Lucrare de laborator nr.

Tema: Morfologia microorganismelor

Scopul lucrării:
Însușirea tehnicii de pregătire a frotiului și colorației simple pentru studierea
morfologiei microorganismelor.

Materiale și ustensile:
Culturi de microorganisme (culturi bacteriene) lame, lamele, hârtie de filtru, ansă
microbiologică, pipete Pasteur, spirtieră sau bec Bunsen, stativ, apă distilată, alcool
etilic (C2H5OH), soluție NaCl 0,85%, colorant (albastru de metilen, gentian violet,
fuxină acidă).

Etapele lucrării:
1. Pregătirea frotiului
Frotiu – strat subțire și omogen de elemente celulare răspândite uniform pe suprafața
lamei.
Se ia o lamă, se degresează, se înlătură impuritățile cu ajutorul hârtiei de filtru, se
sterilizează la flacără.
1) Dacă se folosește cultură de microorganisme crescute pe mediu solid, pe
suprafața lamei se picură o picătură de soluție NaCl 0,85% sau apă. Cutia Petri
sau eprubeta ce conține cultură de m/o se deschide deasupra flăcării, cu ansa
microbiologică preventiv sterilizată prin ardere și răcită, se recoltează o cantitate
mică de cultură și se dispersează uniform prin mișcări rotative (procedeu numit
etalare) în picătura de soluție NaCl/apă de pe suprafața lamei. Ansa se
sterilizează prin ardere.
2) Dacă se folosește cultură de microorganisme crescute în mediu lichid, cu ajutorul
pipetei Pasteur pe mijlocul lamei se depune o picătură de mediu. Cu ajutorul
ansei preventiv sterilizate picătura se dispersează uniform pe suprafața lamei.
Ansa se sterilizează.
Pe partea stângă a lamei de înscrie data efectuării preparatului, nr. probei și alte
informații după necesitate.
2. Uscarea frotiului
Uscarea frotiului se realizează la temperatura camerei, în termostat la 37°C, sau
foarte atent la flacăra spirtierei/ becului Bunsen până la evaporarea completă a apei.
Se verifică gradul de încălzire a lamei pentru a evita supraîncălzirea acesteia,
coagularea proteinelor și în consecință degradarea integrității celulei microbiene.
 3. Fixarea frotiului
Fixarea frotiului are mai multe scopuri: 1) asigură aderența celulelor la suprafața
lamei, 2) asigură o mai bună colorare a celulelor microbiene deoarece celulele moarte
se colorează mai bine ca cele vii, 3) asigură securitatea manipulărilor, 4) omoară
microorganismele incidente.
Metoda de fixare:
a) fixarea prin flambare - pentru aceasta lama cu frotiul în sus se trece de 3 ori prin
cea mai fierbinte parte a flăcării becului Bunsen/spirtierei, descriind un cerc cu
diametrul de aproximativ 15 cm, timp de 5-6 secunde, acțiunea flăcării durează timp
de 2 secunde. În caz de necesitate procedura se repetă;
b) fixarea cu alcool etilic– pe frotiul uscat depunem 4-5 picături de alcool etilic
(96%), timp de 10-15 min;
c) fixare cu amestec alcool etilic:eter (1:1) – fixarea durează 5 min;
d) fixare cu acetonă - fixarea durează 5 min;

4. Colorația simplă a microorganismelor

Pentru această metodă se folosește un singur colorant. În rezultat se colorează toată
celula microbiană. Frotiul fixat se plasează pe suport. Se adaugă o picătură de
colorant astfel încât să acopere frotiul în întregime. La utilizarea unui colorant bazic
(albastru de metilen – soluție apă alcool sau col. Loeffler) frotiul este acoperit cu
colorant timp de 3-5 min. La utilizarea unui colorant acid (fuxină Pfeiffer) frotiul este
colorat timp de 1-2 min. După expirarea timpului colorantul se înlătură, frotiul se
spală cu apă, se usucă cu hârtie de filtru și se lasă la t° camerei pentru uscare
completă. Pe frotiul colorat uscat se picură ulei de imersie și preparatul se
examinează la microscopul optic, utilizând obiectivul 90X.

Fig. 1 Frotiul examinat la obiectivul cu imersie.

1-
2-
3-
...-

Concluzii:

Informație suplimentară:
Morfologia microorganismelor. Morfologia bacteriilor.
(rezumat, 1-3 pagini de text tehnoredactat conform normelor gramaticale și ortografice în vigoare în
aplicația MS Word, fonta Times New Roman 14, Normal, aliniere stânga-dreapta, alineat din 5 semne,
sau text coerent scris de mână.)
 Morfologia Bacteriană
Un criteriu important pentru identificarea bacteriilor îl constituie morfologia celulei
bacteriene. Această morfologie poate varia în limitele permise de mecanismele genetice
sub influența a numeroși factori de mediu fizici si chimici (temperatura, pH, etc.).

Morfologia propriu-zisa a bacteriilor se refera la urmatoarele elemente:

Dimensiunile bacteriilor. Dimensiunile bacteriilor pot varia in funcție de specie, de

condițiile de mediu și de stadiul de dezvoltare al culturii. In general, aceste dimensiuni
sunt de ordinul micronilor, foarte puține specii avînd dimensiuni sub un micron.
Bacteriile cele mai mici fac parte din genurile Brucella, Bordetella si Haemophilus (0,1
– 0,5 microni), iar cele mai mari sunt: Bacillus anthracis (3 – 8 microni ) si Treponema
pallidum (5 – 20 microni ).Cele mai frecvente forme bacteriene intalnite in cavitatea
orala au dimensiuni cuprinse intre 0,5 – 2 microni (coci), 0,5 – 10 microni (bacili) si 10
– 15 microni (spirili).

Forma si asezarea bacteriilor. Dupa formă, bacteriile se pot grupa în mai multe
categorii:
 Forma sferică, cocoidală cu diametrele egale “izodiametric” sau inegale: ovalară,
lanceolată sau de forma “triunghiurilor de brînză topită” (Diplococcus
pneumoniae), reniformă (Neisseria gonorrhoeae si meningitidis). Cocii pot fi
dispuși izolat sau se pot grupa in mod caracteristic.
 Diplo (dispunere în perechi). Celulele rezultate rămîn grupate două cîte două
(Diplococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis);
 Strepto (coci dispuși in lanțuri). Celulele rezultate după diviziune ramîn alături și
alcătuiesc lanțuri (ex. Streptococcus pyogenes);
 Stafilo (coci dispuși în ciorchine) (ex. Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis).
 Forma cilindrica – bacilii se prezintă sub forma de bastonașe mai mult sau mai
puțin drepte, cu diferențe evidente intre lungime si latime. Germenii cu forme
alungite, numiti si bacili, pot fi: cilindrici, fuziformi, sau cu extremitatile usor
deformate.
 Forma spiralata cuprinde 3 subtipuri morfologice: vibrionul, in forma de virgula
(gen Vibrio: Vibrio cholerae); spirilul cu mai multe tururi de spira rigide
(Spirillum volutans); spirocheta in forma de spirala cu mai multe ture de spira,
flexibile, mai mult sau mai putin regulate (gen Borrelia) si nedeformabile in cazul
genului Treponema si Leptospira.
Structura celulei bacteriene.

Celula bacteriana are o structura complexa, fiind formata din urmatoarele elemente:

- obligatorii: peretele celular, membrana citoplasmatica, citoplasma, nucleul;

- facultative: capsula, cilii sau flagelii, pilii si sporul.

1. Peretele celular este situat la exteriorul corpului bacteriei, este foarte rigid

determinand si mentinand forma ei caracteristica. Peretele celular are o grosime
medie de 150Å. Functiile peretelui celular sunt multiple: Asigura forma
bacteriilor; Este sediul antigenelor implicate in raspunsul imun; Este sediul unor
receptori celulari, proteine, virusuri; Sustinerea mecanica si protectia celulei; Rol
in fenomenul de osmoza, fiind permeabil selectiv pentru substantele nutritive din
mediu si pentru produsele de excretie celulara (produse de catabolism, toxine,
enzime, etc); Este raspunzator de afinitatea tinctoriala a germenilor fata de
colorantii bazici (coloratia Gram); În cadrul procesului de diviziune celulara,
peretele celular impreuna cu membrana citoplasmatica participa la formarea
septurilor transversale.
2. Membrana externa – contine lipopolizaharidul (LPS) a carui structura este
constituita din trei parti: • lipidul A (dotat cu activitate toxica) • polizaharide
(constituie antigenul R) • monozaharide caracteristice de specie sau de tip
(alcatuiesc antigenul “0” somatic)
3. Membrana interna – alcatuita din fosfolipide si proteine.
4. Citoplasma. Citoplasma bacteriilor reprezinta un sistem coloidal format din
proteine, enzime, lipide, pigmenti, hidrati de carbon, saruri minerale si apa.
Caracteristic citoplasmei tuturor fiintelor vii este prezenta unei mari cantitati de
acid ribonucleic (ARN) care, in mod special la bacterii, este in cantitate mare.
Aspectul structural al citoplasmei este variabil in functie de specie, varsta culturii
si de conditiile de mediu.
5. Ribozomii din citoplasma sunt in forma aproape sferica. Marimea si stabilitatea
ribozomilor s-au dovedit a fi in functie de concentratia ionilor de Mg si K (80-
150Å). Din punct de vedere chimic, ribozomii contin un tip special de ARN si
proteine cu greutate moleculara 30.000 D. Ribozomii au un rol esential: în
procesul de biosinteza al proteinelor celulare; Sunt sediul unui numar mare de
enzime (oxidative, ribonucleaza). Ei au tendinta de a se grupa in gramezi
alcatuind ceea ce se numesc polizomi (poliribozomi), ce au o actiune mult mai
eficienta in procesul de biosinteza proteica decat ribozomii individuali.
6. Incluziile – sunt formatiuni structurale inerte care apar in citoplasma bacteriilor la
sfarsitul perioadei lor de crestere activa. Mediul in care se dezvolta, tipul si varsta
bacteriilor influenteaza prezenta si abundenta incluziilor.
7. Vacuolele – sunt formatii sferice care contin diferite substante in solutii apoase,
 avand o membrana lipoproteica denumita tonoplast. Vacuolele apar ca rezultat al
activitatii metabolice sau ar fi un loc de acumulare al produsilor toxici pentru
celula, fapte ce ar explica numarul mare al acestora in citoplasma celulelor
batrane.
8. Plasmidele – reprezinta unitati genetice extracromozomiale (ADN
extracromozomial cu o molecula mai scurta decat ADN-ul celular). Acestea
imprima anumite caractere bacteriei purtatoare (plasmida “R” este legata de
aparitia rezistentei la unele chimioterapice).
9. Nucleul - este una din componentele importante ale celulei bacteriene. Spre
deosebire de nucleul celulelor eucariote (celulele apartinand fiintelor superioare)
nucleul bacterian nu este delimitat de o membrana diferentiata, masa nucleara
vine in contact direct cu citoplasma (caracter de celula procariota). Cercetarile
asupra compozitiei chimice au aratat ca nucleul celulei bacteriene contine acid
dezoxiribonucleic (ADN). Este localizat, de obicei, in partea centrala a celulei,
reprezentand 5-16% din volumul ei. Pe sectiuni ultrafine s-a observat existenta
cromozomului bacterian, alcatuit dintr-o singura molecula de ADN. La nivelul
nucleului este inscrisa zestrea genetica, acesta dirijand si procesul de diviziune
celulara.
10.Membrana citoplasmatica (membrana celulara) - este situata imediat sub peretele
celular, inconjoara citoplasma separand-o de exteriorul celulei. Are o grosime de
50-100Å si o structura triplustratificata. Din punct de vedere a compozitiei
chimice contine: lipide, proteine, ARN, enzime si carbohidrati. Membrana
citoplasmatica are un rol functional – participa la: formarea septului transversal in
timpul diviziunii; rol in permeabilitatea celulara; au loc transporturi de electroni si
procese de fosforilare oxidativa; este sediul enzimelor citocrom oxidaze ce
participa in metabolismul energetic (respiratie bacteriana). Din membrana
citoplasmatica patrund spre citoplasma invaginari de forma lamelara sau ca niste
saculeti numiti mezozomi.
11.Mezozomii – fac legatura intre membrana citoplasmatica si materialul nuclear,
participa in procesul de replicare a cromozomilor si sinteza componentelor
peretelui celular. La acest nivel se gaseste sediul enzimelor ce intervin in reactiile
de oxidoreducere.
12.Elemente anexe.

Exista si o serie de elemente care se intalnesc numai la unele specii bacteriene

 Capsula. Dupa unii autori, toate bacteriile prezinta la periferie un strat mucos
foarte subtire, invizibil cu mijloacele uzuale de cercetare (el ar constitui
antigenele de invelis care confera virulenta germenilor), care constituie
microcapsule (Wilkinson), (stafilococi, streptococi).
 Fimbriile (fimbria = franjuri) sau pilii comuni (pilu = par) sunt niste formatiuni
filamentoase rigide asezate pericelular la anumite bacterii (Gram negative). Ele se
 pot intalni atat la bacteriile ciliate, cat si la cele neciliate. Sunt formatiuni tubulare
cu diametru exterior de 70Å care nu au rol in mobilitatea bacteriei, ci in fixarea
acesteia pe substraturile solide. In afara pililor de tip obisnuit (asa numiti “pili
comuni”) exista la unele bacterii (cu anumite particularitati genetice) o categorie
aparte de pili denumiti “pili F”, (asupra carora se va reveni in capitolul de
genetica bacteriana – variabilitatea genetica (“pili sexuali”).

13.Organele locomotorii sunt reprezentate de cili si flageli.

Cilii si flagelii sunt formatiuni anexe care se intalnesc numai la numite specii bacteriene

si care confera o mobilitate deosebita bacteriilor care le au. Cilii se intalnesc numai la
numite specii, fiind prezenti la bacili, vibrioni, spirili si, numai exceptional, la coci. Din
punct de vedere chimic, flagelii sunt formati din proteine complexe, denumite flageline,
constituite din 14 acizi aminati (antigeni specifici).Dupa localizarea si numarul
flagelilor, s-au descris urmatoarele tipuri: bacterie monotricha, cu un singur cil lung la
un capat (ex. Vibrion holeric); bacterie amfitricha, cu cate un cil la cele 2 capete ale
corpului (ex. Treponema pallidum); bacterie lofotricha, cu un manunchi de cili la unul
sau ambele capete (gen Pseudomonas); bacterie peritriche, cu cili dispusi de jur
imprejurul celulei (ex. gen Proteus, gen Salmonella). Bacteriile lipsite de cili se numesc
atriche.

14.Cromatoforii  Sunt formatiuni citoplasmatice specializate ca centre fotochimice.

Ele sunt prezente la bacteriile fotosintetizate purpurii, constituind pana la 40 –
50% din greutatea uscata a celulei (ex. Rhodospirillum rubrum).
15.Sporul Anumite bacterii pot da nastere unor formatiuni numite endospori. Acest
fenomen de sporogeneza este des intalnit la familia Bacillaceae, fiind constant
aproape la genul Clostridium si facultativ la genul Bacillus. Din punct de vedere
morfologic, sporul are forma ovalara sau sferica, are dimensiuni variabile,
curpinse intre 0,5 – 0,9 microni sau 1 – 1,5 microni. Asezarea lui in celula variaza
la diferitele specii si observam: bacili avand sporul asezat central sau subterminal,
mai mic decat celula (deci nu-i modifica forma). Acestia sunt caracteristici
bacteriilor ( B. antrax); bacili cu spori asezati central sau subterminal mai mari
decat celula bacteriana (deci ii modifica forma). Acestia sunt caracteristici
clostridiilor           (Cl. oedematiens, Cl. histolyticum); bacili cu spori terminali
avand dimensiuni mai mari decat celula (B. tetanic). Sporii se pun, in general, in
evidenta prin coloratii speciale. Cu ajutorul microscopului electronic si a
sectiunilor ultrafine s-a putut pune in evidenta structura interna a sporilor.
Sporoplasma – masa densa si opaca, in care aparatul nuclear se distinge la
periferie si ADN-ul cromozomial, sporal.