Spectrofotometria 

este o ramură a spectroscopiei care se ocupă cu măsurarea cantitativă a

proprietăților de reflexie sau de transmisie ale unui material (substanță) în funcție de
lungimea de undă. Termenul de spectrofotometrie este specific măsurătorilor în care este
utilizată radiația electromagnetică din spectrul infraroșu (IR), vizibil (VIS) și ultraviolet
(UV), ea făcând astfel parte din spectroscopia electromagnetică. În practică, metoda se
bazează pe proprietatea de absorbție sau de transmisie a compușilor chimici la diverse
lungimi de undă. Astfel, spectrofotometria este folosită atât ca metodă calitativă pentru
identificarea prezenței unei substanțe într-o soluție, cât și cantitativă pentru identificarea
concentrației unei substanțe dintr-o soluție. De asemenea, metoda poate fi utilizată pentru
determinarea constantei de echilibru a unei soluții. Într-o reacție chimică, echilibrul chimic
este starea în care ambii reactanți și produși sunt prezenți în concentrații care nu mai
manifestă tendința de modificare în timp. De obicei, această stare se atinge când reacția
directă are loc cu aceeași rată ca și reacția inversă. Ratele de conversie a reacției directe și a
celei inverse sunt diferite de zero dar, fiind egale, nu există modificări nete ale concentrațiilor
reactantului și produsului. Acest proces se numește echilibru dinamic. Din punct de vedere
spectrofotometric, determinarea concentrațiilor reactanților și produșilor într-o astfel de
situație, presupune măsurarea luminii transmise de către soluție. Orice compus chimic
absoarbe, transmite sau reflectă lumină (radiație electromagnetică) în cadrul unui interval de
lungimi de undă. Aparatele destinate acestor măsurători se numesc spectrofotometre.

Spectrofotometrul este un instrument capabil să măsoare cu precizie cantitatea de fotoni

(intensitatea luminii) absorbită de trecerea lor printr-o probă (soluție). Astfel, se poate
determina indirect și cantitatea de substanță (concentrația). În funcție de spectrul lungimilor
de undă pe care le emite sursa de lumină, spectrofotometria are două variante: – UV/VIS
utilizează lungimi de undă cuprinse între 185 – 400 nm (UV) și 400 – 750 nm (VIS). – IR
utilizează lungimi de undă cuprinse între 750 nm – 1000 µm.

Spectrofotometria UV/VIS este utilizată cel mai frecvent în chimia analitică

pentru determinarea cantitativă:

1) A soluțiilor ce conțin cationi ai metalelor tranziționale, majoritatea fiind colorate (absorb

radiații electromagnetice din spectrul vizibil) datorită electronilor de pe orbitalii de tip d care
pot fi ușor excitați fiind astfel determinați să execută tranziții cuantice. Culoarea soluțiilor ce
conțin astfel de cationi poate fi însă afectată de prezența unor anioni sau liganzi. De ex.
soluția de CuSO4 de culoare albastră deschis poate fi intensificată cu ajutorul amoniacului
care poate să schimbe maximul de absorbție.

2) A compușilor organici, în special aceia care manifestă un înalt grad de conjugare (sisteme
cu orbitali p în care alternează legături simple cu cele multiple și care, în general, scad
energia totală a moleculei, crescându-i astfel stabilitatea). De ex. ADN, ARN și proteinele
absorb radiația electromagnetică mai ales din spectrul UV și foarte rar din cel vizibil. Pentru
aceste determinări, ca solvent, se folosește de cele mai multe ori etanolul pentru că absoarbe
mult mai puțin decât apa

Principiul spectrofotometriei UV/VIS se bazează pe legea Lambert-Beer. Această lege

prevede că cantitatea de lumină absorbită de o soluție este expresia unei funcții exponențiale
a concentrației și a lungimii de undă în raport cu acea soluție. Calibrarea metodei pentru o
anumită substanță implică două etape distincte:
 1. Se determină maximul de absorbție al substanței respective făcând un scanning a
lungimilor de undă în concordanță cu culoarea acesteia. Dacă substanța este
incoloră, se identifică o reacție de culoare specifică acesteia și se analizează
produsul colorat.
2. Se determină relația dintre concentrația substanței luată în analiză (sau a
produsului rezultat dacă e vorba de o reacție de culoare) și absorbție. Această
determinare se face la lungimea de undă ce corespunde maximului de absorbție
determinat la etapa 1.

OBSERVAȚII

Identificarea lungimii de undă ce manifestă absorbție maximă trebuie realizată pe o probă a

cărei concentrație nu determină la această lungime de undă o absorbție mai mare de 1.
Valorile convenabile pentru absorbție sunt situate între 0,1 și 1. Peste această valoare efectul
de umbrire al particulelor poate modifica corectitudinea rezultatelor. Această situație implică
concentrații prea mari în care particulele componente ale soluției, fiind prea apropiate, se pot
afla una în spatele celeilalte și nu contribuie la absorbție. De aceea, pentru o substanță
oarecare, identificarea acestei concentrații se face prin încercări.