Metode cromatografice

Prezentare generală
 Analiza chimică cromatografică

• 1901, botanistul rus Tvet

– a separat pigmenti vegetali pe o coloana umpluta
cu carbonat de calciu, eluent eterul de petrol.

chromos = culoare, graphos = scriere

• 1941, A. Martin si R. Synge au initiat cromatografia lichida de
repartitie pe coloana - Premiul Nobel pentru chimie  în 1952
– au separat aminoacizi acilati pe o coloana ce continea silicagel saturat
cu apa, faza mobila n-butanol saturat cu apa

• 1944 → bazele cromatografiei pe hârtie, prima forma de

cromatografie planara

• 1947 → cromatografia de schimb ionic

• Anii 1950 cromatografia de gaze → Archer J.P. Martin, si A.T.

James
– au separat acizi organici volatili pe o coloana de sticla umpluta
cu Celite acoperita cu ulei siliconic, utilizând ca faza mobila
azotul.

• 1959 → Cromatografia pe coloane cu gel a fost initiata de Porath si

Flodin

• începutul anilor 1960 → Cromatografia de lichide moderna pe

coloana, numita de înalta performanta sau de înalta presiune
(HPLC) se bazeaza pe lucrarile lui Csaba Horváth, (Univesitatea
Yale).

• 1967 → cromatografia de bioafinitate

Principii fundamentale
• Cromatografia reprezintă un set de metode
analitice care s-au dezvoltat iniţial ca şi
tehnici de separare.

• În toate variantele, separarea precede

analiza (calitativă şi cantitativă a
compuşilor separaţi) şi se realizează prin
repetarea, de un număr mare de ori, a
echilibrului de distribuţie între două faze:
– fază staţionară (fixa) - într-un tub numit coloană
sau planara
– faza mobilă (eluent) - aflată în mişcare, se
deplasează prin golurile primei faze.
Distributia inegala intre faze este determinata :
• de afinitatea diferita a componentelor amestecului
fata de cele doua faze
• de capacitatea diferita de a difuza în aceste faze
Clasificarea metodelor cromatografice

A - Clasificarea în functie de mecanismul separarii

B - Clasificarea în functie de natura fazelor

cromatografice

C - Clasificarea în functie de configuratia sistemului

cromatografic
A- Clasificarea în functie de mecanismul separarii

• 1.   Cromatografie de adsorbtie

• 2.   Cromatografie de repartitie
• 3.   Cromatografie cu faze chimic legate
• 4.   Cromatografie de schimb ionic
• 5.   Cromatografie de excluziune
• 6.   Cromatografie de afinitate
1. Cromatografie de adsorbtie
– fenomenul principal care sta la baza separarii este
adsorbtia
– afinitatea componentelor pentru cele doua faze este
în functie de coeficientii lor de adsorbtie
– faza staţionară este solidă iar faza mobilă este
lichidă sau gazoasă

2. Cromatografie de repartitie
– fenomenul care determina separarea este extractia
– separarea componentelor se face în functie de
diferenta dintre coeficientii lor de repartitie între cele
doua faze.
- faza staţionară este lichidă şi cea mobilă este lichidă
sau gazoasă.
3. Cromatografie cu faze chimic legate
- este intermediara între cromatografia de adsorbtie si
cea de repartitie, fiind o combinare a acestora.

 
 Solut Solut
Directia Directia
trecerii Lichid trecerii Gaz

Solid Solid

Solut Solut
Directia Directia
trecerii Lichid trecerii Gaz

Lichid Lichid

Figura 11.1 Transferul reversibil al solutului intre fazele cromatografice

Cromatografia de excludere
- separaţia este bazată pe dimensiunile moleculare ale
substanţelor
Cromatografie pe gel
Gelurile sunt caracterizate prin diametrul particolei de gel

-  bulina albastră – particolele de gel

- bulina roşie – particolele mari nu pot să pătrundă în gel şi sunt excluse. Ele
parcurg un volum mai mic şi eluează mai repede
- bulina ciclemen – particolele mici pot pătrunde în gel şi au mai mult volum de
traversat. Ele vor elua mai târziu.
• . - flow – debit
• gelul trebuie să îndeplinească mai
multe condiţii:
– sa fie inert din punct de vedere chimic
– sa fie stabil în timp şi în domenii largi de pH şi
temperatură,
– să aibă un număr mic de grupări ionizate,
– mărimea particolelor şi distribuţia lor pe dimensiuni să
fie riguros controlată.

– Separatia depinde si de capacitatea gelului de a

reţine solvenţii
– Gelul este o substanţă macromoleculară
tridimensională insolubilă cu lanţuri polimerice
legate în cruce care se îmbibă cu lichidul de
eluţie.

– Biologii şi biochimiştii utilizează de obicei

poliacrilamida, dextran sau agaroza şi practică
filtrarea la presiune mică
– Chimiştii utilizează de obicei gel de silice sau
polistiren cu structură în cruce şi filtrare la
presiune medie sau mare.

– Metoda a fost utilizată cu succes pentru separarea

zaharurilor, polipeptidelor, proteinelor, lipidelor, acizilor
nucleici, asfalturilor şi a unor polimeri: cauciucuri butilice,
polietene, polistiren, polimeri siliconici
 Separarea pe site.
• se utilizează zeoliţii care sunt aluminosilicaţi naturali
sau
• formulă de tipul :M2/nO•Al2O3•xSiO2•yH2O,
– unde Mn+ conţine cavităţi şi canale permenente în structură,
→ caracteristicile de sită ale zeolitului.
– Proprietăţile de adsorbţie sunt date de aria suprafeţei şi
disponibilitatea de M, Al, Si şi O din structură.
Cromatografia prin schimb ionic

• are la baza interactiunile electrostatice si difuzia

• separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor

electrice, constantele de disociere si diametrul efectiv al
ionilor

• Zeoliţii → tratamentele de dedurizare a

apei când ionii de Ca2+ sau Mg2+ sunt
schimbaţi cu ioni de Na care formează
componenta M a zeolitului
Schimbătorii cationici schimbă cationi iar cei anioni
schimbă anioni conform schemei

RC-H+ + M+ ↔ RC- M+ + H+

RA-OH- + Cl- ↔ RA-Cl + OH-

• RC-H+ → SO3-H+ → polimerul sulfonat este un schimbător

cationic puternic acid

• Exemple de grupări cationice : COO-; OH-; SH-; [PO3H2]-

• RA-OH → -CH2N(CH3)3 → răşina aminică cuaternară este

un schimbător puternic bazic

• Exemple de grupări anionice sunt: [NH2]+; [NHR]+; [NR2]+; NR3+

 Faza solidă

• matrice polimerică anorganică sau organică, naturală, modificată

sau artificială, conţinând ioni ce se pot schimba în mod
stoechiometric
      Cromatografia de bioafinitate,
• în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice
specifice cu asa-numitele grupari de afinitate.

The determination of fibrinogen in

human plasma, using an anti-
fibrinogen immobilized antibody
column and HPIAC.

Determination of
glycohemoglobin (Glc-
Hb) by HPAC for 10-µL
samples of diluted whole
blood.
B - Clasificarea în functie de natura fazelor
cromatografice
• Faza mobila: gazoasa, lichida si cu fluide supercritice.
• Faza stationara: solida sau lichida (trebuie fixata pe un
suport solid corespunzator, în general un material poros)

1.   Cromatografie de gaze

– 1.1.     Gaz-lichid (GLC)
– 1.2.     Gaz-solid (GSC)

2.   Cromatografie de lichide

– 2.1.     Lichid-lichid (LLC)
– 2.2.     Lichid-solid (LSC)

3.   Cromatografie cu fluide supercritice (SFC)

 C - Clasificarea în functie de configuratia
sistemului cromatografic

• 1.   Cromatografie pe coloana

– 1.1.     Cromatografie pe coloane clasice (cu
umplutura)
– 1.2.     Cromatografie pe coloane capilare

• 2.   Cromatografie planara

– 2.1.     Cromatografie în strat subtire
– 2.2.     Cromatografie pe hîrtie
 Alegerea tipului de cromatografie de lichide
pentru o anumita separare
• este necesara cunoasterea caracteristicilor fizice
ale amestecului respectiv.

• Compusi cu mase moleculare mai mari de 2000,

metoda de separare este cromatografia prin gel-
filtrare sau permeatia prin gel.

• Compusi cu mase moleculare mai mici de 2000,

alegerea metodei celei mai potrivite se poate face
conform schemei prezentate
IC = cromatografie ionica; LSC = cromatografie lichid-solid;
BPC = cromatografie cu faze chimic legate; RPC = cromatografie cu faze inverse.
Cromatografia serveşte pentru separarea amestecurilor de
substanţe cunoscute sau necunoscute

• se realizează prin percolarea fazei mobile care conţine

amestecul peste o fază staţionară întinsă şi voluminoasă şi
care prezintă de obicei o suprafaţă considerabilă.

• alegerea corectă a condiţiilor de lucru conduce la separarea

la interfaţă datorită retenţiei diferite a diferitelor tipuri de
substanţe (molecule) din amestec faţă de una din faze.

• urmează etapele determinărilor calitative şi cantitative,

realizate specific, în funcţie de tehnica utilizată.

• Procedeele exerimentale includ următoarele faze:

– prepararea fazei staţionare
– introducerea probei
– trecerea probei peste faza staţionară
– colectarea componenţilor amestecului prin eluare
– analiza calitativă
– analiza cantitativă
Schema de principiu a cromatografului
Dinamica procesului cromatografic

Eluarea → etapă de developare.

- developarea se mai poate realiza prin eluţie variabilă,
analiză frontală sau dezlocuire
Diagrama care reprezinta rezultatul analizei cromatografice
se numeste cromatograma
•semnal, funcţie de timp sau de volumul de eluent
Elemente de bază

– Picurile cromatografice

– Timpul mort, tM

– Timpul de retenţie, tR - mărime caracteristică pentru fiecare component al

amestecului separat de coloană

– Volumul de retenţie, VR VR = tR·Fe

– Timpul de retenţie ajustat, t R‘ t R' = tR – tM

– volum de retenţie ajustat, V R‘ V R' = VR – VM

VM = tM ·Fe
Concepte fundamentale în cromatografie

• Valoarea distribuţiei - descrie

cantitatea de solut reţinută de o fază
în relaţie cu cealaltă fază.
K = C1/ C2

• Rezoluţia - eficacitatea separării

care se măsoară prin distanţa între
picuri şi compactitatea lor
• Forma picului - Grafic, picurile cromatografice sunt nişte izoterme

. Selectivitatea - măsură a preferinţei pe care o fază staţionară o arată

pentru un anumit solut, în comparaţie cu altul :

α = K1/K2

• Eficienţa - numărul de talere

teoretice N sau prin înălţimea
unui taler teoretic, H,

H = L/N
• Talerul teoretic înseamnă
lungimea coloanei în care
solutul suferă o echilibrare
completă între cele două faze.

N = 16 • (VR / B)2
• VR este volumul de retenţie
• B este lăţimea picului de retenţie
 Analiza cromatografica
• Analiza calitativa – pe baza compararii timpilor de
retentie
Analiza cantitativă
• două tipuri de metode:

• Se colectează fiecare component în vase

separate, după care fiecare fracţiune se
analizează prin procedee chimice sau
instrumentale adecvate;
Aria cuprinsă sub fiecare pic cromatografic (sau inaltimea
picului) este proporţională cu concentraţia compusului
respectiv.
Formula generală de calcul pentru determinarea reziduurilor de POC este
(HURA, 1998)
• Prin comparatie cu un etalon de concentratie cunoscuta

• Vet • cet • Apr • Vf 100

• Conţinut POC = -------------------------- • -----, ppm
• Vpr • Aet • m R

• Unde :
• - Vet : volumul soluţiei etalon injectate , μl
• - Vf : volumul final al extractului probei, ml
• - Vpr : volumul probei injectate, μl
• - Aet : aria picului pentru componentul cercetat, în etalon, mm2
• - Apr: aria picului pentru componentul cercetat, în probă, mm2
• - c : concentraţia componentului în etalon, ppm
• - m : masa probei luată în lucru, g
• - R : procentul de recuperare a reziduurilor, %

• Deoarece se injecteaza volume egale de probă şi de etalon, iar volumul final de

reluare este 2 ml, formula devine :

• c • Apr • 2 100
• Conţinut POC = ------------- • -----, ppm,
• Aet • m R
• In calcul se tine seama de:
– Martorul reactivilor
– Factorul de recuperare, R

x pr+et - xpr
R = ------------------- • 100, %
xet

• Valoarea lui x se referă la înălţimea sau aria picului de interes în

probă (xpr), etalon (xet) şi probă impurificată controlat (x pr+et).
•
• Procentul de recuperare al reziduurilor se determină lucrând în
aceleaşi condiţii ca şi la cromatografierea probelor cercetate
asupra unor probe de grăsime separată la care se adaugă o
cantitate cunoscută de etalon de conc cunoscuta, de ex1 μl.
Calcul utilizand curba de etalonare
Determinarea glucidelor prin LC-RI
Curba etalonare Glucoza y = 347209x - 158893
conc mg/ml G R2 = 0.9992
2500000
1 7.25 2367796 2000000

1500000
2 5.8 1857358

Arie
1000000

3 3.625 1066094 500000

0
4 1.8125 492202 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000
Conc, mg/ml

Curba etalonare Fructoza

y = 330753x - 32909
R2 = 0.9974
3500000
conc mg/ml F 3000000
2500000
1 9.51 3161156 2000000
Arie

1500000
2 7.608 2408865
1000000

3 4.755 1558141 500000

0
4 2.3775 761139 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 9.000 10.000
conc, mg/ml
Intrebari de verificare
1. Care este principiul fundamental al metodelor cromatografice

2. Care sunt criteriile de clasificare ale metodelor cromatografice

3. Cum se clasifica procesele cromatografice ȋn funcție de mecanismul

separǎrii ?

4. Care este principiul cromatografiei de absorbție?

5. Care este principiul cromatografiei de repartiție?

6. Care este principiul cromatografiei de schimb ionic?

7. Care este principiul cromatografiei de excluziune ?

8. Cum se clasifica procesele cromatografice ȋn funcție de natura fazelor

cromatografice?
9. Care sunt fazele oricǎrei tehnici cromatografice?

10. Care este componența generalǎ a unui cromatograf?

11. Care sunt elementele de bazǎ ale unei cromatograme ?

12. Enumerați conceptele fondamentale ȋn cromatografie

13. La ce se referǎ distribuția ȋn cromatografie ?

14. La ce se referǎ rezoluția ȋn cromatografie ?

15. La ce se referǎ selectivitatea ȋn cromatografie ?

16. Pe ce se bazeaza analiza calitativa ȋn cromatografie ?

17. Pe ce se bazeaza analiza cantitativa ȋn cromatografie