de tei. Majoritatea tulpinilor de Ps Aeruginosa prezintă hemoliză pe placile de agar, și are un
luciu metalic ce se evidențiază în special pe geloză-sânge (Fig.1.4).

7
Fig.1.4 Aspectul culturii de Pseudomonas aeruginosa pe mediu Geloză sânge, la 24h de la incubare (orginal)

În concordanță cu versalitatea sa față de mediu, Ps. aeruginosa are aproape 300 de

sisteme de transport cu membrana citoplasmatică, aproximativ două treimi par a fi implicate
în importul de nutrienți și alte molecule. (http://www-biology.ucsd.edu/approxipaulsen/
transport)
Majoritatea infecțiilor cu Pseudomonas sunt atât invazive, cât și toxigenice. Infecția cu
Pseudomonas se desfășoară în trei etape :
 aderența bacteriană și colonizarea
 invazia locală
 invazia sistemică generalizată

Factorii de virulență și mecanisme de patogenitate

Pseudomonas aeruginosa produce numeroși factori care pot contribui la virulența sa.
Virulența reprezintă capacitatea relativă a unei tulpini patogene de a provoca
leziuni la nivelul unor țesuturi (de a coloniza, de a se multiplica și eventual de a invada
celulele și țesuturile gazdei și de a produce toxine), determinând o stare patologică la o gazdă
receptivă. Este corelată cu prezența unor structuri bacteriene, a unor proteine membranare sau
a unor particularitați fiziologice și de sinteză (ex : sinteza exotoxinelor/ exoenzime), denumiți

8
 factori de virulență, care determină producerea unor leziuni în organism (Chifiriuc și colab;
2011) .
Cu toate ca în ultima perioadă s-au făcut progrese majore în studiul virulenţei
tulpinii de Pseudomonas aeruginosa ca patogen oportunist, mecanismul infecţiei este încă
incomplet elucidat. Totuşi se cunosc majoritatea factorilor de virulenţă (Chifiriuc și colab;
2011):

 Exopolizaharide;
 Proteaze;
 Exotoxina A;
 Lipopolizaharide;
 Pigmenţi : piocianina, 1-hidroxifenazina, pioverdina;
 Fosfolipaza C;
 Fimbriile ( pili de tip IV) : alcătuiţi din pilină, cu lungimi între 1000 – 4000 nm şi diametru de
5.2 nm;
 Lipaza;
 Histamina;
 Exoenzima S;
 Leucocidina;
Sinteza mai multor astfel de poliptide este controlată la nivel transcripțional ca răspuns
la diverși factori de mediu. De exemplu, alginaltul, exotoxina A și hemolizina sunt reglate
prin osmolaritate, prezența ionilor de fier și concentrația de fosfat (Bjorn, Pavlovskis,
Thompson, & Iglewski, 1979).
În primul rând, factorii de virulență P. aeruginosa includ o varietate de toxine
extracelulare (Exotoxină A [ADP-riboziltransferază], fosfolipază C, elastază) care ar putea
cauza leziuni grave asupra țesuturilor gazdă prin activitățile lor enzimatice. Desigur, acesti
factorii joacă un rol important în infecțiile acute (de exemplu, la pacienții cu arsuri, în cazul în
care sunt masivi afectate țesuturile și septicemia sunt cea mai comună manifestare).
Lipopolizaharidele(LPS)

Activitatea endotoxică și de patogenitate a bacteriilor gram-negative este produsă de

lipopolizaharide. Acesta este un complex format din trei domenii, lipidul A, ce este inclus în
membrană, o oligozaharidă de bază scurtă și polizaharidul O, cu catenă lungă, ce este atașat
membranei.

9
 LPS localizate în membrana externă a bacteriilor Gram-negative este de o parte,
cunoscut pentru rolul său de protecție împotriva lizei cauzate de ser și, în al doilea rând,
pentru activitatea endotoxică. Este de asemenea implicată în stimularea răspunsului inflamator
și în interacțiunile cu țesuturile gazdă. Molecula LPS poate fi împărțit în trei porțiuni.
(Rocchetta, Burrows, & Lam, 1999)
• Lipidul A, cunoscut sub denumirea de endotoxină, este responsabilă pentru stimularea
sistemului imunitar și poate cauza șoc septic.
• Oligozaharid
• Polizaharidul O-antigen, denumite mai devreme polizaharidul-O cu lanț lung,
provoacă formarea de anticorpi, având o natură antigenică. Au fost identiicați 20 de serotipuri
diferite. Acesta este regiunea cea mai variabilă a LPS și diferă în ceea ce privește compoziția,
legătura, secvența și lungimea brațului. Un polizaharid-O tipic tulpinii de Ps. aeruginosa
constă în unități repetate de 3-5 zaharuri cum ar fi glucozamina, glucoza, ramnoză,
fucozamină și adesea acizi aminohexuronici (Wang & Quinn, 2010).
Fosforilarea LPS joacă, de asemenea, un rol în varibilitatea și rezistența intriseacă la
antibiotice (Walsh et al., 2000). Aceasta contribuie, la stabilizarea membranei exterioare prin
formarea unor punți ionice intermoleculare ce implică ioni de Ca++ și Mg++.
LPS au rol de determinant antigenic pe suprafaţa celulară, nu au rol în patogenitatea
infecţiei la pacienţii cu fibroză chistică şi au o toxicitate scăzută în comparaţie cu LPS ale
altor specii Gram negative.
Fosfolipaza este o enzimă extracelulară, termolabilă de aproximativ de 80 kDa, care
conține ioni de zinc esențiali pentru activitatea enzimatică. Au fost identificate trei fosfolipaze
C diferite specifice de substrat pentru Pseudomonas (Winstanley, Coulson, Wepner, Morgan,
& Hart, 1996).
Exotoxina A(ETA)
Exotoxina A cea mai toxică proteină extracelulară cunoscută de Ps aeruginosa, este
produsă de 90% din toate tulpinile. Doza letală medie a toxinei pure A este de aproximativ 0,2
ug / șoarece. Toxicitatea sa a fost atribuită capacității sale de a inhiba sinteza proteinelor în
celulele susceptibile. Acest lucru se realizează prin catalizarea transferului porțiunii ADP-
ribozil din nicotinamidadenin dinucleotidă (NAD) pe factorul de alungire 2 (EF-2).
Este secretat sub forma unei protoxine inactive de 71 kDa. Ca și toxina difterică, ETA
este compusă din două domenii: domeniul A (26 kDa) care posedă activitatea mono-ADP-
riboziltransferazei și domeniul B (45 kDa) care interacționează în mod specific cu receptorul

10
prezent pe suprafață A celulei gazdă și are ca rezultat stoparea sintezei proteinelor și
determină decesul celulei țintă prin necroză (Gallant și colab; 1891-1899).
ETA este internalizată prin mecanismul endocitozei mediate de receptori. Este apoi
preluctrată proteolitic în endosom şi generează fragmentare catalitic c-terminală. Prezintă
asemănări structurale şi ale modului de acţiune cu toxina difterică, dar diferă antigenic. Se
fixează pe un receptor diferit al celulei gazdă, dar pătrunde în celule printr-un mecanism
asemănător cu cel identificat pentru toxina difterică, şi blochează ca şi aceasta factorul 2 de
elongaţie al sintezei proteice. Producerea acesteia este reglată de Fe exogen .
Tulpinile toxigene sunt mai virulente şi produc o formă mai gravă de pneumonie decât cele
nontoxigene.
Toxina pare sa medieze atât manifestările locale cât și pe cele sistemice produse de
Ps. Aeruginosa. Are activitate necrozantă la situsul colonizării bacteriene. Cele mai virulente
tulpini pot provoca forme mai grave de pneumonie.
Exoenzima S
Exoenzima S este o exotoxină cu activitate ADP-ribozilantă, produsă în timpul
creşterii celulelor bacteriene în ţesutul lezat şi poate fi identificată în sânge înainte de apariţia
infecţiei. Aceasta poate inhiba funcţia fagocitelor din ţesut, favorizând invazia.
ExoS este un efector de secreție de tip III, care are atât în activitatea proteinei
activatoare GTP față de familia Rho a proteinelor G ( cu greutate molară mică) cât și a ADP-
riboziltransferază care vizează proteinele din familiile Ras, Rab, Rho.
Hemolizinele
Fosfolipaza C și rhamnolipidele acţionează sinergic pentru a descompune lipidele şi
lecitina şi contribuie la invazie prin efectele lor citotoxice asupra celulelor eucariote.
Rhamnolipidele sunt biosurfactanți glicolipidici de suprafață compuși din subunități
de L-rhamnoză și acid ß-hidroxidecanoic.
Proteazele
Elastaza clivează colagenul, Imunoglobulinele G şi A, şi proteinele complementului,
blochează motilitatea cililor, şi lizează fibronectina( proteină care protejează celulele
epiteliale de celulele bacteriene care tind să adere).
Proteaza alcalină interferă cu formarea fibronectinei, şi o lizează. Alături de elastază,
aceasta distruge substanţa fundamentală a corneei şi alte structuri de susţinere ce conţin
fibronectină şi elastină.
Proteazele produc leziuni tisulare, dar nu au un efect de toxicitate mare.
Exopolizaharidele

11
 Exopolizaharidele sunt polimeri de acid manuronic si glucuronic(alginat). Stratul
mucos de alginat formează matricea biofilmului care ancorează celulele bacteriene, şi le
protejează de fagocite, acţiunea cililor epiteliului tractului respirator, de anticorpi şi proteinele
complementului. Biofilmele mucoide sunt mai tolerante faţă de antibiotice în comparaţie cu
corespondentele lor planctonice (Chifiriuc și colab; 2011).
Biosinteza exopolizaharidelor se poate clasifica în următoarele etape : sinteza
substratului anterior, polimerizarea, transportul citoplasmatic către membrană, transportul
periplasmatic și exportul prin membrana externă.
O perioadă îndelungată s-a considerat că alginatul, a fost unicul exopolizaharid produs
de Ps. Aeruginosa. În schimb s-au evidențiat tulpini non-mucoide apte să producă biofilme
datorită mecanismelor Pel și Psl ce generează matrici polizaharidice.
Flagelul, pilii și alginatul, un alt grup de factori de virulență, sunt organe de motilitate
și aderență. Aceștia dau bacteriei capacitatea de a se atașa celulelor gazdă, de a coloniza
mediul și de a facilita infectarea gazdei prin evitarea sistemului imun.
Flagelul
Ca orice alt bacil gram-negativ comun, Pseudomonas are un flagel polar, ce nu se
poate examina la microscopul optic, dar se observă prezența sa pe preparatele din cultura vie,
prin mobilitatea celulelor bacteriene. În acest fel faciliteaza și chemotaxia. Este responsabil
pentru tipul de mobilitate „înot” și „roire”.
Din punct de vedere morfologic, flagelul are o structură filamentoasă compusă dintr-
un corp bazal, cârlig, filament extern și cap (Fig.1.5). Flagelina, proteină specifică, este
antigenul H.

12
 Fig.1.5. Compoziția unui flagel bacterian (http://www.biologyexams4u.com)
Din punct de vedere biochimic, flagelul prezintă aproximativ 11 tipuri de molecule
proteice. Filamentul extern și cârligul prezintă câte unul, iar corpusculul bazal are 9 tipuri de
proteine. Flagelina, este o proteină cu greutatea moleculară de 40 kDa, ce face parte din
structura filamentului extern, are o simetrie de tip tubular, canalicular, a moculelor.
Printr-o componentă comună a asialo-GM1 membranei, flagelul este de asemenea
implicat în virulență, induce un răspuns inflamator prin interacțiunea cu receptorii Toll, TR5
și TR2, ceea ce duce la producerea IL-8, IL-6 și mucină (DiMango, Zar, Bryan, & Prince,
1995). Flagelul este extrem de imunogen, în special în infecțiile cronice și în special în
fibroza chistică, P. Aeruginosa se adaptează în această situație prin selectarea mutanților fară
flagel pentru a eluda răspunsul gazdei.

Pilii
Ps. Aeruginosa se atasează celulelor epiteliale cu ajutorul fimbriilor (pili de tip IV a și
b), ce au un rol fundamental în virulență, în realizarea miscării de tirbușon, în procesele de
transformare genetică și în absorbția bacteriofagului.
Pilii de tip IV sunt structuri fibrilare lungi, alcătuite dintr-o singură proteină
structurală – pilină. Pilii, cu o lungime de 1000-4000 nm, diametrul de 5,4 nm, se pot relaxa
sau contracta, prin asamblarea și dezasamblarea subunităților de pilină de la baza pilului.

13
 Pilul de tip IVa prezintă o peptidă cu lungimea de 5-6 aminoacizi, în schimb pilul de
tip IVb este alcătuită din 15-30 de aminoacizi.
Retracția pilului ajută la formarea mișcarii. Gena pilA din operonul Pil codifică pilina,
ce este initial sintetizată sub forma unui precursor –prepilină- care este clivat, N-metilat și
asamblat în pilul matur. Fiecare proteină de pilină conține o regiune pentru legarea de
receptor, totuși regiunile pentru legare se găsesc doar la moleculele de la vârful pilului.
Regiunea terminală a pilului pare a fi prima care realizează contactul dintre bacterie și
celulele gazdei. Până la cinci monomeri de pilină sunt expuși la capatul pilului, rezultând un
receptor multivalent, comun pentru interactiile lectină-carbohidrat.
Mai mult, aceste structuri interactioneaza in vitro cu regiunea glicozilată a
glicosfingolipidelor asialo GM1 și GM2, localizate pe suprafața celulelor epiteliale
pulmonare.
Alginatul
Alginatul este o polizaharidă polianionică, liniară, formată din monomeri nonrepetitivi
de acizi ß-1, D-manuronici, și 4-L-glucuronici (Govan & Deretic, 1996).
Se poate defini ca o exopolizaharidă rigidă cu rol în stabilitatea structurală a
biofilmului bacterian. Tulpinile care produc alginat în exces, mucoide, prezintă o structură
heterogenă a biofilmului, acesta fiind esențial în producerea unui strat gros cu microcolonii
diferențiate. Acțiune sa se observă în mediile cu umitate scăzută, avănd rolul de a hidrata
biofilmul.
Factorul sigma AlgU, reglează secreția de alginat. Operonul său este exprimat
împreună cu genele ce au rol în biosinteză: algB, algC, algD, algR și amrZ. De asemenea
secreția de alginat este implicată în virulență, în comunicarea QS, și în reglarea motilității.
Pili CU
Piocianicul are în componență și un număr remarcabil de pili CU (chaperone usher) ce
au ca rol adeziunea la organismul gazdă. Pilii CU, cu ajutorul proteinei extramembranare
chaperone-usher, fixează fimbriile la nivelul bacteriilor Gram negative.
Fimbriile
Fimbriile sunt structuri de tipul unor apendice filamentoase , rigide sau flexibile şi
neuniforme ca lungime, care se extind la suprafaţa celulelor bacteriene cu rol în adeziunea
acestora la epiteliu. Acest termen a fost introdus de Duguid în 1955, iar în 1959, Brinton a
folosit termenul de pil. Ulterior, s-a sugerat folosirea termenului de ´pil´ să fie folosit pentru
structurile filamentoase codificate de plasmidele conjugative cu rol în procesul de conjugare,
ce constă în transferal unui fragment de ADN de la o celulă donor la una receptoare.

14
Fimbriile sunt alcătuite din molecule proteice de fimbrilină cu greutatea moleculară de 15-30
kDa, aşezate după o simetrie helicală. Dupa sinteză, fimbrilina este transferată extracelular, şi
depusă lşa baza fimbriei. Numărul acestora este de până la 1000 / celulă. Dacă sunt în număr
mare, au o dispunere pericelulară, iar dacă există în număr mic, au localizare polară sau
bipolară. Lungimea lor este foarte variabilă ceea ce sugerează vârsta lor diferită. Se pot
observa la microscopul electronic.
Pigmenţii
Piocianina este un pigment albastru secretat de bacterii, ce este implicat în numeroase
mecanisme patogene. Acesta suprimă răspunsul imun al celulei gazdă, induce apoptoza
neutrofilelor și crește producția de interleukină IL-8. Piocianina are un rol crucial în virulența
tulpinilor de P. Aeruginosa. Mai mulți autori au demonstrat proprietățile sale
oxidoreducătoare : piocianina oxidează glutationul și inactivează catalaza în celulele epiteliale
endoteliale din sistemul respirator, contribuind astfel la stresul oxidativ și conducând la
necroza țesutului respirator. Recent, s-a demonstrat că piocianina inactivează ATP-ul vacuolar
și transportul mitocondrial, având ca rezultat deteriorarea canalelor de clorură în timpul
fibrozei chistice (Lau GW și colab; 2004).
Piocianina modifică funcţia normala a cililor epiteliului respirator, dezagregă epiteliul,
exercită un efect pioinflamator asupra fagocitelor şi are rol în adeziunea bacteriană. În condiţii
de insuficienţă de Fe este produs un derivat al ei, piochelina cu rol siderofor.
De asemeni Ps. Aeruginosa produce și un pigment extracelular cu fluorescență verde
gălbuie, pioverdin, care funcționează ca un siderofor.
Pigmenţii sunt toxici pentru alte specii bacteriene,stimulează metabolismul oxidativ al
neutrofilelor şi inhibă proliferarea limfocitelor.
Lipaza
Lipaza este o enzimă ce contribuie la lezarea ţesutului prin cataliza hidrolizei lipidelor.
Factorul major pentru exprimarea activității lipazei a fost întotdeauna carbonul,
deoarece lipazele sunt enzime inductibile, astfel sunt produse în general în prezența unei surse
de lipide sau orice alt inductor cum ar fi acizii grași hidrolizabili, esteri, săruri biliare și
glicerol. (Lotti et al., 1998).
Reglarea și coordonarea expresiei factorilor de virulență se realizează printr-o serie de
mecanisme. În cazul bacilului piocianic s-a observat sistemul de reglare cu doua componente
(quorum sensing and response). Determinarea QS permite bacteriei să restricționeze
exprimarea genelor specifice la densitățile celulare ridicare la care fenotipurile vor fi cele mai
benefice.

15
 Patogenul oportunist Pseudomonas aeruginosa folosește QS pentru a coordona
producerea exopolizaharidelor, biofilmelor, a motilității rotative, a virulenței si a adeziunii
celulare. Celulele bacteriene care utilizează QS produc constitutiv și secretă molecule de
semnalizare. Acestea prezintă de asemenea un receptor care poate detecta în mod specific
molecula de semnalizare (inductor). Când inductorul leagă receptorul, acesta activează
transcripția anumitor gene. Astfel, pentru ca transcripția sa fie activată, celula trebuie sa
primească molecule de semnalizare secretate de la celulele din jurul său. Pe măsura ce
populația bacteriană crește, concentrația inductorului trece de prag, provocănd sintetizarea
mai multor inductori.
Importanța reglării exprimării genelor QS și a producției de AHL a devenit evidentă
odată cu dobândirea cunoștințelor referitoare de genele reglatoare QS. Multiple studii au
identificat numeroase gene reglate de QS pe tulpinile de Ps. aeruginosa, multe fiind factori de
virulență(De Kievit & Iglewski, 2000).
Având în vedere că QS reglează o gamă largă de factori care joacă roluri atât de
diverse în funcțiile tulpinii de P. aeruginosa, este important să se examineze modul în care
QS afectează patogeneza acestei bacterii. Multe studii care examinează QS în timpul infecției
au utilizat tulpini de P. aeruginosa care au deleții ale uneia sau mai multor gene legate de QS,
în plus față de tulpinile cu fenotip sălbatic. S-au realizat studii privind rolul QS în infecțiile
cauzate de Ps. aeruginosa pe trei exemplare de șoareci cu patologii diferite: arsuri, pneumonie
acută și infecție pulmonară cronică. S-a demonstrat în cazul fiecăruia că deleția uneia sau mai
multor gene QS conduce la reducerea virulenței speciei în comparație cu fenotipul sălbatic al
Ps. aeruginosa (Rumbaugh, Griswold, & Hamood, 1999). Aceste date confirmă faptul că
sistemele Las și Rhl QS sunt esențiale pentru difuzarea tulpinii de Ps. Aeruginosa, facilitând
apariția septicemiei, infecției pulmonare acute sau cronice, patologii ce pot duce la
mortalitate.

Bacilii Gram-negativi , prezintă 3 sisteme de secreție ale factorilor de virulență

 sistemul de secreție de tip I, este compus din proteina de transport AprD, proteina AprE și
proteina membranei externe AprF, cu rolul de conduce secreția de protează alcalină
 sistemul de secreție de tip II, compus din genele pilD/xcpA și grupul genelor xcp.
 Sistemul de secreție de tip III secreția exoenzimelor S, T și Y (Ball, Chapon-Hervé, Bleves,
Michel, & Bally, 1999).

16
 La Ps. aeruginosa genele sistemului de secreție sunt localizate pe cromosom. Sistemul
de tip III are rolul de secreta și de a împinge factorii de virulență direct în celula gazdă, unde
moleculele secretate interferă cu căile de semnalizare ale gazdei. Sistemul de secreție de tip III
transloca fosfolipaze în celulele gazdă ce provoacă citotoxicitate față de epiteliul alveolar
(Chifiriuc și colab; 2011).

Tab 1.1. Manifestări clinice ale infecției cu Ps. Aeruginosa (Băicus; 2010)
Manifestări clinice
Infecție pulmonară
Infectie tegumentară
Infecții urinare
Otite externe
Infecții oculare
Ulcer cornean
Bacteriemie
Endocardite
Localizarea infecției
Tract respirator inferior (traheobronșită,
bronhopneumonie necrotizată, rata
mortalității este de 70%)
Colonizarea plăgilor (necroză tisulară,
bacteriemie)
Foliculită după imersie cu apă contaminată
Pacienți cu sonde/catetere timp îndelungat
Otită externă malignă cu extinderea infecției
în profunzime, distrugerea nervilor cranieni
și a oaselor
Pacienți cu leziuni ale coornei
Infecții valve aortice sau mitrale
Condiții favorabile
Pacienți imunodepresați
Dezechilibru microbian
intestinal prin terapie de lungă
durată cu antibiotice cu
spectru larg
Ventilație asistată
Pacienți cu arsuri
Bazinele de inot
Selectia tulpinilor rezistente
prin tratament de lunga durata
Pacienți cu diabet sau bătrâni
Bazine de inot
Expunerea la apă contaminată
Pacienți cu imunitate redusă,
neutropenie, diabet (asociată
rar cu leziuni tegumentare,
hemoragige, necrotice)
Utilizatori de droguri cu
administrare intravenoasă

Rezistența la antibiotice
Ps. aeruginosa reprezintă o provocare terapeutică serioasă pentru tratamentul
infecțiilor comunitare și nosocomiale, iar selectarea antibioticului adecvat pentru inițierea
terapiei este esențială pentru optimizarea rezultatelor clinice.
Rezistența la antibioterapie reprezintă capacitatea unei bacterii de a supraviețui în
prezența antibioticelor. Pseudomonas aeruginosa prezintă atât rezistență naturală cât și
dobândită.
Rezistența naturală este formată dintr-o asociere de mai mulți factori :
• peretele celular are o permeabilitate scazută datorită caruia prezintă rezistență la o
varietate de agenți infectioși.

17
• Genetic, prin mutațiile cromozomiale din genele care stabilesc rezistența genetică
(poate dobândi gene suplimentare de rezistență de la plasmide, transpozomi sau bacteriofagi)
• Ansamblul de bacterii din plamâni, izolate în special de la pacienții cu fibroză chistică,
sunt înconjurate de un strat de polizaharid alginat. Antibiocele cationice, de genul
aminoglicozidele, se leagă de acest strat, astfel fiindu-le restricționată difuzia.
Rezistența dobândită se exprimă genetic sau fenotipic.
Rezistența dobândită este se poate clasifica în trei grupe:
a) prin schimbarea țintei antibioticului
b) scăderea cantității de antibiotic prin diminuarea permeabilității
c) suprimarea antibioticului
Rezistențele dobândite se bazează pe mecanisemele enzimatice (penicilinaze,
cefalosporinzare, beta-lactamaze cu spectru extins, metalo-enzime) sau neenzimatice
(impermeabilitate, mecanism de eflux și modificarea țintei antibioticului) .

Mecanisme de rezistență
Rezistența multiplă la antibiotice a fost raportată pentru prima oară în Japonia în 1956,
când se considera că rezistența este mediată de elemente extracromozomale genetice,
plasmidele. Mai târziu, s-a stabilit că elementele transferabile localizate în plasmide erau
responsabile pentru gene codificatoare pentru rezistența. În anii 1980 s-a constatat că sistemul
genetic responsabil pentru colectarea determinanților rezistenței la transpozomi au fost
integronii (Kahlon, 2016).
Activitatea sistemului imunitar este modulată de o varietate de molecule bacteriene,
ce au un rol efect stimulator (adjuvant), sau au rolul de a diminua reactivitatea imunitarã. Cu
ajutorul mecanismelor de semnalizare, moleculele bacteriene modifică raspunsul celulelor
imunitare competente (molecule imunomodulatoare). Efectele lor produc un echilibru
complex între mecanismele de recunoaştere şi neutralizare a antigenelor şi virulenţa
bacterianã. Imunomodulatorii pot avea efecte asupra limfocitelor T, B şi asupra macrofagelor,
similare cu cele produse de citochine.
Imunomodulatorii cu activitate mitogenicã, induc activarea policlonalã a limfocitelor
T şi B, care se deosebeşte de activarea specificã. Rezultatul este sinteza anticorpilor cu
specificitãţi multiple, dintre care, o fracţie sunt specifici faţã de agentul infecţios. Deşi fãrã
specificitate, sinteza rapidã a anticorpilor poate fi suficientã pentru stoparea infecţiei.

18
Moleculele imunomodulatoare modificã nu numai reactivitatea imunitarã, ci şi mobilitatea
celulelor, în special a fagocitelor (de exemplu, pot inhiba migrarea macrofagelor din focarul
inflamator). Dacã moleculele imunomodulatoare persistã în ţesuturi, stimuleazã cronic
sistemul imunitar, cu efecte patologice autoimune, cea mai cunoscutã fiind artrita de adjuvant.
Multe molecule imunomodulatoare de origine bacterianã au efecte mai generale, care
se extind asupra altor sisteme: ele produc febrã, influenţeazã sistemul de coagulare sanguinã,
concentraţia ionilor, a Fe etc.
Moleculele bacteriene cu rol imunomodulator sunt localizate pe suprafaţa celulei. Ele
sunt polimeri ai învelişului, dar şi molecule excretate, cu efect toxic. Pe de altã parte, eficienţa
rãspunsului imun antibacterian, depinde de raportul dintre reactivitatea sistemului imunitar şi
mecanismele de autoprotecţie ale bacteriei, menite sã devieze rãspunsul imun.
Bacteriile cu localizare extracelularã induc un rãspuns imun mediat humoral.
Activarea limfocitelor B este rezultatul cooperărilor celulare macrofag-limfocit B-limfocit Th.
In focarul de inflamaţie, bacteriile cu localizare extracelularã determinã formarea abcesului, în
care predominã polimorfonuclearele.
Infecţiozitatea microorganismelor patogene este dependentã de capacitatea lor de a
coloniza ţesuturile gazdei şi de a contracara mecanismele de apãrare ale gazdei. Capacitatea
de variaţie rapidã a moleculelor de suprafaţã este o trãsãturã evolutivã comunã în tot spectrul
patogenilor. Se cunosc exemple de bacterii patogene care au elaborat mecanisme ce permit
variaţia antigenicã rapidã şi eficientã. Moleculele de suprafaţã prezintã regiuni bine
conservate, ancorate în membranã, dar nu sunt niciodatã expuse contactului cu sistemul
imunitar al gazdei. Rata înaltã de mutaţie produce un numãr mare de variante antigenice.
Se observă rolul catalazelor în protecția biofilmelor bacteriene, prin compararea a 3
tulpini de Ps. aeruginosa diferite, KatA¯, KatB¯ și PAO1. Pe tot perioada de creștere a
celulei bacteriene, catalaza KatA¯ este activă, în schimb KatB¯ devine activă în urma
expunerii la H2O2, pe parcusul creșterii este supresată. (Elkins, Hassett, Stewart, Schweizer,
& McDermott, 1999).

Pompele de eflux
Sunt mecanisme de rezistență dobândite neenzimatice și se găsesc în aproape toate
speciile bacteriene, iar genele care codifică această clasă de proteine pot fi localizate pe
cromozomi sau plasmide (Poole, 2007).
Elementele genetice care codifică sistemele de eflux pot fi codificate pe cromozomi
sau pe plasmide, contribuind astfel atât la rezistența intriseacă cât și la cea dobândită. Ca
19
mecanism intrisec de rezistență, genele pomei de eflux pot supraviețui unui mediu ostil, în
prezența antibioticelor, care permite selectarea mutațiilor care exprimă excesiv aceste gene. A
fost localizat pe elemente genetice precum plasmidele sau transpozonii, permite astfel o
răspândire ușoară a genelor de eflux între specii îndepărtate. Exprimarea mai multor pompe
de eflux la o specie bacteriană poate duce la un spectru larg de rezistență.
La Ps. aeruginosa au fost descrise patru sisteme de eflux diferite : MexAB-Oprm,
MexXY-Oprm, MexCD-OprJ, MexEF-oprN10.
Primul sistem de eflux al speciei de Ps. aeruginosa observat a fost MexAB-Oprm, se
exprimă în celule cultivate în mod constitutiv în mediile standard din laborator. Contribuie la
o rezistență intrisecă la fluorochinolone, β-lactam, tetraciclină, macrolide, cloramfenicol,
novobiocin, trimetoprim și sulfonamide.
Beta – lactamaze cu spectru extins (ESBL)
ESBL sunt beta-lactamaze capabile să hidrolizeze β-lactame, cu excepția
carbapenemelor și cefamicinelor. Acestea sunt inhibate de inhibitorii de β-lactamază, cum ar
fi acidul clavulanic, sulbactam și tazobactam. Se regăsesc în structura enterobacteriilor si a
altor bacili gram-negativi (Paterson & Bonomo, 2005).
Rezistenţa la aminoglicozide (AGZ)
Aminoglicozidele, familie de antibiotice, are ca mecanismul de rezistență de tip
bactericid. Sinteza proteinelor devine inhibată de amino-glicozide, prin legarea între
subunitățile ribozomale 30S și 50S.
Tulpinile sălbatice de P. aeruginosa sunt sensibile la toate aminoglicozidele.
Rezistenţa dobândită se datorează unor numeroase mecanisme gen impermeabilitate, eflux,
inactivare enzimatică, mutante respiratorii sau combinaţii ale acestor mecanisme. Rezistenţa
prin impermeabilitate este frecventă datorită enzimelor plasmadice (Hancock, 1998).
Denaturarea țintei de acțiune a antibioticului se realizează prin modificarea unui aminoacid din
structura unei proteine ribozomale, astfel se produce scăderea afinității subunității 30S.
Rezistenţa la aminoglicozide şi colistin s-a cercetat pe tulpini de P. aeruginosa prin
supraexpresia unei proteine din membrana externă, oprH, care protejează LPS, stopând legarea
antibioticului (Gilleland, Gilleland, Gibson, & Champlin, 1989).
Rezistența la fluorochinolone
Fenotipul natural al tulpinii de Ps. aeruginosa este rezistentă la trimethoprim-
sulfamethaxazol. În vitro tulpinile sălbatice de Ps. aeruginosa sunt susceptibile la marea

20
majoritate a fluorochinolonelor: ciprofloxacin, levofloxacin, norfloxacin, perfloxacin și
ofloxacin.
Colistin are o activitate excelentă în vitro împotriva multor specii de organisme Gram
negative, iar anterior a fost printre puținele antibioterapeutice utilizate pentru tratarea
bacteriemiilor provocate de tulpinile de Ps. Aeruginosa. Cu toate acestea, utilizarea colistinei
trebuie limitată deoarece are o nefrotoxicitate și neurotoxicitate semnificativă/
Bacteriemia reprezintă prezența unor microorganisme în sânge
Bacteriemia poate fi de trei tipuri
• Bacteriemie tranzitorie – este o infeție localizată și se remite spotan, de obicei apare în
urma unor intervenții stomatologice, chirurgicale, a unor screeninguri invazive (bronhoscopie,
endoscopie) și la unii pacienții cateterizați ;
• Bacteriemie intermintentă – infectie localizată ce se descarcă în sange ;
• Bacteriemie persistentă/ continua – stare septică a pacientului, ce prezintă manifestări
clinice severe, precum febră, hipoxie, frisoane si poate intra în șoc septic. (endocardită,
anevrisme infectate) ;

Profilaxie
Chiar dacă persoanele sănătoase sunt rareori infectate, în final apare o singură
întrebare „ce putem face daca suntem infectați?”. Rata mortalității pentru bacteremia
produsă de o tulpină de Ps. aeruginosa este mai mare de 10% și este cel mai adesea dobândită
într-un mediu intraspitalicesc.
Răspândirea Ps. aeruginosa poate fi controlată cel mai bine prin respectarea
procedurilor de izolare adecvate, prin tehnica aseptică și prin curățarea și monitorizarea atentă
a pacienților ventilați mecanic, a cateterelor acestora și a instrumentelor medicale. Terapia
locală a rănilor arse cu agenți antibacterieni, cum ar fi mafenidul sau sulfadiazina de argint,
cuplată cu debridarea chirurgicală, a redus dramatic incidența sepsisului P aeruginosa la
pacienții cu arsură.
Pseudomonas aeruginosa este rezistent la multe antibiotice frecvent utilizate. Deși
multe tulpini sunt susceptibile la gentamicină, tobramicină, colistină și amikacină, s-au
dezvoltat forme rezistente, ceea ce face ca testarea sensibilității să fie esențială. Combinația
dintre gentamicină și carbenicilină este frecvent utilizată pentru tratamentul infecțiilor severe
cu Pseudomonas, în special la pacienții cu leucopenie. Sunt testate mai multe tipuri de
vaccinuri, dar în prezent nu sunt disponibile pentru uz general.

21
Capitolul II - Studiul incidenței infecțiilor cu tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate
din hemoculturi provenite de la pacienții spitalizați

Introducere
În 2012, au fost raportate din mai multe țări, în special din sudul și estul Europei,
procente ridicate de tulpini de Pseudomonas aeruginosa rezistente la aminoglicozide,
ceftazidime, piperacilină/tazobactamul și carbapenemii. Rezistența la carbepenemuri a fost
mai mare cu 10% în 19 din 29 de țări raportoare. A existat și rezistență combinată comună,
14% din tulpinile izolate raportate fiind rezistente la cel puțin trei clase antimicrobiene.

P. aeruginosa este al treilea cel mai frecvent agent patogen Gram-negativ care
provoacă bacteriemii. Estimările dintr-un studiu transversal realizat în centrele de îngrijire
terțiară din America de Nord și America Latină, publicate de Programul de supraveghere
antimicrobiană SENTRY, au arătat că P. aeruginosa a contribuit la 10,6% din infecțiile
nosocomiale cu bacili Gram-negativi și la cele comunitare dobândite în 1997.

Hemocultura reprezintă un test calitativ prin care se determină bacterii sau fungi
prezenți în sânge. Sângele, în mod normal este steril, iar prezența diverselor microorganisme
în sânge, provenite dintr-un focar septic sau de pe o mucoasă lezată, se numește bacteriemie
sau fungemie.

În ultimi ani, incidența tulpinii de Pseudomonas în bacteriemii devine din ce în ce mai

serioasă în tările în curs de dezvoltare din cauza lipsei măsurilor generale de igienă, a
producerii în masă a unor soluții septice, și datorită mecanismelor de virulență dobantite a
microorganismelor.

Infectiile nosocomiale reprezintă o problemă majoră, de aceea scopul lucrării este

studiul incidentei infectiilor cu tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din hemoculturi
provenite de la pacientii spitalizati.

Obiectivele lucrării au fost :

22
 • izolarea și identificarea tulpnilor microbiene din hemoculturi provenite de la
pacienții internati pe secțiile ATI, Neurologie- terapie acută și Hematologie
• Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor izolate prin
metoda difuzimetră sau automată (Vitek 2 Compact)
• Analiza datelor obținute în vederea stabilirii a incidenței infecțiilor cu tulpini
de Pseudomonas aeruginosa în mediul spitalicesc.

Materiale şi metode
Prelevarea probelor
Studiul s-a realizat pe 2 loturi de pacienți în laboratoarele din cadrul spitalului
Colentina și al spitalului Pantelimon pe o perioadă de 5 luni de zile, din luna ianuarie 2017
până în mai 2017. Hemoculturile au fost prelevate de la de pacienți spitalizați pe secțiile ATI,
Neurologie –Terapie acută, Hematologie cu vârste cuprinse între 23- 86 de ani, fiind
analizat un număr total de 756 de probe.
Pentru fiecare pacient se recoltează cu o seringă, aproximativ 20 ml (10ml/flacon) de
sânge venos. Pentru a evita suprainfectarea probelor, recoltarea sângelui trebuie realizată în
condiții de asepsie, astfel se evită contaminarea hemoculturii cu microorganisme saprofite,
din mediul extern sau de la nivelul tegumentelor pacientului. Cei 20 de mL de sânge recoltați
în seringă sunt introduși în doua flacoane ce conțin medii de cultură de creștere pentru specii
bacteriene aerobe și anaerobe.
Hemoculturile se pot recolta de mai multe ori cand pacientul are un puseu febril, sau
frison.
Protocol Sistem Automat Bactec
Flacoanele de hemocultură sunt înregistrate și etichetate, apoi introduse în aparat, în
poziția indicată (Fig.2.1). În cazul sistemelor automate, probele sunt ținute la incubat timp de
5-7 zile la 35 º C, dar fiind monotorizate la fiecare 10 minute, probele pozitive pot fi detectate
și dupa 8 ore.

23
 Fig.2.1 Flacoane de hemoculturi cu medii de cultură speciale pentru specii bacteriene aerobe și anaerobe
(original)

Principiul de lucru a sistemului Bactec este de fotofluorescență, aparatul introduce un

marker în flaconul de hemocultură care va emite fluorescență în prezență de CO2( creșterea
microorganismelor în flacon produce CO2, moficări ale pH-ului). Datele sunt trimise catre
computer în urma masurării nivelului de fluorescență de către fotodetectorul aparatului.
Flacoanele pozitive sunt evidențiate printr-un semnal auditiv și sonor, poziția acesteia în
aparat va fi afișată pe ecran (Fig.2.2).

Hemoculturile se recoltează în puseu febril sau cand pacientul prezintă frison, de

preferat înaintea administrarii antibioterapiei. O hemocultură negativă, poate fi fals-negativă
din mai multe cauze, chiar daca pacientul prezintă simptome ale unei infecții majore: nu a
fost recoltată în perioada febrilă sau de inițierea pacientului cu antibiotice, fară a specifica
acest lucru. Un rezultat fals-pozitiv poate fi dat de o suprainfecție a probei în momentul
recoltării, de erori de temperatura a aparatului

24
 Fig. 2.2. Sistemul Automat Bactec 9050 (original )

Protocol Sistem hemocultură Signal

Deși concepute în primul rând pentru cultivarea microorganismelor din probele de
sânge, o serie de publicații au arătat că sistemul de cultură Signal, este eficient și în depistarea
microorganismelor din alte fluide ale corpului, precum fluidele articulare, abdominale și
lichidul pentru dializa peritoneală.
Este compus dintr-un flacon de cultură care se pune în termostat până la 7 zile, la
37ºC. În cazul pozitivării, metabolismul microbian degajă CO2, astfel prin presiunea formată,
împinge fluidul de cultură să treacă într-un compartiment semnal (Fig.2.3).
Volumul optim de sânge recoltat într-un flacon este de 10 ml. Flaconul este incubat la
37ºC timp de o oră, dupa care i se introduce compartimentul semnal de creștere. În primele 24
de ore ale perioadei de incubație de șapte zile, flaconul se așează pe un agitator orbital.

25
 Fig.2.3. Flacon de hemocultură pozitivă Signal (original)

4. Prelucrarea hemoculturilor pozitive :

a) Examinare microscopică a frotiului pentru a se evidenția etiologia posibilă
b) Repicarea hemoculturii, în cazul în care s-a observat prezența unor bacili/coci Gram
negativi pe geloză-sange, Cled/MacConkey,Chapman, Sabouraud, mediu TSI, MIU și citrat
Simmons.
c) Antibiograma prin metoda difuzimetrică

Materiale necesare pentru realizarea unei culturi din hemoculturile pozitive

1. Flacoanele de hemoculturi aerobe și anaerobe cu aproximativ 10 ml de sânge pentru
sistemul automat Bactec 9050 / Flacoane de hemoculturi sistem Signal
2. Plăci pentru însămânțat hemoculturile pozitive ;
 Geloză-sânge
 Cled Agar/MacConkey, Mediu selectiv ( fermentează lactoza)
 Chapman (fermentează manita)
 Sabouraud (mediu pentru levuri)
3. Seringă sterilă de 10 ml ;
4. Ansă ;
5. Termostat ;
6. Lame pentru realizarea frotiurilor ;

26
a) Protocol Colorație Gram a frotiului
 Lama este acoperită cu o soluție violet de gențiana timp de un minut după care se spală cu apă
 Se adaugă lugol timp de un minut dupa care se îndepărtează fara spălare
 Adăugăm alcool acetonă până la 20 de sec. până preparatul devine incolor, dupa care se
clătește cu apă
 Se adaugă fuxină timp de un minut
 Se lasă să se usuce.
b) Însămânțarea hemoculturilor pozitive pe geloză-sânge, Cled, Chapman și Sabouraud se
realizează prin disperasarea produsului în formă de pentagon pentru a obține astfel colonii
izolate (Fig.2.4.).

Fig.2.4.Aspectul mediilor selective inainte de insamantare (original).

Metode de identificare

Sisteme multitest utilizate pentru evidențierea caracterelor biochimice ale

microorganismelor

TSI
 În partea de jos a tubului fermentează glucoza dacă porțiunea respectivă se modifică din roșu-
portocaliu în galben, adică este glucozo-pozitiv.
 În porțiunea de mijlocul a tubului, dacă producerea de H2S este pozitivă se va înnegri zona.
 În partea înclinată a tubului are loc fermentarea lactozei și zaharozei, aceasta este pozitivă
daca are loc virarea culorii spre galben (Fig.2.5.).

27
 Fig.2.5. Aspectul culturii pe mediu TSI (sursa: http://atlas.microumftgm.ro/bacteriologie/bactgen/cbio.php)

Tulpina de Ps. aeruginosa fiind un bacil Gram-negativ nefermentativ, nu degradează

lactoza, glucoza și zaharoza și nu produce H2S.

MIU
Însământarea se realizează prin înțeparea mediului profund.
Mobilitate : Coloana devine în totalitate opacă în cazul unei bacterii mobile, daca doar
traiectul de însămanțare a devenit opac este o bacterie imobilă
Indol : Pentru testarea indolului se adaugă în eprubetă o bandă cu reactiv Erlich, cu
capătul galben la un cm deasupra mediului. Producerea de indol se observă prin înroșirea
benzii .
Uree : Dacă hidroliza ureei are loc, coloana fiind alcanizată, din galben devine rosie
(uree pozitivă). Daca culoarea coloanei este neschimbată - ureaza negativa
Agar Citrat Simmons
Se utilizează pentru diferențierea speciilor Gram negative în funcție de citrat.
Speciile bacteriene care folosesc ca sursă de azot, respectiv carbon fosfatul diacid de
amoniu și citratul de sodiu produc o reacție de culoare, astfel virează din verde în albastru.
Specia bacteriană care nu foloseste citratul– albastră
- bacteria utilizează citratul – culoare albastră.

Tabel 2.1. Caractere biochimice evidențiate la specia de Ps. aeruginosa

TSI MIU CITRAT FENILALANINA
SIMMONS
Ps. G/G H2S L/Z MOB. IND UREE
-/+ -
- - +/- - - -

28
 Testul oxidazei
Cu o ansă se descarcă o colonie bacteriană pe o bandă de hartie, care în cazul
pozitivării va vira în mov printr-o reacție de culoare cu pigment mov (Fig.2.6.).

Fig.2.6. Test biochimic oxidazo-pozitiv (original)

c) Metoda difuzimetrică sau Kirby-Bauer

Este cel mai comun procedeu de a testa rezistența sau sensibilitatea la antibiotice a
bacteriilor G(+) si G(-). Rezultatele il ajută pe clinician sa ia o decizie în administrarea
tratamentului.

Materiale pentru antibiograma prin metoda difuzimetrică

Placă geloză Mueller Hinton
Discuri antibiotice
Termostatul la 37ºC
Ansă de 2 mm
Tampoane de bumbac sterile
Eprubete pentru realizarea inoculului
Ser fiziologic
Riglă pentru măsurarea diametrele antibioticelor inhibitoare

Metodă
Tuburile de incoculare se pun în stativ, iar cu o pipetă se toarnă 2 ml de ser.
Cu vârful unei anse se atinge perpendicular pe suprafața de agar, de unde se iau
colonii izolate cu diametrul mai mare de 1 mm, fara a penetra agarul. Nu se răzuie și nu se
trage tamponul peste colonii.

29
 Apoi ansa este plasată în tubul de inoculare, apasând în jos cu o mișcare de răsucire
pentru a asigura o etanșare strânsă
Tubul se rotește timp de 10 secunde pentru a elibera bacteriile din vârful tamponului.
În cazul în care microorganismul nu este eliberat de pe ansă se lasă 5 minute în soluție după
care se repetă aceași mișcare.
Suspensia bacteriană trebuie folosită până la 6 ore de cand a fost realizată. Dacă nu
este utilizată imediat dupa preparare, tubul trebuie agitat pentru a suspenda din nou bacteriile.
Se utilizează plăci Muller Hinton (prezintă o valoare nutritivă mare ce permite
dezvoltarea ideală a microoganismelor și în același timp nu au inhibitori pentru acțiunea
antibioticelor) care sunt scoase din frigider și lăsate sa ajungă la temperatura camerei înainte
de a fi însămânțate.
Un tampon steril se pune în suspensia bacteriană, se rotește cu presiune asupra
peretelui interior al tubului pentru excesul de lichid.
Suspensia bacteriană de pe tampon se dispersează pe mediul Mueller Hinton, pentru a
obține o creștere uniformă, se foloseste o singură direcție. Se repetă de trei ori în aceași
direcție la unghi de 90 º. Se determină turbitatea culturii conspunzătoare etalonului 0,5
McFarland – automat pe densitometru.
Lăsați placa să se usuce timp de 5 minute.
Se folosește un dispozitiv de distribuire a discurilor de antibiotice pentru a le fixa pe
placă în funcție de etiologia bacteriei. Cu un tampon steril se apasă ușor fiecare disc pentru a
ne asigura ca sunt atașate de agar (Fig.2.7.).

Fig.2.7. Dispencer pentru discurile de antibiotice (original)

30
 Plăcile se lasă la incubat peste noapte la 37 ºC.
Dupa 24 de h se citesc plăcile. Cu o riglă se măsoară în mm zona de inhibiție a
creșterii speciei bacteriene din jurul discurilor de antibiotice. (Standard CLSI, 20016-2017)
Aspectul zonei de inhibiției trebuie sa fie clar și cu un contur neted (Fig.2.8.).
Scopul antibiogramei prin metoda difuzimetrică este de a ajuta clinicianul în luarea
unei decizii asupra tratamentului, prin compararea fenotipurilor de rezistență a tulpinilor ce au
dus la infecția nosocomială.

Fig.2.8. Tulpină de Ps. aeruginosa multisensibilă izolată pe placă Mueller Hinton (original)

Metoda automata Vitek 2 Compact

Fig.2.9.Sistemul automat Vitek 2 de identificare și realizare a antibiogramelor

Prepararea suspensiei
Un tampon steril este utilizat pentru a elibera un număr de colonii dintr-o cultură pură
și pentru a suspenda microorganismele în 3,0 ml de soluție salina sterilă ( soluție de NaCl
aprox. 0,45% - 0,50%, pH 4,5 – 7 ) într-un tub de 12x75 mm.

31
 Fig.2.10. Rack cu tuburi ce contin suspensie bacteriană
Inoculare
Cardurile de identificare sunt inoculate cu suspensii de microorganisme folosind un
aparat de vid integrat. Tubul ce conține inoculul este plasat într-un rack iar cardul de
identificare este așezat într-o fantă vecină în timp ce se introduce tubul de transfer în tubul de
suspensie corespunzător. Rackul de la Vitek 2 Compact prezintă locusuri pentru 10 carduri de
identificare. Racki (stativele) pline sunt introduse manual într-o camera de vid. Dupa ce vidul
a fost aplicat și aerul este reintrodus în compartiment, suspensia de cultură este impinsă prin
tubul de transfer în micro-canalele ce umplu toate sondele de testare. Cardurile sunt apoi
trecute printr-un mecanism, care taie tubul de transfer și sigilează cardul înainte de încarcarea
acestuia în etapa următoare. Toate cardurile sunt incubate la 35º C, iar odata la 15 min,
acestea sunt transportate către sistemul optic pentru reacțiile de citire. Pe toată perioada
incubării, datele sunt colectate odata la 15 minute.

Fig.2.11. Carduri de identificare și realizare a antibiogramelor pentru BGN (original)

Sistemul optic de transmisie permite interpretarea reacțiilor de testare utilizând lungi
de undă diferite în spectrul vizibil. În timpul incubării, fiecare test este citit la fiecare 15
minute pentru a măsura turbiditatea, gradul de colorație. În plus, cu ajutorul unui algoritm,
sunt eliminate toate rezultatele fals pozitive.

32
REZULTATE ȘI DISCUȚII
Obiectiv 1. Izolarea și identificarea tulpinilor microbiene din hemoculturi provenite din
două loturi de pacienți internati la sectiile ATI, Hematologie si Neurologie
2.2 Tabel Incidența pacienților pe secții
Total Probe
Secția Barbați Femei
Pozitive
ATI 19 15 34
NEUROLOGIE-
5 4 9
TERAPIE ACUTĂ
HEMATOLOGIE 4 3 7

Primul lot de pacienți internați la spitalul Colentina

Din primul lot de probe prelevate de la Spitalul Colentina, 50 de probe s-au dovedit a
fi hemoculturi pozitive, cea mai mare incidență s-a regăsit pe secțiile de ATI cu un procent
de 68%, urmată de secția de Neurologie – Terapie acută cu 18%. S-au izolat Staphylococcus
aureus, Klebsiella pneumoniae și Pseudomonas aeruginosa. Din cele 50 de probe pozitive, s-
au identificat 15 tulpini de Ps. aeruginosa multirezistente.

Probe pozitive

14%
ATI
NEUROLOGIE-TERAPIE
18% ACUTĂ
HEMATOLOGIE
68%

Fig.2.12. Incidența probelor pozitive în funcție de secție

33
 30

25
Numar de cazuri

20

15

10

0
15-25 25-45 45-65 > 65

Intervale de varsta

Fig.2.13. Incidența hemoculturilor pozitive în funcție de vârsta pacienților

Frecvența infecțiilor cu diverse specii bacteriene izolate în funcție de vârstă se poate

observa în tabelul 2.2. Cele mai frecvente culturi s-au izolat de la pacienții cu vârsta peste 65
de ani, urmați de cei între 45-65 de ani. Rata de prelevanță a infecțiilor a fost mai mare la
bărbați comparativ cu cea de la femei.

Incidenta infectiilor in functie de sex

20
16
12
8
Numar de cazuri

4
0
I Ă E
AT UT GI Barbați
O
AC OL Femei
IE AT
R AP M
- TE HE
IE
LOG
O
UR
NE

Secții

Fig.2.14. Incidența infecțiilor pe secțiile ATI, Neurologie-Terapie acută și Hematologie în funcție de sex

S-a observat ca cele mai frecvente hemoculturi pozitive s-au regăsit pe secția de ATI,
prelevate de la persoanele de sex masculin cu vârsta peste 65 de ani.

34
 Tabel 2.3. Testarea tulpinilor de Ps. aeruginosa multirezistente pe sistemul automat Vitek 2 compact (n=15)

Antibiotice R I S
Ampicilină 15 0 0
Ticarcillin/Acid Clavulanic 13 2 0
Piperacilină 13 1 1
Cefuroxime 15 0 0
Cefuroxime Axetil 15 0 0
Cefexim 13 1 1
Ceftriaxone 15 0 0
Aztreonam 15 0 0
Meropenem 14 0 1
Levofloxacin 14 0 1
Moxifloxacin 14 0 1
Minocyclin 13 2 0
Tetracyclin 15 0 0
Tigercyclin 15 0 0
Chloramphenicol 15 0 0
Colistin 1 0 14
Trimethoprim 15 0 0

16
14
12
10
8
Numar de tulpini

6
4
R
2
I
0 S
ă nic ă e l e n n n n n l n
in in m xeti exim xon nam nem aci aci ycli ycli ycli nico listi prim
ci il vula acil roxi A f o e x x c c c
p la er e e ri a
re p flo
ifl
o o a
in et r i g e
r he Co ho
Am d C Pip Cef xim
u C
eft Azt
o
er evo ox M T T m
p et
C M L M a i m
ci ur
o or Tr
n/A ef Chl
i C
ill
rc
ca
Ti

Antibiotice testate

Fig.2.15. Incidența spectrului de sensibilitate la antibiotice

S-au izolat 15 tulpini de Pseudomonas aeruginosa multirezistente la mai multe grupe

de antibiotice. 93,33% au fost susceptibile la Colistin. Putem observa valori procentuale de

35
100% ale rezistentei la: Ampicilină, Cefuroxime, Cefuroxime Axetil, Ceftriaxone,
Astreonam, Tetracyclin, Tigercyclin și Trimethoprim.
Rezistența la mai multe clase antimicrobiene limitează în continuare opțiunile de
tratament și scade probabilitatea unei terapii empirice adecvate. Nu s-a stabilit în mod clar
dacă terapia combinată pentru bacteriemie produsă de o tulpină de Ps. aeruginosa este
asociată cu rezultate mai favorabile decât monoterapia (Bassetti M și colab; 2008). Un
avantaj potențial al terapiei asociate este probabilitatea mai mare ca un izolat MDR sa fie
susceptibil la cel puțin un agent antimicrobian în regimul combinat. În plus, combinația
sinergică de substante antimicrobiene poate avea ca rezultat și o eficienta ridicata a sterilizarii
focarului infectios, astfel se limitează progresia bolii prin reducerea încărcăturii bacteriene la
debutul infecției.
Pe langă statutul imunocompromis al pacienților, alte cauze ale rezistenței la
antibioticele curente sunt: utilizarea antibioterapiei fară prescripție medicală, lipsa igienei
personale, utilizarea incorectă a antibioticelor.
Datorită strategiilor diferite de tratament din spitale, indicența rezistenței la Colistin
este diferită în funcție de regiunea geografică. Datele referitoare la rezistența la colistin sunt
necesare pentru realizarea unor linii directoare adecvate pentru utilizarea specifică a
antibioticului. Apariția tulpinilor de Ps. aeruginosa rezistente la Colistin reprezintă o
problema la nivel global, astfel protocolul de prevenție, cum ar fi terapia asociată a mai multe
grupe de antibiotice sau utilizarea testelor sinergice în vitro, ar trebui luate în considerare.

36
 Al doilea lot de pacienți spitalizați la spitalul Pantelimon (n=12)

3.5

Nr. de cazuri cu hemoculturi pozitive

3

2.5

1.5 Femei
Barbați
1

0.5

0
25-45 45-65 > 65
Intervale de vârstă

Fig.2.16 Reprezentarea grafica a incidentei infectiilor cu P. aeruginosa in functie de sex si varsta.

Pe parcursul celor 5 luni de studiu, s-au identificat 12 tulpini de Ps. aeruginosa

izolate din hemoculturi pozitive. Probele au fost prelevate în puseu febril, toți pacienții au
avut temperatura între 37,5 º C – 38,6 º C. Incidencența cea mai mare a probelor pozitive s-a
regăsit în special la persoanele de sex masculin, cuprinși în intervalul de vârstă 45-65 de ani
și a persoanele de sex feminin de peste 65 de ani.

Tabel 2.4. Spectru de sensibilitate la al doilea lot de pacienți (n=12)

Antibiotice R I S
CEFEPIM 12 0 0
CEFTAZIDIM 12 0 0
IMIPENEM 12 0 0
MEROPENEM 12 0 0
TICARCILIN+AC.CLAVULANIC 10 0 2
AZETRONAM 8 4 4
AMICACIN, 8 0 4
COLISTIN 2 0 10
GENTAMICIN 8 0 4
NETILMICIN 10 0 2
PIPERACILIN+TAZOBACTAM 8 0 4
POLIMIXIN B 0 0 12
TOBRAMICIN 8 0 4
LEVOFLOXACIN 11 0 1

37
 Levofloxacin
TOBRAMICIN
POLIMIXIN B
PIPERACILIN+TAZOBACTAM
Tipuri de antibiotice testate NETILMICIN
GENTAMICIN
COLISTIN
AMICACIN S
AZETRONAM I
R
TICARCILIN+AC.CLAVULANIC
MEROPENEM
IMIPENEM
CEFTAZIDIM
CEFEPIM

0 2 4 6 8 10 12 14

Nr de tulpini

Fig.2.17. Spectru de sensibilitate la antibiotice la al doilea lot de probe

Fata de primul lot de pacienți se observă ca tulpinile prezintă o sensibilitate mai mare
la o parte din grupele de antibiotice testate. Rata de susceptabilitate cea mai mare s-a observat,
la antibioticele de ultimă intenție, Colistin (83,33%) și Polimixin (100%). În schimb,
tulpinile de Ps. aeruginosa identificate au prezentat rezistență de 100% la carbapeneme
(Meropenem, Imipenem) și cefalosporine de generația IV( Cefepim), III (Ceftazidim) .
33,3% au prezentat rezistență la mai mult de 5 antibiotice, 2 dintre ele fiind sensibile doar la
Polimixin. Tulpinile de Ps. aeruginosa au reacționat la Tobramicin, Piperacilină +
Tazobactam, Gentamicin și Amicacin, în urma testării spectrului de sensibilitate după cum
urmează: rezistente 66,66% și sensibile 33,34%.

38
39
 Fig.2.18. Metoda difuzimetrică pentru tulpini de Ps. aeruginosa

Concluzii
Scopul lucrarii a fost studiul incidentei infectiilor cu tulpini Pseudomonas aeruginosa
izolate din hemoculturi provenite de la pacientii spitalizati. Pentru realizarea acestui studiu s-
au folosit ca metode de identificare și realizare a antibiogramelor Vitek Compact 2 și metoda
difuzimetrică Kirby-Bauer. Studiul, de 5 luni, s-a realizat pe 2 loturi de pacienți internați în
cadrul spitalului Colentina și Sf. Pantelimon.
Din primul lot de probe prelevate de la Spitalul Colentina, 50 de probe s-au dovedit a
fi hemoculturi pozitive, cea mai mare incidență s-a regăsit pe secțiile de ATI cu un procent
de 68%, urmată de secția de Neurologie – Terapie acută cu 18%. S-au izolat Staphylococcus
aureus, Klebsiella pneumoniae și Pseudomonas aeruginosa. Din cele 50 de probe pozitive, s-
au identificat 15 tulpini de Ps. aeruginosa multirezistente. 93,33% au fost susceptibile la
Colistin. Toate tulpinile identificate de Ps. aeruginosa au avut rezistență la carbepeneme.
La cel de-al doilea lot de pacienți incidencența cea mai mare a probelor pozitive s-a
regăsit în special la persoanele de sex masculin, cuprinși în intervalul de vârstă 45-65 de ani
și a persoanele de sex feminin de peste 65 de ani. Fata de primul lot de pacienți se observă ca
tulpinile prezintă o sensibilitate mai mare la o parte din grupele de antibiotice testate. Rata de
susceptabilitate cea mai mare s-a observat, la antibioticele de ultimă intenție, Colistin
(83,33%) și Polimixin (100%). În schimb, tulpinile de Ps. aeruginosa identificate au
prezentat rezistență de 100% la carbapeneme (Meropenem, Imipenem) și cefalosporine de
generația IV( Cefepim), III (Ceftazidim) . 33,3% au prezentat rezistență la mai mult de 5
antibiotice, 2 dintre ele fiind sensibile doar la Polimixin.

40
 Infecțiile nosocomiale sunt mai frecvente la pacienții imunocompromiși, de aceea
incidența cea mai mare de probe pozitive, s-a regăsit pe secțiile de ATI cu un procent de
68%, în special la pacienții care prezintă patologii multiple, ventilați mecanic și cateterizați.
Acest studiu vrea sa contureze ideea ca bacteriemia cauzata de tulpina de Ps.
aeruginosa este asociată cu statutul imunocompromis al pacientului ce are mai multe
patologii de bază. Tratamentul infecțiilor devine din ce în ce mai dificil în fiecare an, creșterea
continuă a numarului de pacienți imunocompromiși și capacitatea bacteriilor de a se apăra și
adapta rapid la amenințările antibioterapiei, fac din tratamentul infecțiilor o provocare
serioasă. În concluzie, prin acest studiu, se observă că administrarea unei terapii
antimicrobiene inadecvate inițiale, poate fi asociată cu un rezultat grav, la pacienții cu
bacteriemie produsă de specii Gram-negative multirezistente la antibiotice.

Bibliografie
1. Ball, G., Chapon-Hervé, V., Bleves, S., Michel, G., & Bally, M. (1999). Assembly of
XcpR in the cytoplasmic membrane is required for extracellular protein secretion in
Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology, 181(2), 382–388.
2. Baron, S. (1996). Medical Microbiology. 4th edition. University of Texas Medical
Branch at Galveston. https://doi.org/NBK8035 [bookaccession]
3. Bjorn, M. J., Pavlovskis, O. R., Thompson, M. R., & Iglewski, B. H. (1979).
Production of exoenzyme S during Pseudomonas aeruginosa infections of burned
mice. Infection and Immunity, 24(3), 837–842.
4. De Kievit, T. R., & Iglewski, B. H. (2000). Bacterial quorum sensing in pathogenic
relationships. Infection and Immunity. https://doi.org/10.1128/IAI.68.9.4839-
4849.2000
5. DiMango, E., Zar, H. J., Bryan, R., & Prince, A. (1995). Diverse Pseudomonas
aeruginosa gene products stimulate respiratory epithelial cells to produce interleukin-
8. Journal of Clinical Investigation, 96(5), 2204–2210.
https://doi.org/10.1172/JCI118275
6. Elkins, J. G., Hassett, D. J., Stewart, P. S., Schweizer, H. P., & McDermott, T. R.
(1999). Protective role of catalase in Pseudomonas aeruginosa biofilm resistance to
hydrogen peroxide. Applied and Environmental Microbiology, 65(10), 4594–4600.
Retrieved from
http://aem.asm.org/content/65/10/4594%5Cnhttp://aem.asm.org/content/65/10/4594.fu

41
 ll.pdf
7. European Centre for Disease Prevention and Control. (2012). Antimicrobial resistance
surveillance in Europe 2012. Annual Report of the European Antimicrobial
Resistance Surveillance Network (EARS-Net). ECDC. https://doi.org/1 ECDC.
Antimicrobial resistance surveillance in Europe: Annual report of the European
Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net). Stockholm, 2013 doi:1
ECDC. Antimicrobial resistance surveillance in Europe: Annual report of the
European Ant
8. Gilleland, L. B., Gilleland, H. E., Gibson, J. a, & Champlin, F. R. (1989). Adaptive
resistance to aminoglycoside antibiotics in Pseudomonas aeruginosa. Journal of
Medical Microbiology, 29(1), 41–50. https://doi.org/10.1099/00222615-29-1-41
9. Govan, J. R. W., & Deretic, V. (1996). Microbial pathogenesis in cystic fibrosis:
mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews,
60(3), 539–574. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03706.x
10. Hancock, R. E. W. (1998). Resistance Mechanisms in Pseudomonas aeruginosa and
Other Nonfermentative Gram-Negative Bacteria. Clin Infect Dis, 27, S93–S99.
https://doi.org/10.1086/514909
11. Kahlon, R. S. (2016). Pseudomonas: Molecular and applied biology. Pseudomonas:
Molecular and Applied Biology. https://doi.org/10.1007/978-3-319-31198-2
12. Lotti, M., Monticelli, S., Montesinos, J. L., Brocca, S., Valero, F., & Lafuente, J.
(1998). Physiological control on the expression and secretion of Candida rugosa
lipase. Chemistry and Physics of Lipids, 93(1–2), 143–8. Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9720256
13. Moore, N. M., & Flaws, M. L. (2011). Introduction: Pseudomonas aeruginosa.
Clinical Laboratory Science Journal of the American Society for Medical Technology,
24(1), 41–42. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21407804
14. Nikaido, H. (2003). Molecular Basis of Bacterial Outer Membrane Permeability
Revisited. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(4), 593–656.
https://doi.org/10.1128/MMBR.67.4.593-656.2003
15. Paterson, D. L., & Bonomo, R. A. (2005). Extended-Spectrum beta-Lactamases : a
Clinical Update. Clinical Microbiology Reviews, 18(4), 657–686.
https://doi.org/10.1128/CMR.18.4.657
16. Poole, K. (2007). Efflux pumps as antimicrobial resistance mechanisms. Ann Med,
39(3), 162–176. https://doi.org/777631811 [pii]\r10.1080/07853890701195262 [doi]

42
17. Rocchetta, H. L., Burrows, L. L., & Lam, J. S. (1999). Genetics of O-antigen
biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology and Molecular Biology
Reviews, 63(3), 523–553. Retrieved from
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?
artid=103745&tool=pmcentrez&rendertype=abstract
18. Rumbaugh, K. P., Griswold, J. A., & Hamood, A. N. (1999). Contribution of the
regulatory gene lasR to the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa infection of
burned mice. The Journal of Burn Care & Rehabilitation, 20(1 Pt 1), 42–49. Retrieved
from
http://journals.lww.com/burncareresearch/Abstract/1999/01001/Contribution_of_the_
Regulatory_Gene_lasR_to_the.8.aspx%5Cnpapers2://publication/uuid/AAC8F799-
7D40-4EAB-A3BA-DC9E8D336329
19. Walsh, A. G., Matewish, M. J., Burrows, L. L., Monteiro, M. A., Perry, M. B., &
Lam, J. S. (2000). Lipopolysaccharide core phosphates are required for viability and
intrinsic drug resistance in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology, 35(4),
718–727. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01741.x
20. Wang, X., & Quinn, P. J. (2010). Endotoxins: structure, funciton and recognition.
Subcell Biochem. (Vol. 53). https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004
21. Winstanley, C., Coulson, M. a, Wepner, B., Morgan, J. a, & Hart, C. a. (1996).
Flagellin gene and protein variation amongst clinical isolates of Pseudomonas
aeruginosa. Microbiology (Reading, England), 142 ( Pt 8(1 996), 2145–51. Retrieved
from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8760928

43