Buletin USAMV-CN, 65 (1-2)/2008 (-)

ISSN 1454-2382

ACŢIUNEA UNOR FACTORI FIZICI ASUPRA UNOR TULPINI DE NEISSERIA

SP., IZOLATE DE LA ANIMALE

Răpuntean S., N. Fiţ, F. Chirilă, G. Nadăş, Cuc Cosmina, Daniela Călina, Cristina Drig

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca

e-mail: grapuntean@usamvcluj.ro

Key words: Neisseria, sensibilitate/rezistenţă, factori fizici.

ABSTRACT

De la animale cu diferite afecţiuni (rinită, conjunctivită, otită, dermatită, mamită), au

fost izolate mai multe tulpini de Neisseria sp., care au fost identificate pe baza caracterelor
morfologice (grupare diplo, aspect de bob de cafea), afinitatea tinctorială (coci Gram
negativi), culturale (aspecte în medii lichide şi pe medii solide) şi biochimice (testare pe
sistemul API NH). Un număr de 6 tulpini au putut fi identificate ca aparţinând speciei N.
polysaccharea. Dintre acestea s-au selectat două tulpini, N. polysaccharea (9b2) şi N.
polysaccharea (23/7a), care au fost testate în privinţa sensibilităţii/rezistenţei faţă de următorii
factori fizici: temperatură 65oC, congelare-decongelare, radiaţii ultraviolete, microunde şi
ultrasunete. Prin determinările efectuate se precizează că tulpinile de Neisseria testate sunt,
sensibile la temperatură, radiaţii UV, microunde şi au o rezistenţă mai ridicată la
congelare/decongelare şi ultrasunete.

INTRODUCERE

În clasificarea taxonomică actuală neisseriile sunt încadrate în familia Neisseriaceae,

genul Neisseria, în care sunt incluse 29 de specii şi subspecii. Dintre acestea două specii sunt
foarte cunoscute, respectiv N. gonohorreae şi N. meningitidis, care sunt patogene pentru om.
Celelalte specii sunt considerate comensale şi se găsesc pe mucoasele omului şi animalelor, la
nivelul cărora pare să realizeze o relaţie tranzitorie şi superficială, fără a induce formarea de
anticorpi specifici (1, 3). Cu toate acestea în literatura de specialiate apar semnalări, tot mai
frecvente, de implicare a speciilor de Neisseria, altele decât cele două recunoscute ca
patogene, în producerea unor afecţiuni la om sau la animale, mai ales pe organisme cu diferite
forme de imunosupresie. La om sunt descrise implicarea în producerea de endocardite,
meningite, otite, artrite, septicemie, afecţiuni pulmonare, plăci dentare, complicarea unor
plăgi (mai ales cele cauzate de muşcături de câine) şi altele, evoluând ca infecţii oportuniste la
pacienţii cu imunodeficite (4, 6, 8). La animale s-au descris cheratoconjunctivite la ovine şi
caprine (N. ovis), mamite la vaci, rinite şi conjunctivite la câini şi pisici (N. canis, N.
lactamica, N. flavescens, N. sicca, N. animalorum, N. zoodegmatis), îmbonăviri respiratorii la
animale de laborator (N. cuniculi, N. denitrificans, N. animalis, N. caviae), afecţiuni dentare
(N. dentiae) (8, 9). Specia N. polysaccharea a fost recunoscută ca taxon în 1983 (7). Pe de altă
parte prezenţa neiserilor comensale în mediile de cultură crează dificultăţi de diferenţiere faţă
de neisserile patogene, cât şi faţă de alţi coci, (îndeosebi micrococi, stafilococi), cât şi faţă de
specii ale unor bacili Gram negativi pigmentogeni în galben (Flavobacterium, Alcaligenes)
sau care produc colonii mucogene (Klebsiella, Acinetobacter). În literatura de specialitate sunt
puţine date referitoare la sensibilitatea tulpinilor de Neisseria sp., la diferiţi factori fizici,
motiv pentru care am procedat la testarea unor tulpini izolate de la animale la unii factori
amintiţi. Rezultatele îşi au aplicabilitate în distrugerea neisseriilor din diferite materiale, din
alimente, din aer, cât şi pentru prepararea unor antigene.

MATERIAL ȘI METODE

Temperatura. S-au pregătit 5 tuburi cu cultură în bulion nutritiv glucozat de 24 de ore,

(5 ml/tub), la densitatea 2 pe scara McFarland. Tuburile cu cultură s-au introdus într-o baie de
apă încălzită la 65oC, fiind menţinute la această temperatură 10, 15, 20, 30 şi 45 de minute.
După expirarea timpului de expunere, din fiecare tub s-a scos câte 1 ml, care s-a dispersat pe
geloză nutritivă în plăci Petri, care s-au incubat la 37oC. Citirea plăcilor s-a făcut la 24 şi 48
de ore, apreciind dezvoltarea şi numărul coloniilor (UFC/ml).
Congelare-decongelare. Suspensia pregătită după metodologia mai sus descrisă, s-a
repartizat în tuburi de crioconservare în cantitate de 3 ml. Acestea au fost supuse unor cicluri
de îngheţ-dezgheţ cu o durată de 3 ore, fiind realizate un număr de 4 cicluri, într-un interval
de 12 ore. După fiecare ciclu de îngheţ-dezgheţ, s-au efectuat frotiuri ce s-au colorat prin
metoda Gram, pentru a observa aspectul morfologic al neisseriilor şi însămânţări pe geloză
glucozată, pentru a constatat viabilitatea acestora.
Radiaţii ultraviolete. Din cultura în bulion a tulpinilor de tesat, s-au efectuat
însămânţări „în gazon” pe medii solide repartizate în plăci Petri (3 plăci pentru fiecare timp de
expunere şi tulpină). Acestea s-au introdus la termostat timp de 20 de minute pentru uscarea
suprafeţei, după care s-a ecranat o parte din cutia Petri însămânţată cu o placă ceramică opacă,
iar partea liberă s-a expus la radiaţii UV, la următorii timpi: 5 minute, 15 minute şi 30 de
minute. Plăcile s-au incubat în continuare la 37oC timp de 18-24 de ore. La citire s-a apreciat
dezvoltarea sau inhibarea dezvoltării culturi în zona iradiată, comparativ cu zona neexpusă.
Din zona iradiată, dacă nu s-a dezvoltat cultură, s-au făcut însămânţări pe alte medii de
cultură, pentru a verifica dacă efectul indus este bactericid sau bacteriostatic.
Microunde. Pentru fiecare tulpină testată s-au pregătit câte 3 tuburi cu cultură în bulion
nutritiv glucozat de 24 de ore, (5 ml/tub), la densitatea 2 pe scara McFarland. Tuburile au fost
introduse la un cuptor cu microunde, la puterea de 100 W şi la timpii de expunerea de 1 minut
(tubul 1), 2 minute (tubul 2) şi 3 minute (tubul 3). După terminarea expunerii, din fiecare tub
s-au efectuat însămânţări pe medii de cultură, pentru a verifica efectul indus.
Ultrasunete. Fiecare tulpină s-a cultivat în 5 plăci Petri cu diametrul de 90 mm,
însămânţarea plăcilor fiind făcută prin inundare. După 24 de ore de incubare la temperatura de
37oC, se repartiza în fiecare placă Petri câte 5ml soluţie fiziologică sterilă, procedând la
raclarea coloniilor. Suspensia recoltată din toate plăcile (30 ml, DO 5 pe scara McFarland)
era supusă dezintegrării prin ultrasonicare, folosind dezintegratorul DUS P 150 (INCDFT)
Iaşi, la puterea 21-22 kHz. Timpii de expunere au fost următorii (minute): 5, 15, 30, 45, 60 şi
90 (cifre cumulate). După fiecare timp de expunere, se efectua controlul dezintegrării prin
efectuarea de frotiuri, colorate prin metoda Gram (controlul morfologic) şi însămânţări pe
medii lichide şi solide (controlul viabilităţii).

REZULTATE ȘI DISCUȚII

La temperatura de 65oC tulpinile de Neisseria testate au prezentat variabilitate în

privinţa inactivării, în funcţie de timpul de expunere. La 10 minute de expunere tulpina 9b2
s-a dovedit sensibilă fiind inactivată, iar tulpina 23/7a s-a dovedit rezistenţă, dezvoltându-se
în cultură, fiind numărate 172 colonii/ml. La ceilaţi timpi de expunere 15, 20, 30 şi 45 de
minute, nu s-au mai dezvoltat colonii la nici una dintre tulpinile testate. La aceşti timpi de
expunere, plăcile însămânţate au rămas sterile la sfârşitul a 72 de ore de observaţie, ceea ce
înseamnă că neisserile sunt omorâte, începând cu expunerea de 15 minute. Efectul nociv este

2
realizat prin coagularea sau denaturarea diferitelor componente din structurile parietale sau
citoplasmatice, modificări care sunt incompatibile cu supravieţuirea, aspect demonstrat prin
faptul că neisserile nu s-au mai dezvoltat în mediile de cultură.
La congelare/decongelare, neisserile s-au dovedit destul de rezistente. După primul
ciclu de două ore îngheţ, nu s-a înregistrat moduficări. În frotiuri s-a constatat că celulele şi-au
păstrat integritatea şi afinitatea tinctorială, iar la însămânţarea făcută pe geloza nutritivă s-au
dezvoltat colonii, având caracterele tipice ale neisseriilor. După al doilea şi al treilea ciclu, în
frotiuri s-a constatat că celule îşi păstrează aspectul morfologic caracteristic, dar s-au constatat
modificări în privinţa afinităţii tinctoriale, multe celule colorându-se foarte slab, fiind
evidenţiat numai conturul. La însămânţări pe geloza nutritivă s-a constatat o scăderea a
numărului de celule formatoare de colonii. La al patrulea ciclu, s-au înregistrat modificările
descrise anterior, cu menţiunea că a crescut numărul celulele cu modificarea tinctorialităţii şi
a scăzut şi mai mult celulele formatoare de colonii.
Radiaţia ultravioletă (UV) este o componentă invizibilă a radiaţiei solare, situată ca
lungime de undă, între infraroşu şi radiaţia X. Există trei tipuri de lumină UV (UV-A, UV-B
şi UB-C), care diferă ca lungime de undă şi au efecte diferite asupra organismelor vii.
Radiaţia UV-C are lungimea de undă cuprinsă între 100 nm şi 280 nm şi au efect distructiv
asupra celulelor vii, provocând grave leziuni celulare. Lămpile cu UV-C generează radiaţii cu
lungimea de undă de 253,7 care au acţiune antibacteriană (14). Pentru a ucide
microorganismele, radiaţiile UV penetrează membrana celulelor, străbate conţinutul celulei şi
distruge ADN-ul celular, determinând leziuni care împiedică activitatea bacteriei şi
capacitatea acesteia de a se reproduce. Spectrul germicid al lămpilor cu UV-C este larg, ele
fiind capabile să distrugă orice microorganism care conţine acizi nucleici (ADN sau ARN).
Dozele de iradiere se exprimă în mWs/cm2, eficacitatea fiind foarte mare (90-99%). Conform
datelor din literatură doza pentru Neisseria catharalis este de 4,4mWs/8,5cm2 (15).
În condiţiile noastre de lucru, iradierea s-a produs cu o lampă cu puterea de ….. şi de
la o distanţă de aproximativ 40-50 cm, în interiorul unei hote cu flux laminar (…….).
Radiaţiile ultraviolete s-au dovedit foarte active, având cu certitudine un efect „cid” care s-a
exprimat prin inhibarea dezvoltării culturii în zona de placă expusă acţiunii radiaţiilor (mediul
rămâne transparent), comparativ cu partea care a fost ecranată în care cultura s-a dezvoltat
abundent, fiind observată o delimitarea netă între cele două zone (fig. 1). Timpul minim care a
dus la inactivarea a fost de 5 minute.
Eficienţa acţiunii bactericide a dispozitivelor cu radiaţii UV-C, depinde de realizarea
condiţiilor optime de lucru. Timpul de expunere depinde de tipul microorganismelor. În cazul
dezinfecţiei suprafeţelor, timpul de expunere depinde şi de distanţa faţă de sursa de radiaţie.
Un optim privind mărimea suprafeţei iradiate şi timpul de expunere, se obţine pentru o
distanţă de 1 m. Distanţa faţă de sursa de radiaţie nu trebuie să fie mai mare de 3,5 m. O
atenţie deosebită trebuie asigurată măsurilor de protecţia muncii, întrucât radiaţia UV poate
provoca leziuni oculare şi arsuri superficiale ale pielii (15).
Microundele sunt o formă de energie electromagnetică, generate de instalaţii
electronice având lungimea de undă cuprinsă între 30 cm şi 1 mm, în mod corespunzător
frecvenţa variază între 109 – 3 x 1011 Hz (16). Câmpul electromagnetic din microunde
interacţionează cu structurile biologice la nivel celular, determinând efecte directe şi indirecte.
În urma pătrunderii microundelor în mediul apos, are loc o agitaţie puternică a moleculelor de
apă, care determină o încălzirea bruscă manifestată prin creşterea temperaturii, care duce la
inactivarea microbilor. Ca mecanisme se menţionează modificarea potenţialului de membrană
şi alterarea ireversibilă a proceselor de transport transmembranar, electroporarea ireversibilă a
membranelor, formarea de radicali liberi cu mare capacitate de oxidare. Se precizează că
interacţionează cu elemente din membrana celulară ducând la blocarea situsurilor de pe
membrană, proces specific microorganismelor cu multiplicare activă.

3
 În condiţiile noastre de lucru s-a constatat că suspensia de Neisseria, (ambele tulpini),
la 1 minut de expunere, au rezistat şi s-au dezvoltat în cultură, formând colonii pe întreaga
suprafaţă a plăcii sau în sectorul în care s-a făcut însămânţarea. La timpii de 2 şi 3 minute,
inhibiţia s-a produs în totalitate, mediile de control pe care s-au făcut însămânţări din tuburile
respective au rămas sterile (fig. 2). Putem menţiona că tulpinile de Neisseria testate s-au
dovedit foarte sensibile la microunde, fiind inactivate după 2 minute de expunere.
Ultrasunetele (US) sunt vibraţii elastice cu o frecvenţă mai mare de 20.000 Hz cu efect
“cid” asupra multor microorganisme. Dezintegratoarele puternice de 200.000 Hz realizează
dezintegrarea oricărui microb, inclusiv a sporilor şi micobacteriilor. In celulele expuse US se
observă o mişcare activă a conţinutului celular, mai ales la nivelul citoplasmei, având ca
rezultat alterarea stării coloidale normale şi moartea celulelor microbiene. Se realizează aşa
numitul proces de cavitaţie, ce constă în ruperea şi golirea celulei de conţinut. La procesul de
fragmentare a structurilor microbiene mai contribuie şi bulele mici de gaze dizolvate în
mediul de dispersie care, prin mişcarea lor energică, se izbesc de membrane contribuind la
ruperea lor. Bulele mici se contopesc în bule mai mari care încep să vibreze şi apoi se sparg
dând naştere unor presiuni locale foarte mari care se manifestă sub forma de şocuri hidraulice
în volume foarte mici. In cursul acţiunii US, se ating temperaturi de 50-80oC, care contribuie
la moartea microorganismelor.
Domeniul de utilizare a ultrasunetelor este larg şi vizează îndeosebi disrumpţia
microorganismelor în scopul obţinerii de antigene, prepararea vaccinurilor, sterilizarea şi
curatirea instrumentelor chirurgicale, întreruperea fermentaţiilor etc.
În condiţiile noastre de lucru am constatat că modificările induse asupra neisseriilor se
corelează cu timpul de expunere la ultrasunete. Nu s-au înregistrat diferenţe între cele două
tulpini examinate. În tabelul nr. 1 sunt redate modificările calitative constatate la timpii de
expunere ca urmare a acţiunii ultrasunetelor.

Modificări ale neisseriilor la acţiunea ultrasunetelor

Timpii de
Aspecte privind morfologia celulelor
expunere
(frotiuri colorate Gram)
(minute)
5 Celule întregi, intacte, colorate
uniform,
15 Multe celule intacte, colorate uniform,
rare celule neuniforme, şi colorate
palid.
30 Amestec relativ uniform de celule cu
morfologie tipică şi afinitate tinctorială,
dar şi celule sparte, rupte, palid
colorate, detritururi celulare.
45 Predominanţa celulelor sparte, palid
colorate, cu numeroase detritusuri
celulare, rare celule de aspect normal
60 Aspecte asemănătoare celor descrise la
timpul de 45 de minute.
90 Se evidenţiază un număr foarte mare de
celule dezintegrate, detritusuri celulare
numeroase şi foarte rare celule întregi.
Tabel nr. 1
Aspecte privind dezvoltarea în cultură
(geloză nutritivă glucozată)
Formarea de colonii dense pe striile de
însămânţare
Formarea de colonii dense pe primele
strii de însămânţare şi o scădere treptată
a numărului pe striile finale
Formarea de colonii pe primele 2-3 strii
de însămânţare, cu o dispunere
rarefiată, pe măsură ce se epuizează
inoculul
Formarea de colonii rare şi numai pe
prima şi a 2-a strie de însămânţare
Formarea de colonii rare şi numai pe
prima linie de însămânţare.
Plăcile de cultură au rămas sterile, se
evidenţiază numai striile liniilor de
însămânţare.

4
 Din analiza datelor prezentate în tabelul nr. 1 se poate constata că neisseriile prezintă
rezistenţă la acţiune ultrasunetelor. Eficacitatea creşte pe măsura creşterii timpului de
expunere. Dezintegrarea totală s-a produs numai după însumarea a 90 de minute de expunere,
când aproape toate celulele apar lizate. Chiar dacă unele celule apăreau întregi, ele şi-au
piedut viabilitatea sub acţiunea ultrasunetelor, încât şi-au pierdut viabilitatea devenind
inacapabile să se mai dezvolte în mediile de cultură.

a a

b b

Fig. 1 - Efectul radiaţiilor UV la 5 şi 15 minute expunere

a) zone iradiate b) zone neiradiate

a b

Fig. 2 – Efectul microundelor la expunerea de 1, 2 şi 3 minute

a) tulpina 9b2 b) tulpina 23/7a

CONCLUSIONS

1. S-a testat sensibilitatea/rezistenţa unor tulpini de Neisseria sp., izolate de la animale

faţă de următorii factori fizici: temperatură 65oC, congelare-decongelare, radiaţii
ultraviolete, microunde şi ultrasunete.
2. La temperatura de 65oC, tulpinile de Neisseria tesate au fost inactivate după un timp
de expunere de 15 minute. TTM pentru temperatura de 65 oC este de 15 minute, iar
PTM este de ………..
3. Ciclurile de congelare/decongelare, repetate la interval de ……. ore, nu a dus la
inactivarea neisseriilor; se poate deduce ca la tempertauri scăzute (- 20 oC) se asigură
condiţii prielnice de conservare a tulpinilor testate.

5
4. Radiaţiile ultraviolete s-au dovedit foarte active având efect „cid”, fiind inactivate la
timpii de expunere 5, 15 şi 30 minute. Timpul minim care a dus la inactivarea a fost de
5 minute, efectul fiind bactericid.
5. Expunerea la microunde la puterea de 100W a unui cuptor cu microunde, timp de 1, 2
şi 3 minute, a dus la inactivare după 2 minute de expunere, efectul fiind bactericid.
6. Expunerea la ultrasunete folosind dezintegratorul DUS P 150 (INCDFT) Iaşi, la
puterea 21-22 kHz a dus la inactivarea totală la 90 minute expunere, efectul indus fiind
microbicid.

BIBLIOGRAPHY

1. Buiuc D., Neguţ M., (2008) Tratat de Microbiologie Clinică. Cap. Identificarea cocilor
Gram negativi aerobi – Editura Medicală, Bucureşti, p. 608-618;
2. Cabeza M. C., Ordóñez A. J., Cambero I., de la Hoz L., Garcia M. L., (2004) Effect
of thermoultrasonication on Salmonella enterica serovar Enteritidis in distilled water
and intact shell eggs – Journal of Food Protection, 67, (9), p. 1886-1891;
3. Dent V. E., (1982) Identification of oral Neisseria species of animals – Journal of
Applied Microbiology, 52, (1), p. 21-30;
4. Guibourdenche M., Lambert T., Riou Y., (1989) Isolation of Neisseria canis in mixed
culture from a cate bite – J. Clin. Microbiol., 27, (7), p. 1673-1674;
5. Huhtanen C. N., (1968) Effect of low-freqency ultrasound and elevated temperature
on isolation of bacteria from raw milk – Applied Microbiology, p. 470-475;
6. Michaux-Charachon Sylvie, Lavigne Jean-Philipe, Anne Le Flèche, Bouziges Nicolle,
Sotto A. D., Grimont A. P., (2005) Edndocarditis Due to a New Rod-Shaped Neisseria
– J. Clin. Microbiol., 43, (2), 886-889;
7. Riou Y.J., Guibourdenche M., (1987) Neisseria polysaccharea sp. nov., Int. J.
Bacteriol., p. 163-165;
8. Sneath P.H., Barrett S. J., (1996) A new species of Neisseria from the dental plaque of
the domestic cow, N. dentiae sp. nov., - Lett Appl. Microbiol., 23, (5), 355-358;
9. Vandamme P., Holmes B., Bercovir H., Coenye T., (2006) Classification of Centres
for Disease Control Group Eugonic Fermenter EF-4a and EF-4b as Neisseria
animaloris sp. nov., and Neisseria zoodegmatis sp. nov., respectively – Int. J. Syst.
Evol. Microbiol., 56, p. 1801-1805;
10. Veron M., Lenvoise-Furet A., C., Coustere C., Ged C., Grimont F., (1993)
Relatedness of three species of “false neisseriae”, N. caviae, N. cuniculi and N. ovis,
by DNA-DNA hybridizations and fatty acid analisysis – Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,
43, p. 210-220;
11. *** Ultrasonic Homogeniser Applications, Alphabetical listing (A-H) (I-S):
http://www.biologics-inc/sd-appli.htm;
12. *** Kinetics of Microbial Inactivation for Alternative Food Processing Technologies:
Ultrasounds – Centre for Food Safety and Applied Nutrition, 2, 2000.
13. *** API NH System d’identification des Neisseria et Haemophilus – Biomerieux,
S.A. Franţa – Instrucţinui de folosire.
14. *** Biocamp, lampi bactericide, Despre lumina ultravioletă:
http://www.biocomp.ro/ro/index.php?module=desprelumina,
15. *** Lampi Bactericide UV: http://www.clubafaceri.ro/director/stand/
16. *** Undele electromagnetice, Undele radio, Microundele, Radiaţia infraroşie, Radiaţia
vizibilă, Radiaţia ultravioletă, Radiaţia X:
http://www.referatele.com/referate/fizica/online10