Laborator 3

DIAGNOSTICUL PATOGENETIC AL PROCESELOR

INFLAMATORII
1. Mecanismul și testele asociate reacției inflamatorii
Inflamația este răspunsul organismului la agresiuni nespecifice (factori
chimici, traumatici sau infecțioși). Agresiunea are loc la nivel biochimic. O
cerință de bază este vascularizația țesutului agresat. Răspunsul inflamator este
un proces complex care implică răspunsuri umorale și celulare și decurge în
trei etape principale:
● Vasodilatație – creșterea fluxului de sânge, ceea ce favorizează
distribuirea fagocitelor, factorilor de coagulare, anticorpilor, etc., în
zona afectată.
● Permeabilitate crescută a vaselor de sânge - permite proteinelor
plasmatice să părăsească circulația și să ajungă în zona agresată.
● Migrarea leucocitelor la locul agresiunii.

Răspunsul inflamator este prin urmare un răspuns de apărare, destinat

să elimine cauza și consecințele agresiunii tisulare. Dacă inflamația care rezultă
este deficitară sau excesivă apare un răspuns inflamator patologic, asociat cu
agravarea leziunilor inițiale. În același timp are loc eliberarea în exces a
mediatorilor inflamatori și se asociază o reacție sistemică masivă, care în cele
din urmă duce la leziuni tisulare și disfuncție de organ. Sindromul de răspuns
inflamator sistemic (SIRS), numit sindromul inflamator sistemic (SIS), este
non-specific și poate fi cauzat de ischemie, inflamație, traumatisme, infecție sau
o combinație de mai multe dintre acestea. Bone (1996) rezumă relațiile dintre
inflamație și SIRS ca un proces în trei etape:
• Etapa I: După o insultă, sunt produse citokine cu scopul de a iniția un
răspuns inflamator, promovând astfel vindecarea rănilor.
• Etapa II: cantități mici de citokine locale sunt eliberate în circulație
pentru a îmbunătăți răspunsul local. Acest lucru duce la o stimulare a
factorilor de creștere și recrutarea macrofagelor și trombocitelor. Acest
răspuns de fază acută este de obicei bine controlat de o scădere a
mediatorilor proinflamatori și eliberarea factorilor antiinflamatori.
• Etapa III: Dacă homeostazia nu este restaurată, apare o reacție
sistemică semnificativă. Eliberarea în exces de citokine duce la
agravarea leziunilor, sunt activate numeroase cascade umorale și
sistemul reticulo-endotelial, rezultând pierderea ulterioară a integrității
circulației și insuficiența de organ.

1
 Tabel. Mecanismele și testele asociate inflamației
MECANISM Semne/ Teste
simptome
RĂSPUNSUL INFLAMATOR LOCAL:
Răspuns vascular:
Arteriole, sfinctere precapilare:
1. vasoconstricţie (activă): paloare hiperemie Dozarea mediatorilor
2. vasodilataţie (activă): hiperemie eritem cald inflama-tori: prostaglandine,
leukotriene, tromboxani,
PAF, substanţa P, citokine …
Capilare, venule postcapilare exudat, Analiza exudatului:
vasodilataţie (pasivă) tumefiere, Reacţia RIVALTA
creşterea permeabilităţii durere, Reacţia PANDY (LCR)
reducera
RĂSPUNS CELULAR: funcţiei
1. migrarea leucocitelor Biopsie tisulară
2. fagocitoza : Test de fagocitoză in vitro
mecanismele de distrucţie Testul NBT
oxigen-dependente (SRO, SRN), (nitro-blue-tetrazolium)
oxigen-independente (enzime Mieloperoxidaza (MPO)
lizozomale, proteine cationice) Proteaze (MMP)
ANCA
Lactoferina
Specii reactive ale oxigenului
(SRO)și azotului (SRN)
Radiofarmaceutice pentru
marcarea leucocitelor
RĂSPUNSUL INFLAMATOR
SISTEMIC:
1. Răspunsul de fază acută al Curba febrilă
sistemului nervos: febra febră
stare generală
2. Răspunsul hepatic de fază acută: alterată Proteine serice totale
sinteza proteinelor de fază acută Proteina C reactivă
Complement (C3, C4)
VSH
Lipoproteine serice
3. Răspunsul medular de fază acută: Număr total de leucocite
leucocitoză Formula leucocitară
Număr de hematii,
2
 hemoglobină, hematocrit
Sideremie
Număr de plăcuțe sanguine

2. Testele diagnostice patogenetice pentru inflamație au menirea de a

pune diagnosticul pozitiv de proces inflamator. Se completează cu teste
etiologice, etiopatogenetice, funcţionale (în funcție de organul afectat) şi teste
pentru complicaţiile posibile.

I. Leucograma
Una din cele mai sensibile teste ale reacţiei de fază acută este creşterea
numărului şi imaturităţii neutrofilelor circulante, leucocitoză cu neutrofilie.
Eliberarea neutrofilelor se datorează acţiunii directe a interleukinei-1 asupra
măduvei osoase hematogene.
Valori normale leucocite la adult = 4000-10000/µL sau
4-10×109/L; la copii valori mai mari, diferite în funcţie de vârstă.
Valori de referinţă neutrofile: la adult = 2000-8000/µL sau
2-8×109/L; 45-80% din leucocite.

II. VSH
VSH este cel mai utilizat test non-specific în diagnosticului inflamaţiei
pentru afecţiuni reumatologice. VSH este afectată de modificări ale
concentraţiei proteinelor plasmatice cum sunt fibrinogenul, proteina C reactivă
şi imunoglobulinele. Concentraţia acestor proteine creşte rapid în caz de leziuni
tisulare sau ca răspuns la stimuli inflamatori. Când hematiile se grupează în
rulouri, ca urmare a creşterii concentraţiei serice de proteine asimetrice, cum
sunt reactanţii de fază acută (fibrinogen, haptoglobină, macroglobulină) scade
potenţialul negativ al hematiilor (responsabil de menţinerea eritrocitelor
normale în suspensie) și hematiile vor sedimenta mai rapid, determinând
creşterea VSH.
În afecţiuni cronice ca şi tuberculoza sau bolile maligne creşterea VSH
se asociază cu modificări ale imunoglobulinelor plasmatice.
Valori normale la adultul sub 50 de ani, 0 – 20 mm/h şi valorile cresc
cu vârsta.
Boli în care VSH nu creşte: policitemie, anemii asociate cu poikilocitoză,
hipofibrinogenemie.
În bolile reumatice, când creşte VSH (adesea de 30 – 100 mm/h) acesta
poate fi utilizat ca indice de severitate a inflamaţiei, iar când scade, este util în
urmărirea terapiei.

III. Răspunsul hepatic de fază acută

La 8 – 12 ore de la inițierea reacției inflamatorii ficatul va creşte sinteza
de proteine de fază acută. În cadrul răspunsului vor creşte proteine care se
3
găsesc în mod normal în plasmă, dar vor apare şi unele proteine noi care pot fi
utilizate ca markeri pentru evenimentul patologic. Răspunsul de fază acută este
reglat de citokine. Dintre acestea, interleukina-6 (IL-6) reprezintă stimulul
major pentru majoritatea proteinelor de fază acută. Alte citokine inflamatorii
cum sunt interleukina-1β (IL-1β), factorul de necroză tumorală α (TNF-α),
interferonul gama (IFN-γ), şi factorul de creştere şi transformare β (TGF-β)
reglează anumite tipuri de proteine de fază acută. Astfel creşte de mai multe ori
faţă de normal concentraţia a mai multor proteine plasmatice: haptoglobina,
anumite proteaze inhibitorii ca alfa-1-antitripsina,
alfa-1-antichimotripsina, alfa-2-macroglobulina, glicoproteina acidă
alfa-1, componentele complementului (C1 – C4), ceruloplasmina, feritina
şi fibrinogenul. Totuşi, adevăraţii reactanţi de fază acută cresc de câteva sute
de ori: amiloidul seric A, un precursor al amiloidului în amiloidoza secundară
şi proteina C reactivă.
Dintre toţi reactanţii de fază acută, fibrinogenul, proteina C reactivă şi
amiloidul seric A sunt cei mai importanţi din punct de vedere clinic şi pot fi
dozaţi în majoritatea laboratoarelor clinice ca markeri ai reacţiei de fază
acută.
În cazul reacţiei inflamatorii acute, creşterea concentraţiei proteinelor
de fază acută este corelată cu activitatea răspunsului inflamator. În disfuncţia de
organ fără inflamaţie, ea nu este prezentă. Prin urmare, determinarea
proteinelor de fază acută este un criteriu important pentru diferenţierea dintre
afectarea inflamatorie şi funcţională a unui organ.
Afecţiunile maligne pot de asemenea conduce la o creştere a proteinelor
de fază acută; utilizarea lor poate fi limitată însă în cazul asocierii unei infecţii.
În inflamaţia cronică, creşterea proteinelor de fază acută este adesea
mai mică decât se aşteaptă pentru severitatea afecţiunii; aceasta se datorează
„down-regulation” la nivelul sintezei.
a. Valorile plasmatice normale ale fibrinogenului sunt 200 – 400
mg/dL şi cresc în primele 24 de ore de la evenimentul declanşant.
b. Proteina C reactivă (PCR) se sintetizează primar în hepatocit;
sinteza sa este iniţiată la 4-6 h după agresiune. PCR activează complementul via
calea clasică pentru a opsoniza şi a îndepărta microorganismele şi în plus
acţionează ca o proteină reglatoare în activarea complementului pe cale
alternativă. Nivelul plasmatic normal al proteinei C reactive este sub 0,5
mg/dL, dar creşte dramatic şi foarte rapid în prezenţa infecţiilor bacteriene,
când valoarea sa ajunge >10 mg/dL. Odată cu rezoluţia acestor infecţii, nivelul
PCR scade în câteva zile. Nivele moderat crescute de PCR de 1-10 mg/dL se
întâlnesc în boli inflamatorii cum este lupusul eritematos sistemic (LES), bolile
maligne, insuficienţa cardiacă congestivă şi în sarcină. În infecţiile virale nivelul
PCR este normal până în momentul suprainfecţiei bacteriene. PCR este extrem
de util ca marker inflamator de urmărire a pacienţilor operaţi. În cazurile
necomplicate, nivelul PCR creşte atingând un vârf în primele 48-72 de ore
4
postoperator şi revine la normal în primele şapte zile. Dacă apar complicaţii
postoperatorii, ca inflamaţii sau stare septică, nivelul de PCR rămâne crescut.
Concentraţia de PCR nu creşte în infecţiile virale sau cele cu spirochete.
Astfel, în absenţa traumei, concentraţiile foarte mari pot fi sugestive pentru
infecţia bacteriană. În plus, concentraţiile măsurate în dinamică sunt utile
pentru monitorizarea răspunsului la terapia antimicrobiană. La pacienţii cu
meningită bacteriană, concentraţiile foarte mari pot fi utilizate ca markeri
predictivi pentru sechelele neurologice.
Răspunsul PCR la inflamaţie apare chiar şi în perioada neonatală, când
nivelele serice sunt importante în diagnosticul de stare septică bacteriană.
Spre deosebire de celelalte proteine de fază acută, cum sunt α1-antitripsina şi
haptoglobina, PCR nu este afectată de hormonii estrogeni sau de medicaţia
antiinflamatorie şi imunosupresivă.
Concentraţia de PCR este utilă şi în evaluarea clinică a evoluţiei unor
afecţiuni ca: artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic, colită inflamatorie
sau infarctul miocardic.
c. Proteina C reactivă de înaltă sensibilitate (High Sensitivity PCR -
hs-CRP)
Proteina C reactivă este considerată un marker de evaluare a pacienţilor
cu risc moderat de boală coronariană. Testul hs-CRP poate detecta concentraţii
mai mici ale proteinei, fiind mai sensibil decât testul standard de detectare a
PCR. Se ştie acum că inflamaţia joacă un rol important în ateroscleroză. Există
studii care au demonstrat că dozarea PCR prin metoda mai sensibilă de hs-CRP,
poate identifica riscul de boală coronariană la persoane aparent sănătoase. La
aceşti indivizi cu risc crescut, valorile sunt predictive pentru riscul de infarct
miocardic, accident vascular cerebral, moarte subită cardiacă şi boala arterelor
periferice, chiar la o concentraţie de colesterol aflată în limite acceptabile.
Grupe de risc pentru dezvoltarea bolii coronariene
● risc scăzut < 1,0 mg/dL
● risc moderat 1,0-3,0 mg/dL
● risc major > 3,0 mg/dL
d. Amiloidul seric A (ASA)
Amiloidul seric A (ASA) face parte dintr-o clasă de apolipoproteine
asociate cel mai frecvent cu lipoproteinele plasmatice cu densitate mare (HDL),
fiind exprimate diferit la diverşi indivizi ca răspuns la stimuli inflamatori. Deşi
sinteza primară are loc la nivelul ficatului, există şi alte ţesuturi care exprimă
ASA. Amiloidul seric A este legat de inflamaţie, apărarea antimicrobiană,
metabolismul HDL şi transportul colesterolului, şi a fost astfel implicat în mai
multe afecţiuni cum sunt ateroscleroza, artrita reumatoidă, boala Alzheimer şi
cancerul. Cel mai bine se cunoaşte rolul ASA în reacţia de fază acută ca răspuns
la un stimul inflamator, o leziune tisulară sau un traumatism. Concentraţia sa
poate să crească de până la 1000 de ori în cursul inflamaţiei acute.
IV. Procalcitonina (PCT) (VN < 0.5 ng/dl)
5
 Este un precursor al calcitoninei și nivelul seric crește în infecţii severe
de cauza bacteriană, fungică, parazitară şi în sepsis, fiind un bun un indicator al
gradului de inflamație sistemică. Etilogiile virale, alergice, autoimune, bolile
cronice sau infecțiile bacteriene limitate nu determină o creșterea PCT. Este
uitlă în diagnosticul diferențial al inflamațiilor bacteriene vs non-bacteriene,
detectarea precoce a complicațiilor septice (PCT devine detectabilă în 2-4 h) și
în monitorizarea pacienților cu infecții severe.
V. Radiofarmaceutice pentru marcat leucocite
1. Proceduri in vivo
În ziua de scanare, pacientul donează o probă de sânge integral și apoi
se izolează celulele albe. Cea de a doua parte a procedurii implică marcarea
leucocitelor izolate cu un produs radiofarmaceutic selectat.
99𝑚𝑇𝑐-HMPAO
111ln-oxină
99𝑚 𝑇𝑐-Tin Fluorul coloid

2. Moleculele de origine biologică (anticorpi)

LeukoScan și Scintimun, sunt produse utilizate pentru imagistica
infecțiilor/inflamațiilor din osul pacienților cu suspiciune de osteomielită și cu
ulcere ale piciorului diabetic. După injectarea intravenoasă, radioactivitatea se
acumulează la locul inflamator în următoarele 1-8 ore.
Nanocoll este un produs folosit pentru a prepara-99mTc albumină
nanocolloid, indicat pentru scanarea inflamației în alte zone decât abdomenul.

3. Molecule sintetice care marchează leucocite neutrofile

polimorfo-nucleare (PMN) și fagocitele mononucleare din focarul inflamator.

VI. Diagnosticul inflamațiilor cronice

În inflamațiile cronice trebuie evaluat procesul inflamator, etiologia și
complicațiile acestora.
De exemplu în artrita reumatoidă:
● pentru evaluarea procesului inflamator se determină VSH, PCR,
hemoleucograma (anemie hipocromă, leucocite normale/crescute –
scad în splenomegalie, trombocite crescute proporțional cu
severitatea afecțiunii);
● pentru etiologia autoimună se determină factorul reumatoid
(anticorpi anti regiunea Fc a IgG), anticorpi anti proteină citrulinată
(antiCCP)( pozitivă înainte de debutul clinic al bolii);
● analiza lichidului articular (pentru diagnosticul artritei septice) și a
altor organe afectate de complicații.

VII. Reacția Rivalta

Reacția Rivalta este un test care face diferența între exudat și transudat.
6
 Produsul testat poate fi recoltat din cavitățile seroase.
Soluția Rivalta este o soluție de acid acetic 2% care induce precipitarea
proteinelor atunci când ele constituie peste 3 g%, ca în cazul exudatului.
Mod de preparare: un cilindru cu 100ml soluție Rivalta + o picătură din
produsul recoltat = proteinele precipită ca un "nor de fum" în cazul în care
acesta este un exudat.

VIII. Testul de fagocitoză in vitro

După inducerea unei inflamații experimentale fagocitele sunt activate și
în contact cu un substrat adecvat vor fagocita și distruge substratul.
Mod de preparare:
• de la un animal cu inflamație experimentală indusă prin injectarea de
ulei de terebentină 0,6ml / 100g-greutate corporală în laba posterioară,
trebuie să fie recoltate probe de sânge pe o soluție anticoagulantă;
• se pun într-o eprubetă siliconată 100μl probă de sânge + 20μl
suspensie de E. coli, ca substrat pentru fagocitoză
• după 30 de minute de rotație lentă la 370C, din eșantion sunt pregătite
frotiuri care vor fi colorate May-Grünwald Giemsa;
• pe frotiuri sunt numărate 200 leucocite și se calculează doi indici:
procentul de leucocite care au fagocitat cel puțin un agent patologic (PI
= indicele de fagocitoză); numărul de bacterii fagocitate de 100
leucocite (PA = activitatea fagocitară).

Fig. 3.1. Frotiu de sânge de neutrofile de leucocite care prezintă

modificări morfologice asociate cu fagocitoza. Primele patru cadre arată
neutrofile nestimulate normale într-un fond de eritrocite. În partea de jos patru
cadre arată neutrofile fagocitând particule de zymosan opsonizate de
complement (C3bi). Cadrele de la stânga la dreapta arată progresia fagocitozei.

3. Febra experimentală
7
 Șobolani masculi se injecteazăt i.p. cu soluție pirogen 1 ml. După 45 de
minute se măsoară:
● ritmul cardiac
● rata respiratorie
● temperatura rectală
● numărul total de leucocite
● formula leucocitară.
În conformitate cu rezultatele la 45 min trebuie diagnosticat stadiul
febrei.