Lucrare de laborator nr.

8
6

Tema: Studierea caracterelor culturii de microorganisme.

Scopul lucrării:
Însușirea metodelor de studiere a caracterelor macroscopice și microscopice a
culturilor de microorganisme.
Materiale și ustensile:
Culturi de microorganisme crescute pe medii solide, spirtieră sau bec Bunsen,
stativ, alcool etilic (C2H5OH), lupă, microscop.
Etapele lucrării:
I. Studierea macroscopică a coloniilor de microorganisme în lumina
trecătoare și reflectată.
Notă: Pentru studierea macroscopică a coloniilor în lumina trecătoare, cutia se
plasează perpendicular luminii. Se indică următoarele:
1. Dimensiunile coloniilor (mari 4-5 și mai mult mm, medii 2-4 mm și punctiforme
mai puțin de 2 mm).
2. Forma coloniilor (circulară regulată, neregulată, ameboidală, rizoidală,
filamentoasă).
3. Însușirile optice (transparentă, semitransparentă, netransparentă)
Notă: pentru studierea macroscopică a coloniilor în lumina reflectată, cutia Petri se
plasează pe masă, cu capacul în sus. Se indică următoarele:
4. Culoarea coloniei (incolor, pigmentată – culoarea pigmentului).
5. Caracterul suprafeței (netedă/ rugoasă, lucidă/opacă, umedă/uscată).
6. Situarea coloniilor pe mediu (la suprafață, în profunzime, bentonic).
7. Profilul coloniei (plat, bombat, convex, sub formă de crater sau de con).

II. Studierea microscopică a coloniilor de microorganisme.

Notă: Cutia Petri se instalează pe măsuța microscopului. Folosind obiectivul 8X sau
10X se studiază cultura indicând următoarele:
1. Marginea coloniei (regulată, ondulată, lobată, filiformă)
2. Structura coloniei (omogenă, amorfă, granulară, fibrilară)

Concluzii:

Informație suplimentară: Caracterele de cultură a diferitor specii de

microorganisme.
 Identificarea bacteriilor pe baza caracterelor de cultură, biochimice şi de
metabolism

Pe baza caracterelor de cultură

În acest caz se studiază aspectul macroscopic al coloniilor bacteriene izolate:
a. colonii de tip S (smooth - netede):
- rotunde;
- bombate cu margini circulare, regulate;
- translucide cu suprafaţa netedă;
- uşor detaşabile de pe mediu;
- suspensionate în ser fiziologic produc suspensii omogene;
- produc tulburare în mediu lichid;
- germenii capsulaţi păstrează capsula;
- virulenţa este conservată.
Tipul de colonie S reprezintă forma normală pentru majoritatea bacteriilor patogene (S.
aureus, S. pyogenes, E. coli), fiind dotată cu calităţi optime de structură antigenică şi de
patogenitate;
b. colonii de tip R (rough - rugos, aspru, grunjos):
- colonii cu margini neregulate;
- plate, uscate;
- cu suprafaţa zbârcită;
- aderente la mediu;
- aglutinează spontan în ser fiziologic;
- structura antigenică nu este caracteristică;
- nu păstrează capsula;
- în mediu lichid produce depozit cu supernatant clar. Tipul R de colonie este
caracteristic, în general, bacteriilor nepatogene, cu 3 excepţii: Bacillus anthracis,
Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae;
c. forme intermediare: S-R, R-S;
d. colonii de tip M:
- cu aspect mucos;
- foarte mari;
- foarte bombate;
- foarte lucioase;
- cu tendinţă de curgere şi de confluare.
Tipul M de colonii este caracteristic bacteriilor care posedă capsulă (Klebsiella);
e. fenomen de căţărare (invazie, migrare, roire):
Pe medii simple, creşterea se exprimă într-un strat continuu, sub forma unor valuri
succesive, fenomen caracteristic pentru Proteus spp.
Bacillus anthracis produce colonii în "cap de meduză"/"coamă de leu" (mari, alb-
cenuşii, de tip "R", la periferia coloniei, se pot observa prelungiri ondulate).
Exemple de creştere pe medii de cultură lichide:
- mediul este tulburat omogen (Staphylococcus spp.)
- mediul este clar, cu depozit grunjos pe pereţi şi la baza tubului (S. pyogenes)
 - mediul este clar, cu văl la suprafaţă (V. cholerae în apă peptonată alcalină)
- dezvoltarea culturii se realizează ca un "inel" aderent de pereţii tubului, la suprafaţa
mediului (E. coli)
- mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la suprafaţă (Bacillus
subtilis)
- mediul este clar cu apariţia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B.
anthracis)
- mediul este clar, iar la suprafaţă se dezvoltă o membrană groasă, plisată (M.
tuberculosis).

Pe baza caracterelor biochimice şi de metabolism

În acest caz se studiază metabolismul bacterian şi prezenţa diferitelor enzime specifice.
Studierea caracterelor biochimice şi de metabolism permit încadrarea bacteriilor în
specie.

a. Metabolismul glucidic
- se studiază pe medii de cultură diferenţiale sau selectiv-diferenţiale;
- urmăreşte descompunerea diferitelor zaharuri de către bacterii (glucoză, lactoză,
zaharoză, manitol);
- prin descompunerea zahărului de către bacterii mediul se acidifică, iar indicatorul
schimbă culoarea mediului de cultură.

b. Metabolismul proteic:
- se studiază pe medii de cultură diferenţiale;
- prin descompunerea proteinelor de către bacterii se eliberează metaboliţi precum
indol, H2S sau amoniac;
- indolul şi H2S se evidenţiază cu ajutorul unor hârtii de filtru îmbibate în reactiv
specific (reactiv Kovacs pentru indol şi săruri de Pb pentru H2S);
- prezenţa amoniacului se evidenţiază cu ajutorul unui indicator de culoare.
c. Enzimele bacteriene
 hemolizinele:
- enzime care lizează hematiile (alterează hemoglobina);
- prezenţa acestei enzime se evidenţiază pe mediu geloză - sânge;
- principalele tipuri de hemoliză:
- alfa (α) - apare ca o zonă verzuie în jurul coloniei;
- beta (β) - sângele este descompus total, în jurul coloniei este o zonă clară,
transparentă. α-Hemolizina sintetizată de Streptococcus viridans, Streptococcus
pneumoniae) produce liza incompletă a hematiilor, culoare verzuie; ß-hemolizina
sintetizată de Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes produce
liza completă a hematiilor, zona de hemoliza este clară; y-hemolizina produsă de
Staphylococcus spp. lizează hematiile, dar nu produce zone de hemoliza pe agar-sânge
(la streptococi, "y-hemoliza" indică absenţa hemolizei).
 catalaza (Staphylococcus spp):
- descompune apa oxigenată în apă şi oxigen;
- oxigenul eliberat se evidenţiază prin formarea bulelor de gaz;
 coagulaza:
- determină coagularea plasmei recoltate pe anticoagulant;
 oxidaza (N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, V. cholerae):
- enzime oxidative;
- acţionează asupra unor substanţe producând compuşi coloraţi.
gelatinaza (Clostridium perfringens):
- lichefiază gelatina;
lecitinaza (Bacillus anthracis, Clostridium spp.);
nitrat-reductaza (Mycobacterium spp.);
Alte caractere metabolic:
- toleranţa la un anumit pH (V. cholerae se multiplică la pH alcalin);
- toleranţa la o anumită concentraţie de NaCl (Staphylococcus aureus);
sensibilitatea la optochin (S. pneumoniae) sau la bacitracină (S. Pyogenes).
d. Alte teste
Mobilitatea:
- bacteriile flagelate sunt mobile şi migrează într-un mediu de cultură semisolid,
deviază de la locul de inoculare (traiectul de înţepătură).
Mirosul:
- la multe specii, coloniile au miros caracteristic:
Producerea de pigment:
- pigmenţi nedifuzibili - nu difuzează în mediu, vor colora doar colonia
(Staphylococcus aureus - pigment auriu);
- pigmenţi difuzibili - difuzează în mediu, colorează şi mediul (Pseudomonas -
pigment verde).