LP. 5.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIEI

I. OBIECTIVE

1. Să cunoască metodele de diagnostic direct, avantajele şi dezavantajele acestor

metode.
2. Să ştie regulile de prelevare ale probelor destinate examenului microbiologic.
3. Să ştie criteriile de semificaţie clinică ale izolatelor bacteriene.
4. Să cunoască indicaţiile diagnosticului indirect, metodele de diagnostic indirect cu
avantajele şi dezavantajele lor.
5. Să ştie criteriile de semificaţie clinică ale anticorpilor serici.

II. DEFINIŢII

Diagnostic: diferenţierea realizată de medic între boli sugerate de simptomele şi semnele

clinice prezentate de un pacient: analiză prin asemănări şi diferenţe caracteristice.
Diagnostic etiologic: depistarea şi identificarea cauzei care a determinat infecţia.
Confirmă sau infirmă diagnosticul clinic (diagnostic prezumtiv).
Infecţie: interacţiunea dintre un microb patogen (care pătrunde în organismul gazdei, se
multiplică, invadează gazda şi îi lezează structurile) şi gazdă, care răspunde la agresiunea
microbiană prin răspuns nespecific (inflamaţie, etc.) şi prin răspuns imun (specific). Este
vizibilă această interacţiune?
Boală infecţioasă: apare atunci când, din cauza leziunilor importante, gazda nu îşi mai
poate menţine homeostazia şi apar simptome şi semne de suferinţă.

III.DIAGNOSTIC DE LABORATOR – METODE DIRECTE (urmăresc

depistarea şi identificarea microbului infectant = examen microbiologic)
= Diagnosticul microbiologic
– presupun observarea, izolarea şi identificarea până la nivele de semnificaţie clinică
(gen, specie, antibiotip, markeri de patogenitate) sau epidemiologică (markeri
epidemiologici).
– examinăm prelevate din cele mai variate zone ale organismului (fiecare are o condiţie
microbiologică naturală) şi urmărim o diversitate de microorganisme
– rezultatele metodelor directe depind de calitatea prelevatelor examinate, eficienţa
diagnostică a testelor utilizate, dar şi de schimbul de informaţii dintre clinician-
microbiolog.
A. Reguli generale pentru prelevarea probelor destinate examenului microbiologic:
- Aseptic (cu instrumente şi în recipiente sterile)
- Înaintea instituirii tratamentului antibiotic
- Realul produs patologic; unde caut microorganismul infectant?
- În cantitate suficientă
- Tehnici de prelevare corespunzătoare
- Condiţii corespunzătoare de transport şi conservare

1
B. EFICIENŢA DIAGNOSTICĂ A TESTELOR UTILIZATE

TEHNICI RAPIDE:
1. MICROSCOPIA DIRECTĂ – pe frotiuri (colorate cu albastru de metilen sau
Gram sau Ziehl-Neelsen) permite să observăm categoria microscopică a microbului
infectant (pe baza caracterelor morfotinctoriale), numărul lor, raporturile cu celulele
inflamatorii şi celulele epiteliale scuamoase, caracterele reacţiei inflamatorii şi realizează
triajul de calitate a probelor
Avantaje: rapid, uşor de realizat, ieftin, poate orienta antibioticoterapia de primă
intenţie,
Dezavantaje: sensibilitate scăzută (pentru a vedea 1-2 bacterii/câmp microscopic cu
puterea de mărire de 1000x, trebuie să existe 10 4-105 UFC/mL probă), dar şi
specificitate scăzută
2. DEPISTAREA ANTIGENELOR MICROBIENE – direct în produsul patologic
prin reacţii antigen-anticorp folosind seruri cu anticorpi cunoscuţi.
Avantaje: rapid, sensibilitate mai bună vs sensibilitate microscopie (detecţie de
antigene dacă există 103-104 UFC/mL probă), specificitate crescută (identifică specia)
Dezavantaje: mai scumpă decât microscopia, nu toate microorganismele au antigene
specifice
3. DETECŢIE DE SECVENŢE SPECIFICE DE ADN/ARN prin
metode ale biologiei moleculare – hibridizare, amplificare genică (PCR)
Avantaje: rapid, sensibilitate – cele mai sensibile (mai ales PCR – poate detecta
chiar 10-20 copii de virus), specificitate maximă (identifică specia)
Dezavantaje: metode scumpe, personal special calificat în utilizarea acestor metode,
nu toate secvenţele detectate provin de la microorganisme viabile, nu poate preciza
sensibilitatea la antibiotice

CULTIVAREA (izolarea microorganismului infectant în cultură pură) = tehnica de

referinţă (gold standard) pentru diagnosticul etiologic al infecţiilor
Avantaje: permite identificarea speciei (caractere microscopice, caractere de
cultură, caractere biochimice, caractere antigenice, caractere genetice – vezi LP 4) şi
testarea sensibilităţii la antibiotice (vezi LP 4).
Dezavantaj: timpul necesar pentru izolarea bacteriilor (minim 24 ore)

C. SEMNIFICAŢIA CLINICĂ A IZOLATELOR – stabilită în funcţie de

patogenitatea microbului izolat, condiţia microbiologică a prelevatelor
(necontaminate – provin din zone normal sterile și izolarea unui microorganism din
aceste prelevate are semnificație clinică; contaminate pe traiectele de eliminare: dacă
izolatul nu face parte din microbiota indigenă a traiectelor de contaminare are
semnificație clinică; semnificația clinică a unor izolate care contaminează uzual aceste
prelevate o argumentăm prin criteriul izolării cantitative și criteriul asociației
semnificative cu celulele inflamatorii, contaminate in situ – provin din zone normal
colonizate și semnificație clinică au izolatele patogene) şi contextul clinic.

2
IV. DIAGNOSTIC DE LABORATOR – METODE INDIRECTE

A. METODELE INDIRECTE pot fi nespecifice şi specifice:

Nespecifice: teste hematologice (leucograma cu formula leucocitară, viteza de

sedimentare a hematiilor) şi teste pentru cuantificarea reactivilor de fază acută
(fibrinogen, proteina C reactivă-CRP, procalcitonina)
Avantaje: rapid, sensibilitate crescută
Dezavantaje: nespecific

Specifice: depistarea şi cuantificarea efectorilor imunitari induşi de infecţie.

1. teste in vitro (diagnostic serologic/seroimunologic) = detectează răspunsul
umoral (anticorpii serici).
Titrul (cantitatea) anticorpilor din ser: reprezintă inversul celei mai mari diluţii
de ser la care mai este încă vizibilă formarea de complexe antigen-anticorp, între o
cantitate constantă şi cunoscută de antigen introdusă în reacţie şi anticorpul omolog
prezent în serul pacientului
2. teste in vivo (intradermoreacţii) = detectează răspunsul imun celular – limfocite
T citotoxice specific sensibilizate

Indicaţii (şi în acealeaşi timp avantaje): microbul infectant este situat intr-un situs
inabordabil; microorganisme necultivabile sau pentru cultivarea cărora nu sunt condiţii
(virusuri, chlamidii, rickettsii); tratamente antibiotice administrate înaintea prelevării,
dubii asupra semnificaţiei clinice a unor izolate.
Dezavantaje: capacitatea pacientului de a elabora un răspuns imun, intervalul de
minimum 10 – 14 zile până la apariţia anticorpilor în cantitate decelabilă.

B. SEMNIFICAŢIA CLINICĂ A EFECTORILOR IMUNITARI

1. Serodiagnostic – criterii de semnificaţie a anticorpilor depistaţi în ser
Sunt necesare 2 probe de ser: prima probă (serul acut) trebuie recoltată cat mai aproape
de debutul bolii, a doua probă (serul convalescent) se recoltează la 1-3 săptămâni după
prima probă; ambele probe trebuie testate concomitent.
- pe 2 probe de ser avem două criterii de semnificaţie:
Seroconversia = absenţa anticorpilor în prima probă şi apariţia lor în cea de a doua
probă.
Dinamica semnificativă = creşterea de cel puţin 4 ori a titrului anticorpilor în a
doua probă de ser faţă de prima probă.

- pe 1 probă de ser – o probă prelevată tardiv (nu mai avem serul de la debut) avem alte
două criterii:
Titrul semnificativ = dacă titrul anticorpilor depăşeşte o anumită valoare
considerată prag. (ex. ASLO > 200, anticorpi anti-Salmonella Typhi > 400)
Detectarea anticorpilor IgM = anticorpii de tip IgM sunt anticorpii răspunsului
imun primar care dispar după 2-3 luni, fiind înlocuiţi de cei de tip IgG cu aceeaşi
specificitate.

3
2. Intradermoreacţiile
Sunt reacţii in vivo şi constau in injectarea intradermică a antigenului purificat pentru a
surprinde mobilizarea la locul injectării a limfocitelor specific sensibilizate la antigenul
respectiv, cu apariţia unei reacţii locale (edem şi induraţie).
Depistează sensibilizarea de tip întârziat – în infecţii cu microorganisme facultativ
intracelulare (e.g. Mycobacterium). Sensibilizarea de tip întârziat apare după aproximativ
4 săptămâni de la debutul infecţiei.

IV. REACŢII ANTIGEN-ANTICORP. TIPURI DE REACŢII ANTIGEN-

ANTICORP

Microorganismele conţin proteine şi carbohidraţi specifici pentru o anumită specie sau

grup de organisme din cadrul speciei. Teoretic, chimiştii pot diferenţia aceste
specificităţi, dar cu consum mare de timp şi cost enorm. Din fericire, aceleaşi informaţii
sunt obţinute mai simplu, prin reacţii antigen-anticorp.
Proteinele şi carbohidraţii de specificitate ai microorganismelor sunt antigene dacă:
injectate în organismul unui animal induc formarea de anticorpi şi reacţionează specific
cu anticorpii formaţi.

Definiţie reacţii antigen-anticorp: sunt reacţii in vitro bazate pe

proprietatea unui antigen de a reacţiona specific cu anticorpul omolog şi
de a forma complexe antigen-anticorp.
Reacţiile antigen-anticorp sunt reacţii specifice şi reversibile.
Pentru a identifica antigenul (diagnostic direct) se folosesc seruri
hiperimune (conţin anticorpi cunoscuţi, specifici pentru antigenele
bacteriene căutate).
Indicaţii: detecţie de antigene direct în produsul patologic sau în cultură.
Pentru a depista şi identifica anticorpul (diagnostic indirect) se
utilizează antigene cunoscute, specifice pentru anticorpul căutat.
Indicaţii: detecţie de anticorpi în ser
Tipuri de reacţii antigen-anticorp: după modul în care se formează aceste
complexe antigen-anticorp există mai multe tipuri de reacţii: reacţii de
precipitare, reacţii de aglutinare, reacţia de fixare a complementului,
reacţii cu elemente marcate (imunoenzimatice – EIA, RIBA, WB,
imunofluorescenţă IF (directă şi indirectă), radioimunodozare – RIA-
Radio Imunoassay)