Analiza articolului științific

Realizată de: Beșliu (Căușac) Gabriela

1. Denumirea articolului, sursa

Hassan HS, Najam A, Parveen G, et al. O metodă optimizată de precipitare a IgG cu sulfat de
amoniu din plasmă hiperimună de cal pentru producția anti venin de șarpe. Int J Mol Biol
Open Access. 2020;5(4):166-169.
2. Scopul cercetării

Tratamentul de elecție pentru mușcătura de șarpe este administrarea de anticorpi IgG care sunt
crescuți într-un organism animal prin imunizarea temeinică a animalelor. Pentru a evita
potențialele reacții adverse care apar din introducerea antiserului animal în corpul uman,
anticorpul trebuie să fie purificat de alte proteine nespecifice, cum ar fi albumina. Au fost
studiate condiţiile optime pentru fracţionarea IgG; sulfat de amoniu a fost adăugat în plasmă
până la o concentrație de 40% pentru a separa proteinele nespecifice, separarea izoelectrică a fost
efectuată la pH 5,4 și fracționarea finală a IgG prin adăugarea de sulfat de amoniu până la o
concentrație de 50%. Un amestec foarte purificat și concentrat de IgG a fost obținut după
îndepărtarea sulfatului de amoniu prin dializă. Anti veninul rezultat a fost de bună calitate în
ceea ce privește puritatea și sa dovedit a fi foarte puternic împotriva veninurilor tuturor celor
patru tipuri de șerpi. Datorită purității ridicate și potenței mai mari a anti venin, metoda are
potențialul de a fi utilizată pentru producția de anti venin la scară comercială și de laborator.

3. Metode utilizate în cercetare

Colecția de venin
Studiul a fost aprobat de Institutional Ethical Review Board al National Institute of Health
Islamabad. Venin de șerpi „patru mari” Cobra ( Najanaja ), krait comun ( Bungarus caeruleus ),
vipera lui Russell ( Viperarusselii ), viperă cu solzi de ferăstrău ( Echiscarinatus ) au fost
colectate la Divizia de Producție Biologică, Institutul Național de Sănătate Islamabad, Pakistan.
Imunizarea cailor
Patru cai adulți mari de rasă locală au fost luați în vârstă de peste 5 ani. Fiecare cal a fost
imunizat separat cu preparatul lichid steril de venin de Cobra, Krait, Saw Scaled Viper și Russel
Viper. Imunizarea a fost începută cu 10 ug de venin de viperă Cobra & Russel, 5 ug de venin
pentru Echis și 1,0 ug de venin pentru Krait. Caii au fost hiperimunizați cu veninuri timp de trei
luni până la aproximativ 30 mg venin din fiecare șarpe. După terminarea imunizării, caii au fost
verificați pentru titrul de anticorpi. După care s-au extras un total de 10 litri de sânge de la
fiecare cal în două sângerări cu adăugarea de oxalat de potasiu ca anticoagulant. Plasma a fost
separată prin centrifugare și depozitată la 4-8 ° C.
Precipitarea sulfatului de amoniu
Soluția saturată de sulfat de amoniu a fost preparată cu o zi înainte de procesare. Alicotele de 50
ml de plasmă au fost diluate 50% cu WFI și apoi soluția de sulfat de amoniu a fost adăugată la o
concentrație de 20%, 30%, 40%, 50%, 60% și 70%. Filtratul și precipitatele au fost testate pentru
conținutul de albumină și globulină și a fost selectată o concentrație optimizată pentru separarea
proteinelor serice nespecifice cum ar fi albumina și a fost selectată a doua valoare a concentrației
pentru extracția proteinelor specifice, adică IgG. Aceste valori ale concentrației au fost apoi
utilizate pentru dezvoltarea procesului final.
Plasma a fost mai întâi diluată cu apă distilată. S-au adăugat pirofosfat de sodiu, toluen și clorură
de calciu la o concentrație de 2 g/L, 1,5 g/L și respectiv 0,04% (40 g/L) cu agitare continuă. Apoi
a fost adăugat sulfat de amoniu până la o concentraţie de 40% şi amestecul a fost filtrat. Apoi
pH-ul soluției a fost ridicat la 5,4 și agitat bine la 30 oC la temperatura camerei timp de o
jumătate de oră. Precipitatul a fost aruncat şi sulfat de amoniu a fost adăugat din nou până la o
concentraţie de 50% în filtrat şi apoi filtrat. Filtratul a fost aruncat şi precipitatul a fost
separat. Precipitatul a fost dializat printr-o membrană de dializă pentru a îndepărta sulfatul de
amoniu rămas. Îndepărtarea sulfatului de amoniu a fost confirmată prin testul cu clorură de
bariu. pH-ul amestecului a fost apoi crescut la 7,00. Acest amestec conține imunoglobuline
necesare (IgG). Amestecul este stocat la 4-8 ° C și potența amestecului a fost verificată
în conformitate cu LD 50 și 2DAV 50 și diluțiile ulterioare ale anti-venin au fost făcute în
mod corespunzător.
Verificați pentru îndepărtarea sulfatului de amoniu
Testul cu clorură de bariu este utilizat pentru detectarea eliminării sulfatului de amoniu. Se
prepară o soluție de clorură de bariu 5% și se adaugă 1 ml din aceasta la 1 ml de
dializat. Prezența turbidității va indica prezența sulfatului de amoniu, în timp ce o soluție
limpede indică faptul că sulfatul de amoniu este îndepărtat.
Verificarea potenței
Potența amestecul a fost verificat împotriva LD 50 și 2DAV 50 de „patru mari“ șerpi calculate de
Parveen et al. Au fost luați șoareci masculi sănătoși cu o greutate de 18-20 g și s-au amestecat cu
veninul anti-șarpe o diluție de 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 și 1:50 ori pentru a verifica potența de
neutralizare a veninul anti-șarpe. O doză de 0,5 ml de amestec de venin și anti venin a fost
injectată pe cale intracaudală. Rezultatul a fost verificat după 24 de ore ca mortalitate și rata de
supraviețuire a șoarecilor. Veninul anti-șarpe a fost apoi diluat cu soluție salină normală în
funcție de rezultatele potenței.
Estimarea proteinelor totale și a albuminei
În final, serul anti-venin diluat a fost verificat pentru estimarea conținutului de proteine totale,
albumină, globuline și azot. Albumina este estimată prin trusa „albumină spectrală-BCG (tampon
acetat) iar proteinele totale au fost estimate prin trusa „reactiv biuret proteic total de spectru”.

4. Rezultate inovative obținute

Prelucrarea cu plasmă

Caii au cantități diferite de plasmă în sânge. Aproximativ 5 litri de plasmă au fost obținuți din
sânge integral de 10 litri folosind oxalat de potasiu ca anticoagulant. Adăugarea de sulfat de
amoniu până la o concentrație de 40% transformă soluția lăptoasă, ceea ce este un indiciu al
precipitării proteinelor. Prin filtrare rezultă precipitate albe de proteine nespecifice și o soluție
limpede care conține proteinele specifice. După a doua adăugare de sulfat de amoniu,
concentrația de sulfat de amoniu determină precipitarea proteinelor specifice (IgG). Precipitatele
au fost filtrate pentru a separa IgG pure și filtrate. În plus, pH-ul 5,4 la etapa isoelectrică
provoacă, de asemenea, precipitarea proteinei nespecifice. Sulfatul de amoniu rezidual a fost
îndepărtat în etapa de dializă. Îndepărtarea sulfatului de amoniu a fost confirmată prin testul cu
clorură de bariu. După dializă, precipitatul se transformă într-o soluție groasă de negru gri care
este produsul final.

Găsirea valorilor optime de concentrație

Tabelul 1 arată concentrația de albumină, globuline și conținutul total de proteine ale

precipitatelor la diferite concentrații de soluție. Rezultatele indică clar că albumina este cel mai
bine precipitată la concentrația de 40% și globulinele sunt cel mai bine precipitate la concentrația
de 50%. Deci, concentrația de 40% de sulfat de amoniu în soluție de plasmă a fost aleasă pentru
a precipita proteinele nespecifice de albumină și concentrația de 50% a fost aleasă pentru a
precipita IgG din plasma hiperimunizată de cal.

Concentrație (%) Concentrația de Concentrația globulinei Proteine totale

 albumină (g/dl) (g/dl) (g/dl)
20 4.2 0,31 8.5
30 5.7 0,54 8.7
40 7.2 0,97 8.5
50 2.9 2.44 8.5
60 2.6 2.1 8.6
70 2.5 1,93 8.5
Tabelul 1 Concentrația conținutului de albumină, globuline și proteine totale la diferite
concentrații de soluție de sulfat de amoniu
Testul de putere al antiveninului

IgG fracționate au fost supuse testării pe animale pentru testul de potență al antiserurilor.

Tabelul 2 prezintă rezultatele diferitelor diluții de ser venin anti-șarpe împotriva provocarea de
doze 2LD 50 din fiecare venin. Anti-venin a fost puternic pentru a neutraliza 2LD 50 până la 50
de ori diluare. S-a observat neutralizarea completă până la diluția de 40 de ori. Deci, anti-veninul
a fost diluat de 40 de ori pentru a observa rezultatele produsului final.

Diluarea Șoareci venin de cobraVenin de viperă a lui Saw venin de viperă venin de krait
probei anti injectaț (% Russel (% cu solzi (% (%
venin i mortalitate) mortalitate) mortalitate) mortalitate)
01:10 4 0 0 0 0
01:20 4 0 0 0 0
01:30 4 0 0 0 0
01:40 4 0 0 0 0
01:50 4 25 50 25 50
+ve control
4 50 50 50 50
LD 50
+ve control
4 100 100 100 100
2LD 50
-ve control
4 0 0 0 0
(PBS)
Tabelul 2 Rezultatele testelor de potență ale anti venin pe șoareci
Conținutul de albumină, globulină și proteine totale al produsului final

Tabelul 3 prezintă conținutul total de proteine, albumină și globulină din serul anti-venin de
șarpe diluat în final, care este fracționat cu procedura de precipitare a sulfatului de amoniu
menționată mai sus.

Test Rezultate
Proteine totale 2,81
Albumină 0,284
Azot 0,449
Globulina 2.503
Tabelul 3 Conținutul total de proteine, albumină, globulină, proteine totale și azot (g/dl) în
produsul final

5. Utilitatea articolului
Datorită acestui articol am aflat despre posibilitatea plasmei animalelor și utilitatea lor . Pentru a
salva viața oamenilor afectați de veninul unui șarpe a fost descoperită această metodă . Evident
pentru Republica Moldova unde nu sunt șarpi veninoși această metodă nu pare a fi atît de utilă ,
dar în țările din Europa și Australia unde sunt răspîndite aceste reptile e necesară.