Lucrare practică 5

Reacţiile antigen-anticorp şi tehnicile de biologie moleculară în laboratorul de

microbiologie

Obiective:
La sfârşitul acestei lucrări practice studenţii trebuie:
1. să cunoască noţiunile de antigen şi anticorp, zona de echivalenţă, fenomen de prozonă şi
aplicaţiile practice ale reacţiilor antigen-anticorp;
2. să cunoască principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp utilizate în laboratorul de
microbiologie (clasificare, principiu, indicaţii, exemple);
3. să cunoască noţiuni legate de tehnicile de biologie moleculară, ca instrument modern de
diagnostic;
1. Antigen  substanţă străină care, pătrunsă într-un organism competent, determină răspuns
imun (imunogenitate) şi reacţionează specific cu efectorii imunitari apăruţi ca rezultat al acestui
răspuns (specificitate).
Anticorp  imunoglobulină produsă în organism sub acţiunea unui antigen şi care are
proprietatea de a reacţiona specific cu antigenul corespondent.
Legarea antigen-anticorp:
- necesită complementaritatea situsurilor de legare Ag-Ac
- este specifică şi reversibilă
- este stabilă în zona de echivalenţă (cantităţile celor doi reactivi sunt aproximativ egale).
Fenomen de prozonă = absenţa reacţiei în prezenţa unui exces de anticorpi  rezultat fals negativ.
Aplicaţiile practice ale reacţiei antigen-anticorp
- identificarea unui antigen necunoscut (în produse patologice sau tulpini izolate în laborator)
prin anticorpul omolog prezent în seruri imune de referinţă);
- identificarea unui anticorp necunoscut (în serul pacientului) prin antigenul omolog
(diagnostic serologic).
 Se pot obţine:
- relaţii calitative  identificarea unui reactiv
- relaţii cantitative  determinarea titrului reactivului cercetat
Titru  inversul diluţiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibilă reacţia, dacă se utilizează
cantităţi constante şi definite ale reactivului omolog.
Pentru titrul Ac-lor din ser, prin reactiv se înţelege, ser, iar prin reactiv omolog, antigenul cunoscut.

2. Principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp

A. Reacţiile de precipitare
Principiu: un antigen solubil formează cu anticorpul omolog un complex insolubil (precipitat).
Clasificare după mediul în care se desfăşoară reacţia:
a. Reacţii în mediu lichid
b. Reacţii în mediu gelificat - ex. imunodifuzia radială dublă (testul Elek → demonstrarea
toxigenezei bacilului difteric).

B. Reacţiile de aglutinare
Principiu  cuplarea unui antigen în suspensie cu anticorpul omolog determină apariţia unui
aglutinat sub formă de mase vizibile, care se depun şi lasă supernatantul limpede.
Clasificare după modul de prezentare a antigenului în reacţie:
a. Reacţii de aglutinare directă
 Calitative  reacţii de aglutinare pe lamă → identificarea unui antigen bacterian
 Cantitative  reacţii de aglutinare în tuburi
→ confirmarea rezultatelor aglutinării pe lamă
→ cuantificarea Ac-lor în serul pacienţilor (reacţia Widal - diagnosticul febrelor enterice)
b. Testul Coombs: utilizat pentru evidenţierea Ac anti-eritrocitari
c. Reacţii de aglutinare pasivă  antigen bacterian adsorbit pe suprafaţa unor particule (hematii
 reacţia de hemaglutinare)
d. Reacţia de latexaglutinare = anticorpi specifici fixaţi pe suprafaţa particulelor de latex →
identificarea antigenelor direct în prelevate patologice.
e. Reacţia de coaglutinare  anticorpul este fixat prin fragmentul Fc pe proteina A din structura
S. aureus.

C. Reacţia de fixare a complementului

Principiu  este o reacţie Ag-Ac, în două etape, în care două complexe Ag-Ac îşi dispută aceeaşi
cantitate de complement. Cel de-al doilea complex Ag-Ac este sistem indicator pentru vizualizarea
formării primului complex.
- Utilizată pentru evidenţierea anticorpilor antivirus gripal

D. Reacţiile de neutralizare
Principiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a căror legare de receptori celulari este
urmată de efecte definite
= după reacţia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe receptorii
celulari, deci sunt neutralizate.
Clasificare:
 Neutralizări = supravieţuirea animalelor receptive după injectarea amestecului imunoser-virus
/ toxină.
 Reacţii de inhibare a hemaglutinării → identificarea virusurilor hemaglutinante
→ serodiagnosticul infecţiilor determinate de virusuri
hemaglutinante

hemaglutinine  hematii  hemaglutinare (reacţie )

hemaglutinine  Ac omologi  hematii  sedimentare (reacţie )

E. Reacţiile cu reactivi marcaţi:

 Imunocromatografia – utilizează conjugate marcate cu aur coloidal şi este o metodă calitativă
de evidenţiere fie a antigenelor, fie a anticorpilor prezenţi în proba care migrează prin
capilaritate pe o membrană de nitroceluloză.
 Imunofluorescenţa - utilizează molecule marcate cu fluorocromi (fluoresceină, rodamină)
- directă = foloseşte anticorpi marcaţi cu fluorocromi, specifici pentru detecţia antigen
- indirectă = foloseşte anticorpi anti-imunoglobuline umane marcaţi fluorescent -identifică
anticorpi şi antigene
- reacţia este vizualizată la microscop cu fluorescenţă sau prin flow-citometrie.
 Reacţiile imunoenzimatice (Enzyme Immunoassay-EIA)
Principiu: sunt reacţii Ag-Ac care pentru vizualizarea complexului folosesc marcajul enzimatic,
cuplat la un element (Ac sau Ag) cunoscut (conjugatul). După formarea complexului Ag-Ac şi
îndepărtarea reactivului necuplat, pentru estimarea activităţii enzimatice, se adaugă substratul
cromogen al enzimei → reacţia de culoare dezvoltată este apreciată vizual sau spectrofotometric.

A. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

a. pentru detectarea antigenului – direct

Ac specific adsorbit pe suport insolubil  proba în care urmărim Ag  Ac marcat cu enzimă

b. pentru detectarea anticorpilor – indirect

Ag adsorbit pe suport insolubil  ser în care urmărim Ac anti-Ag  Ac anti-Ig marcat cu enzimă

c. competitiv – Ag adsorbit pe suport + ser în care urmărim Ac anti-Ag introdus în reacţie în acelaşi
timp cu Ac de referinţă marcat cu enzimă

B. Immunoblotting (Western blot) – confirmarea infecţiei HIV

antigene diferite fixate pe benzi de nitroceluloză  proba de ser testată (Ac)

spălare

 Ac anti-Ig umană marcati enzimatic

spălare

Reacţie colorimetrică

C. RIBA (Recombinant immunobinding assay) – principial asemănător cu WB, dar utilizează

antigene obţinute prin recombinare; pentru evidenţierea anticorpilor antivirus hepatită C.

3. Tehnicile de biologie moleculară

- studiază genomul independent de cultivare si sunt utilizate pentru identificarea rapidă a
microorganismelor direct în produsul patologic, detecţia genelor de rezistenţă, genotipare.
A) Hibridarea cu sonde ADN complementare secvenţei nucleotidice cercetate (southern blots/
northern blots). Detecţia sondei în hibrid se face cu ajutorul moleculelor reporter.
B) Reacţia de polimerizare în lanţ (polymerase chain reaction-PCR) - constă în amplificarea
unei secvenţe de ADN ţintă cu ajutorul unor primeri, a unei polimeraze şi a unor amorse.
Ampliconul rezultat este apoi evidenţiat prin electroforeză în gel.
PCR pentru evidenţierea ARN necesită o etapă intermediară de revers transcriere a ARN în ADNc
înainte de amplificare (Reverse Transcriptase – PCR sau RT-PCR).
PCR în timp real (qRT–PCR sau Real Time PCR) permite evidenţierea şi cuantificarea acidului
nucleic amplificat pe măsură ce are loc amplificarea.
C) Secvenţierea ADN – determină ordinea în care sunt aşezate bazele azotate în secvenţa
nucleotidică. Tehnica utilizează enzime de restricţie şi detecţie prin electroforeză capilară a
fragmentelor sintetizate.
4. Calitatea prelevatelor pentru examenul microbiologic
prelevate de bună calitate – rezultate utile posibile;
prelevate de calitate proastă – rezultate proste, periculoase pentru bolnavi, bani risipiţi
a. alegerea prelevatelor şi momentul prelevării;
b. prelevarea probelor înainte de instituirea tratamentului antimicrobian;
c. prelevatele patologice trebuie să fie în cantitate suficientă;
d. prelevările trebuie făcute aseptic;
e. recipientele şi instrumentele indicate pentru prelevări trebuie să fie adecvate scopului
propus;
f. transportul şi conservarea probelor – trebuie să prezerve condiția inițială a produsului
patologic și viabilitatea microorganismului infectant;
g. buletinul de analiză – cererea de analiză .

5. Metodele microbiologiei clinice

a. metode directe – evidenţiază prezenţa agentului etiologic

 tehnici rapide:
I. examen microscopic direct:
1. controlul microscopic al calităţii prelevatelor contaminate (calcularea scorului de
calitate);
2. tipul reacţiei inflamatorii (frotiu din produs patologic colorat cu albastru de metilen);
3. bacterioscopia (informaţii cantitative şi calitative).
II. reacţii Ag-Ac pentru depistarea antigenelor microbiene în produsul patologic;
III. metode ale biologiei moleculare pentru detecţia acizilor nucleici.

 izolarea microorganismului infectant: semnificaţia clinică a izolatelor:

1. în cazul prelevatelor necontaminate, microorganismul izolat este cel care a determinat
boala;
2. în cazul prelevatelor contaminate pe traiectul de eliminare:
- microorganismul izolat nu aparţine microbiotei indigene a traiectului de eliminare,
atunci are semnificaţie clinică;
- microorganismul izolat aparţine microbiotei indigene a traiectului de eliminare, atunci
va avea semnificaţie clinică în funcţie de 2 criterii : cantitate semnificativă şi asocierea
semnificativă a prezenţei microorganismului cu prezenţa celulelor inflamatorii;
3. în cazul prelevatelor din zone normal colonizate:
- se urmăresc numai microorganismele strict patogene care au întotdeauna semnificatie
clinică;
- pentru microorganismele condiţionat patogene implicarea etiologică se stabieşte prin: -
evidenţierea fenotipurilor patogene ale unor bacterii;
-autoserodiagnostic.

b. metode indirecte – evidenţiază prezenţa răspunsului imun

 nespecifice: leucograma, formula leucocitară, VSH, CRP;
 specifice:
Indicaţii: - agent etiologic în situs inaccesibil prelevării;
 - agent etiologic necultivabil;
- izolare imposibilă prin lacune ale anchetei epidemiologice;
- îndoieli privind semnificaţia clinică a izolatelor.
Dezavantaje: - rezultatele depind de capacitatea pacientului de a dezvolta răspuns imun;
-necesită un anumit timp pentru apariţia Ac.

Metode indirecte specifice:

A. in vitro
1. diagnostic serologic - criterii de semnificaţie clinică a anticorpilor izolaţi;
2. testul de detectare a producției de interferon gamma (IGRA) pentru diagnosticul tuberculozei
latente.
B. in vivo - intradermoreacţii.

Diagnosticul serologic  urmărirea răspunsului imun al pacienţilor la antigene ale

microorganismului infectant prin teste in vitro.
Criteriile de diagnostic serologic al unei infecţii acute:
a. pe două probe de ser prelevate în dinamică (serul I / acut şi serul II / de convalescent,
recoltate la interval de 10-14 zile)
 seroconversia  absenţa anticorpilor în prima probă şi apariţia lor în cea de a doua.
 dinamica semnificativă  creşterea de cel puţin patru ori a titrului anticorpilor în a doua
probă de ser faţă de prima.
b. pe o singură probă de ser
 titrul semnificativ
 dozarea anticorpilor IgM (anticorpii răspunsului imun primar)
i. diagnosticul unei infecţii acute/ recente
ii. diagnosticul precoce al unor infecţii congenitale

Testul de detectarea a producției de interferon gamma (IGRA) pentru diagnosticul

tuberculozei latente.
Principiu: evidențiază producerea de gamma interferon de către limfocitele T efectorii, ca răspuns
la stimularea de către proteinele micobacteriene specifice pentru complexul Mycobaterium
tuberculosis.
Indicaţiile testului: poate fi folosit în toate situaţiile în care este utilizat în mod obişnuit testul la
tuberculină:
 suspiciune clinică şi radiologică de tuberculoză activă;
 contacţii pacienţilor cu forme contagioase de TBC;
 screening-ul persoanelor cu risc crescut: personalul din unităţi sanitare și instituţii de
îngrijire, persoane provenite din medii cu igienă deficitară.

Intradermoreacţiile
iii. reacţii de sensibilizare - sensibilitatea de tip întârzâiat apare în infecții cu microorganisme
facultativ intracelulare. Sensibilitatea de tip întârzâiat apare după cca 4 săptămâni de la
debutul infecției și persistă pe toată durata evoluției infecției latente sau cronice.
 iv. reacții de neutralizare – intradermoreacția Schick prin care se urmărește receptivitatea la
difterie.

Bibliografie :
D. Buiuc. Microbiologie medicala, 2003, pg. 80-83, 356 – 372.