Suport de curs la disciplina Analize Instrumentale Moderne

Tema: CROMATOGRAFIA DE AFINITATE

Principii generale:
• Este o tehnică de purificare, care oferă o separare de 95% într-un singur pas.
• Principiul cromatografiei de afinitate este bazat pe proprietatea proteinelor de a forma
legături specifice, necovalente cu alte molecule (cofactori, substraturi).

Specificitatea metodei este asigurată de:

1) Matriță- o structură poroasă care asigură o suprafață suficinetă legării proteinei de interes,
dar și de a forma legături covalente cu ligandul de afinitate. Grupele amino, hidroxil, carbonil
și tiolice de pe matriță sunt situsuri de legate a liganzilor de afinitate . Ex: agaroză și alte
polizaharide, poliacrilamide, polimetacrilat, polistiren, celuloză
2) Ligand de afinitate trebuie să formeze cu molecula de interes o legătură reversibilă (ex: la
schimbarea pH-ului)
3) Legătura dintre matriță și ligand este olegătură covalentă

Etapele cromatografiei de afinitate

1. Echilibrarea
2. Aplicarea probei
3. Eluția
4. Re-echilibrarea coloanei
 Echilibrarea: De faza staționară este fixat covalent un ligand (ligand de afinitate) care are
capacitatea de a lega numai o anumită moleculă.
 Aplicarea probei: Proba se aplică prin injectare, molecula țintă se fixează reversibil de
ligandul de afinitate, iar celelalte molecule sunt deplasate spre ieșirea din coloană.
 Eluția: Soluția de proteine competitive la ligandul de afinitate. Aici sunt schimbate condițiile
astfel încît molecula reținută de ligandul de afinitate să disocieze și să se deplaseze spre
ieșirea din coloană. La această etapă se poate utiliza:
 Re-echilibrarea coloanei: Se eliberează liganzii de afinitate, se stabilizează coloana
cromatografică.Coloana cromatografică poate fi în continuare utilizată pentru separarea
aceleeași molecule țintă.

Avantaje:
• Selectivitate înaltă
• O singură etapă
• Timp optim
• Obținerea moleculei de interes într-o concentrație mare
• Reproductibilitate înaltă
• Poate fi utilizat pentru purificarea amestecului

Dezavantaje:
• Sunt necesare diferite faze staționare pentru diferite separări
• Consumul liganzilor
• Metodă costisitoare
• Laborioasă

Aplicații în analiza farmaceutică:

 Purificarea enzimelor, vitaminelor, acizilor nucleici, medicamentelor, anticorpilor etc.
 Identificarea medicamentelor
 Dozarea medicamentelor