UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ BUCUREŞTI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA MASTER
BIOTEHNOLOGII IN PROTECŢIA MEDIULUI

LUCRARE DE DISERTAŢIE
STUDII PRIVIND INFLUENŢA
PRETRATAMENTELOR ASUPRA HIDROLIZEI
UNOR MATERIALE LIGNOCELULOZICE
UTILIZATE IN PRODUCEREA DE BIOALCOOL

ÎNDRUMĂTOR:
LECTOR .UNIV. DR. VIȘAN LUMINIȚA

ABSOLVENT:
DODOI PAULA

BUCUREŞTI
IULIE, 2015
 REZUMAT

Lucrarea de Disertaţie cu titlul “Studii privind influenţa pretratamentelor asupra

hidrolizei unor materiale lignocelulozice utilizate în producerea de bioalcool” s-a realizat în
cadrul Laboratorului de Biotehnologii Fermentative al Facultăţii de Biotehnologii.
Pentru realizarea cercetărilor au fost utilizate materiale, ca: enzima Lacaza, provenită din
Trametes versicolor (ciupercă lignivoră, care se hrăneşte cu lemn umed şi care este vector al
putregaiului alb), achiziţionată de la firma SIGMA-ALDRICH ®; Complex enzimatic
VISCOFLOW MG, care conţine conţine beta-glucanaze, xilanaze, arabino-xilanaze, pentozanaze,
celulaze şi hemicelulaze, achiziţionat de la Grama Trading (Sibiu, România), obţinut prin
fermentare submersă de catre specii selectate de Aspergillus aculeatus, Humicola şi Bacillus;
Saccharomyces cerevisiae, o suşă de drojdie aparţinând Colecţiei Laboratorului de
Microbiologie a Facultăţii de Biotehnologii.
In cercetări s-au utilizat ca materiale lignocelulozece: coceni de porumb şi paie de grâu.
Pretratamentele aplicate acestor materiale au fost: pretratamentul fizic (de mărunţire a
materialelor), tratamentul termic, tratamentul chimic, realizat în 2 variante: un tratament alcalin,
cu NaOH şi un tratament acid, cu acid fosforic; pretratament enzimatic cu lacază. Aceste
tratamente au avut un rol de pregătire şi disponibilizare a poliglucidelor (lignină, celuloză,
hemiceluloză) pentru hidroliza, realizată cu un preparat enzimatic complex, cu mai multe enzime
(beta-glucanaze, xilanaze, arabino-xilanaze etc).
Rezultatele cercetărilor au arătat influenţa pozitivă pe care au avut-o aceste pretratamente
asupra hidrolizei şi deci a creşterii conţinutului în glucide reducătoare, în special tratamentul
chimic cu acid şi tratamentul cu lacază.
Dintre cele 2 variante de materiale lignocelulozice luate în studiu, deşi la început cocenii
de porumb au reacţionat mai bine la tratamentul termic, totuşi paiele de grâu au avut cea mai
bună hidroliză şi cea mai bună evoluţie a conţinutului de zaharuri fermentescibile.

2
 CUPRINS

REZUMAT ……………………………………………………………………...……………….2

INTRODUCERE………………………………………………....................................................4

CAPITOLUL I. ASPECTE PRIVIND PRODUCŢIA DE BIOCOMBUSTIBILI.............….5

1.1.BIOCOMBUSTIBILII. CLASIFICARE, GENERALITĂŢI……………………………..5
1.2.BIOETANOLUL, PRINCIPALUL BIOCOMBUSTIBIL...................................................8
1.3.PRODUCŢIA DE BIOCOMBUSTIBILI IN PRINCIPALELE ŢĂRI ALE LUMII......11
1.4.PRODUCŢIA DE BIOCOMBUSTIBILI IN ROMÂNIA..................................................14
1.5.MATERII PRIME FOLOSITE LA FABRICAREA BIOALCOOLULUI……………..17
1.6 ENZIME LIGNOCELULOZOLITICE..............................................................................27

CAPITOLUL II. MATERIALE ŞI METODE DE LUCRU....................................................32

2.1. MATERIALE UTILIZATE.................................................................................................32
2.2. METODE DE LUCRU..........................................................................................................34
2.3ANALIZE REALIZATE........................................................................................................37

CAPITOLUL III. REZULTATE ŞI DISCUŢII………………….……………...…………...41

CONCLUZII................................................................................................................................53

BIBLIOGRAFIE..........................................................................................................................56

3
 INTRODUCERE

Criza mondială de energie a condus, în ultimii ani cel puţin, la căutarea de metode de a
obţine combustibili “pe cale naturală”. Astfel, soluţia cea mai bună o reprezintă înlocuirea
combustibililor convenţionali, fosili cu combustibili obţinuţi din surse regenerabile.
Aceşti combustibili se numesc biocombustibili şi în multe ţări ale lumii, inclusiv în
Uniunea Europeană s-a început procesul de substituire treptată a combustibililor convenţionali cu
acest nou tip de carburant.
Biocombustibilii se obţin din biomasă, numită “sursă regenerabilă”, care reprezintă orice
materie primă care poate fi refăcută permanent. O sursă permanentă de materie energetică o
reprezintă plantele care conţin glucide simple (zaharuri fermentescibile) sau poliglucide (zaharuri
care necesită hidroliză) care înmagazinează energie.
Dintre plantele cele mai des utilizate în producerea de biocombustibili, în special în ţări
ca SUA, se numără cerealele, în special porumbul. Amidonul conţinut de aceste cereale poate fi
transformat cu ajutorul enzimelor în glucoză (zaharuri reducătoare), care poate fi fermentată cu
ajutorul microorganismelor în etanol. Aceasta este deci, o altă modalitate de a exploata energia
înmagazinată în porumb, şi anume transformarea ei în etanol, care poate fi amestecat cu benzina
şi ars în motoare.
Pe lângă porumb, se mai folosesc şi alte produse vegetale pentru obţinerea de
biocombustibili: sfecla de zahăr, soia, rapiţa, sau chiar uleiurile rezultate de la restaurante după
prăjirea alimentelor. Grăsimile animale reprezintă o altă sursă regenerabilă de biocombustibili.
Aceste materii amidonoase, surse de biocombustibili au devenit şi surse de mari
controverse, mulţi oameni fiind de acors că cerealele, inclusiv porumbul poate reprezenta sursă
de hrană, mai ales către ţări care şi astăzi au probleme legate de hrană şi procurarea ei.
De aceea, biocombustibilii de primă generaţie trebuie înlocuiţi cu biocombustibili
proveniţi din alte materii, reziduuri care nu pot constitui sursă de hrană, aşa cum sunt materialele
lignocelulozice. Aceste materii prime conţin tot poliglucide ca şi amidonul, dar hidroliza lor este
mai dificilă, în sensul că necesită mai multe tratamente prealabile hidrolizei.
Deasemenea, a început utilizarea diferitelor alte materii prime (alge, materiale modificate
genetic) care pot fi sursă de glucide şi deci de bioetanol.

4
 CAPITOLUL 1
ASPECTE PRIVIND PRODUCŢIA DE BIOCOMBUSTIBILI

1.1. BIOCOMBUSTIBILII. CLASIFICARE, GENERALITĂŢI

Biocombustibilii sunt combustibili care se obţin din biomasă organică, aşa cum este, de
exemplu: bioetanolul care se obţine din trestia de zahăr, porumb, alte cereale, amidon sau
materiale lignocelulozice; biodiselul din uleiuri vegetale sau grăsimi animale.
Aceşti biocombustibili sunt surse regenerabile, care înlocuiesc combustibilii fosili; au
fost clasificaţi în patru generaţii:
a) prima generaţie, sunt combustibili obţinuţi din amidon, zahăr, ulei vegetal, grăsimi
animale, etc.(tabelul 1.1);
b) a doua generaţie, reperezentată de combustibilii fabricaţi din paie, coceni (materiale
lignocelulozice), plante nefurajere şi nealimentare, deşeuri (tabelul 1.2);
c) a treia generaţie este biocombustibilul produs din alge;
d) a patra generaţie, include microorganismele modificate genetic.

Biomasa, care reprezintă materia primă pentru producerea biocombustibililor, cuprinde

toate formele de material vegetal şi animal, atât din apă cât şi de pe suprafaţa solului, precum şi
substanţele produse prin dezvoltarea biologică (D.O. Hall, 1981). Biomasa este materia primă
pentru biocombustibili, cea mai mare şi importantă sursă de energie primară fiind considerată
una din principalele forme de energie regenerabilă.
Biomasa contribuie cu 14% la consumul mondial de energie primară, iar pentru trei
sferturi din populaţia globului care trăieşte în ţările în curs de dezvoltare aceasta reprezintă cea
mai importantă sursă de energie.
La nivelul Uniunii Europene se preconizează crearea a peste 300.000 de noi locuri de
muncă în mediul rural, tocmai prin exploatarea biomasei. În prezent, în UE, 4% din necesarul de
energie este asigurat din biomasă.

Tabelul 1.1
5
 Prima generaţie de biocarburanţi
(după Daniela Mihăilescu, 2008)
Biocarburanţi Nume specific Materie primă-biomasă Proces de fabricare

Bioetanol Bioetanol convenţional Sfecla de zahăr, cereale Hidroliză şi fermentare

Ulei vegetal crud (PPO-
pure plant oil) Culturi oleaginoase Presare la
Ulei vegetal pur
Biodiesel din culturi (ex.seminţe de rapiţă) rece/extracţie
energetice
Metil ester din seminţe
de rapită Culturi de oleaginose Presare la
Biodiesel (RME)-Acid gras (de ex. Seminţe de rece/extracţie şi
metal/ester rapiţă) transesterificare
(FAME/FAEE)
Biodiesel din deşeuri Deşeuri de la
Biodiesel Transesterificare
(FAME/FAEE) gătit/prăjit
Biogaz Biogaz purificat Biomasă (umedă) Digestare
Bio-ETBE - Bioetanol Sinteză chimică

Tabelul 1.2
Generaţia a doua de biocombustibili
(după Daniela Mihăilescu, 2008)

Biocarburanţi Nume specific Materie primă-biomasă Proces de fabricare

Hidroliză avansată şi
Bioetanol Bioetanol celulozic Material lignocelulozic
fermentatie
Biomasă transformată
în lichid (BTL)
Diesel Fischer-Tropsch
(Bio)diesel sintetic
Biocarburanţi
Biometanol Material lignocelulozic Gazificare şi sinteză
sintetici
Amestecuri de alcooli
superiori
Biodimetileter (Bio-
DME)
Gaz natural sintetic
Biogaz Material lignocelulozic Gazificare şi sinteză
(SNG)
Gazificare şi sinteză
Biohidrogen - Material lignocelulozic
sau proces biologic

6
 Statisticile arata că țările în curs de dezvoltare își acoperă circa 38% din nevoile proprii
de energie din biomasă, iar în multe dintre aceste țări, arderea lemnului de foc reprezintă până la
90% din consumul total de energie. De asemenea, unele țări dezvoltate își asigură în prezent, din
biomasă, o cotă importantă din consumurile proprii de energie, cum ar fi cca. 18% în Finlanda,
cca. 14% în Suedia, cca. 10% în Austria, etc. În Uniunea Europeană s-a evidenţiat că 4% din
necesarul de energie este asigurat din biomasă.
Având în vedere că peste aproximativ 20 de ani, Europa va fi nevoită să transporte o
cantitate mare de energie în jur de 70 % din necesarul de energie datorită epuizării resurselor, se
caută resurse regenerabile.

Fig.1.1 Procesul de obţinere a biocombustibililor

Datorită faptului că preţul ţiţeiului este în creştere şi greu de controlat se caută înlocuitori
ai combustibililor fosili cu biocombustibili din surse regenerabile, ca de exemplu porumbul care
conţine o cantitate mare de amidon. Acesta poate fi transformat cu ajutorul enzimelor în glucoză,

7
care poate fi fermentată cu ajutorul microorganismelor în etanol rezultând denumirea de
bioetanol.

1.2. BIOETANOLUL, PRINCIPALUL BIOCOMBUSTIBIL

Bioetanolul este alcool etil (H3C-CH2OH) produs din fermentarea zaharurilor conţinute în

diferite tipuri de biomasă. În producţia actuală, cele mai utilizate materii prime pentru obţinerea
bioetanolului sunt cerealele, în special porumbul.
Totuşi, cea mai importantă sursă de obţinere a bioetanolului, din punct de vedere
cantitativ, o reprezintă materiile prime lignocelulozice, aceste alternative la biomasa reprezentată
de cereale fiind considerate şi surse “morale”, în sensul că cerealele ar trebui utilizate ca sursă de
hrană, mai ales că sunt multe ţări unde aceasta este încă o problemă.
Bioetanolul este utilizat ca şi alternativă la folosirea combustibililor clasici cum ar fi benzina.
Folosirea bioetanolului implică realizarea unor amestecuri de benzină și bioetanol în diferite
proporții, de exemplu:

 E10 reprezintă un amestec de 10% bioetanol și 90% benzină.

 se mai utilizează amestecuri de 85% bioetanol și 15% benzină, combustibil denumit E85.

Din punct de vedere al caracteristicilor bioetanol-ului, acesta are:

 cifra octanică mai mare decât benzina, rezultând o ardere mai eficientă cu emisii de CO 2
mai reduse;
 puterea energetică / litru este mai mică (34%), fiind nevoie de mai mult combustibil
pentru acelaşi număr de kilometri.
Singurele autovehicule actuale cu motoare special proiectate pentru a rula cu bioetanol
sunt autobuzele şi camioanele.

8
 Fig.1.2 Obţinerea bioetanolului din biomasă

Producţia de bioetanol a crescut în ultimii ani atât în Statele Unite cât şi în Europa.
Astfel, în SUA, dacă în 1980 producţia de bioalcool a fost de 661 mii. litri, în 2000 această
producţie a crescut la 6.160 mii. litri, astăzi în SUA există capacităţi de producţie mari, care
produc peste 540 mii. litri/an (30%), capacităţi medii care produc între 120 şi 540 mii. litri/an
(40%), şi capacităţi mici, care produc între 27 şi 120 mii. litri/an (30%).
In Europa funcţionează cel puţin 10 unităţi de producţie a bioalcoolului carburant,
localizate în Spania, Franţa, Suedia, Ungaria, Italia, producţia de bioalcool dublându-se în
intervalul 2001-2004. La nivelul anului 2010 producţia a înregistrat peste 3 000 000 tone
bioalcool carburant.
Principalele companii Europene producătoare de bioetanol: Abengoa Bioenergy,
Agroetanol (Spania), Südzuck Bioethanol KWST (Germania), Royal Nedalco (Olanda), Wessex
Grain (Marea Britanie).
Utilizarea bioetanolului drept carburant pentru motoarele cu ardere internă nu este o
invenţie recentă, fiind practicată de aproape un secol şi jumătate. Ideea folosirii bioetanolului
9
drept carburant pentru motoarele cu aprindere prin scânteie datează din primele decade ale
secolului al XIX-lea. În 1860 Nicolaus A. Otto a utilizat etanolul pentru alimentarea prototipului
motorului sau, precursorul motoarelor cu aprindere prin scânteie de azi.
Deasemenea, Henry Ford a proiectat motorul modelului T (1908) ca să funcţioneze cu
etanol şi a construit împreună cu Standard Oil o uzină pentru producerea acestui carburant în
Midwest. Astfel, s-a ajuns ca în anul 1920 etanolul să reprezinte cca. 25 % din vânzările firmei
Standard Oil. Ford a continuat promovarea folosirii etanolului, dar în 1940 uzină a trebuit să fie
închisa sub efectul preţurilor extrem de scăzute oferite de industria petrolieră.
  Din 1925 etanolul o fost comercializat în Germania ca şi aditiv pentru creşterea cifrei
cetanice.  "Redescoperirea" în ultimii ani a bioetanolului ca şi carburant s-a datorat necesităţii de
găsire a unor surse de energie alternative care să înlocuiască treptat resursele minerale Mai mult
producţia de bioetanol asigura atât o dezvoltare sustenabila, cât şi garantează disponibilitatea
viitoare a combustibilului alături de o contribuţie semnificativă la reducerea emisiilor de CO2. 
În tabelul 1.3 sunt prezentaţi principalii producători de bioetanol din Europa, la nivelul
anului 2010.

Tabelul 1.3

Principalii producatori europeni de bioetanol (2006)

Productia
Ţara
106 litri 103 tone
Spania 303 241.2
Germania 165 131
Suedia 153 121
Franta 144 114
Polonia 64 50
Ungaria 35 27
Finlanda 13 10
Letonia 12 9.5
Lituania 8 6.3
Olanda 8 6.3

10
 1.3. PRODUCŢIA DE BIOCOMBUSTIBILI IN PRINCIPALELE ŢĂRI ALE
LUMII

În anul 2010 preţurile mondiale la etanol au crescut peste 30 % având în vedere creşterea
preţului la materiile prime din care se face etanolul, în special la zahăr şi porumb. Preţul la
etanol nu a avut aceeaşi evoluţie ca şi preţul materiilor prime în anul 2007-2008 rezultând un
profit mult mai redus. În anul 2010, SUA a devenit un exportator net de etanol, în timp ce
exporturile din Brazilia au scăzut semnificativ, comparativ cu anii anteriori, ca urmare a creşterii
foarte mari a preţurilor la zahăr şi a competitivităţii etanolului produs din porumb.
Se prevede că preţurile mondiale la etanol vor continua să crească şi în anul 2011. În
perioada analizată 2011–2020, cercetătorii cred că va fi o stagnare a preţurilor la etanol pe
măsură ce este implementată legislaţia cu privire la utilizarea biocombustibililor iar preţurile la
petrol sunt estimate să rămână ridicate.
SUA. Se preconizează că SUA va rămâne cel mai mare producător şi consumator de
bioetanol. Datorită faptului că e posibil sa fie o scădere a preţului la zahărul brut, etanolul
produs din trestie de zahăr ar putea deveni mai competitiv decât în anul 2010 şi exporturile din
Brazilia ar trebui să se redreseze în primii ani ai perioadei analizate.
În SUA, utilizarea etanolului ca şi combustibil va înregistra o evoluţie ascendentă urmând
să atingă aproximativ 71 miliarde până în anul 2020.
Cercetarea şi dezvoltarea etanolului celulozic nu permite încă o producţie la scară largă.
Producţia de etanol de a doua generaţie este posibil să se extindă în ultima parte a perioadei
analizate urmând să atingă 4,3 miliarde în anul 2020 şi să rămână mult sub valorile cerute în
Standardele pentru Combustibili Regenerabili de 40 miliarde pentru biocombustibili celulozici.
Uniunea Europeană va fi de departe cea mai mare producătoare şi consumatoare de
biomotorină. Unele ţări în curs de dezvoltare (cum ar fi: Argentina, Malaezia, Thailanda) ar
putea juca un rol semnificativ în exporturile de biomotorină (Fig.1.3).
Previziunile legate de producţia de biocombustibili în ţările în curs de dezvoltare sunt
incerte ca urmare a stagnării producţiei în ultimii ani. Cultivarea de noi materii prime, precum
jatropha sau manioc, nu permite încă o producţie de biocombustibili la scară mare.
Odată ce se vor implementa Standardele pentru Combustibili Regenerabili, SUA va rămâne
principalul producător de etanol. În ciuda incertitudinii politice, se aşteaptă ca, în perioada
11
următoare, creditul fiscal aplicat producătorilor de etanol,biomotorina şi taxa pe etanolul să fie
menţinute.
Standardele pentru Combustibili Regenerabili permit o producţie de etanol din porumb de
primă generaţie de 56,8 miliarde până în anul 2015. Agenţia de Protecţie de Mediului din SUA a
emis o decizie, în luna ianuarie 2011, legată de extinderea permiselor de combinare a etanolului
cu benzină normală de la 10% la 15% pentru automobilele produse în anul 2001 şi ulterior.

Fig.1.3. Producţia de biocombustibili

Directiva pentru Energie Regenerabilă implementată de către Uniunea Europeană

specifică faptul că procentul de surse de energie regenerabilă (inclusiv cea non-lichidă) ar trebui
să crească la 10% din totalul combustibililor utilizaţi pentru transport până în anul 2020.
Directiva permite înlocuirea cu alte surse regenerabile precum automobilele electrice.
Cantitatea totală de biomotorină utilizată în Uniunea Europeană este previzionată să crească cu
aproximativ 85% în perioada analizată şi să atingă aproximativ 20 miliarde litri până în anul

12
2020, biomotorina reprezentând o pondere medie de 6,5% din combustibilii de tip motorină, cu
70% mai mult comparativ cu perioada 2008 – 2010.
Producţia internă de biomotorină ar trebui să crească pentru a putea acoperi cererea. Se
estimează o stabilizare a importurilor la o medie de 2 miliarde de litrii în perioada analizată.
Începând cu anul 2018, se presupune că producţia de biomotorină de a doua generaţie va creşte
urmând să atingă 2,2 miliarde litri până în anul 2020.
Producţia europeană de etanol din grâu, cereale furajere şi sfeclă de zahăr este prevazuta
să crească la aproximativ 16,5 miliarde în 2020. Producţia de etanol de a doua generaţie se
presupune că va creşte la 1,6 miliarde până în anul 2020. Consumul de benzină este previzionat
că va stagna în perioada analizată comparativ cu anul de bază.
În Canada, conform mandatului ponderea etanolului din benzină trebuie să fie de 5% în
termeni volumetrici. Este prevăzut ca această pondere să fie aplicată încă din 2011 şi menţinută
pe toată durata perioadei analizate. Producţia internă este estimată să crească în perioada
analizată urmând să atingă 2,4 miliarde în anul 2020.
În Australia, ponderea de etanol în combustibili este posibil să rămână aproape
neschimbată în perioada analizată, anume la aproximativ 1,6%. Se presupune că politicile după
care funcţionează sunt mandatele pentru combinare a etanolului introduse în anul 2010, în
Queensland şi New South Wales. Ponderea biomotorinei între tipurile de combustibili diesel ar
trebui să rămână la aproximativ 2,7% în perioada analizată.
Brazilia, India şi China, ar trebui să însumeze 85% din producţia totală de 71 miliarde
litri etanol din ţările în curs de dezvoltare estimată pentru anul 2020.
În China, un procent foarte mare din producţia de etanol este utilizată în industria
alimentară şi chimică.
Ţările din regiunea Asiatică şi cea Sud Americană ar trebui să devină principalele
producătoare de etanol.
În Thailanda producţia este estimată să crească cu 1,5 miliarde urmând să atingă 2,2
miliarde până în anul 2020.

13
 1.4. PRODUCŢIA DE BIOCOMBUSTIBILI IN ROMÂNIA

În România, tot mai multe cercetări vizează utilizarea combustibililor proveniţi din
uleiuri vegetale ca şi combustibili la motoarele Diesel. Centrul de cercetare de la Cluj-Napoca a
obţinut o serie de rezultate semnificative, punând în circulaţie şi mijloace de transport în comun
alimentate cu biodiesel.
Prin Hotărârea de Guvern 1844/2005, România a adoptat Directiva europeană asumându-
şi obiectivul ca la 1 ianuarie 2007 să se înregistreze o cotă de consum de biocarburanţi de 2% din
totatul combustibililor consumaţi la nivel naţional urmând să crească până la 5,75 % pentru anul
2010 şi 10 % pentru 2020.
Prin negocierile cu Uniunea Europeană, România nu şi-a asumat nici o obligaţie în
această direcţie. Cele mai optimiste estimări arată că, din totalul combustibililor folosiţi in
România, cel mult 0,5% reprezintă combustibilii biologici.
Potrivit unui proiect de Hotărâre a Guvernului României elaborat de Ministerul
Economiei şi Finanţelor, companiile care produc şi comercializează motorină şi benzină vor fi
obligate să amestece carburanţii cu biocombustibil, proporţia cantităţii din surse regenerabile
urmând să crească treptat până în 2020 (Fig. 1.4).

Fig. 1.4. Evoluţia biocombustibililor în România în perioada 2007-2010

14
 Piaţa combustibililor clasici reprezintă unul dintre motivele pentru care trecerea la
biocombustibili este necesară şi benefică pentru România, în contextul diminuării rezervelor
interne şi a creşterii importului.
Creşterea preţului la petrol impune ca soluţie folosirea pe scară largă a unei alternative
energetice. Prin urmare, biocombustibilii ar putea reprezenta una dintre soluţiile viabile de
reducere a dependenţei energetice în contextul creşterii industriale şi a numărului mijloacelor de
transport.
In fig. 1.5 se prezintă principalele culturi şi suprafeţele pe care sunt cultivate, pentru
obţinerea de biocombustibili, în România.

Fig. 1.5. Evoluţia suprafeţelor folosite pentru culturi de biocombustibili

România ar avea avantaje în vederea producerii biocombustibililor şi anume: mâna de

lucru foarte ieftină; costurile de producţie foarte avantajoase; solul şi clima care sunt favorabile;
disponibilitatea de hectare necultivate
Principalele probleme cu care se confruntă, la ora actuală, piaţă biocombustibililor din
România sunt următoarele:
-producţia la hectar este mică, maximum 2 - 2,5 t/ha de ulei de rapiţă;

15
 -facilităţile fiscale sunt aproape inexistente, ceea ce face ca sămânţa de rapiţă din
România să fie mai scumpă decât cea din import;
-legislaţia nu este suficient de clară astfel că nu este stabilit exact regimul amestecurilor
de motorină şi biodiesel;
-nu s-a făcut o delimitare clară pentru a stabili care sunt terenurile destinate culturilor de
cereale pentru biocarburanţi;

1.4.1. Avantajele si dezavantajele biocombustibililor

Avantaje
a) Costul: o dată ce tehnologia este disponibilă la scară largă, biocombustibilul poate fi
mult mai puţin costisitor decât benzina şi alţi combustibili fosili.
b) Materiale: întrucat uleiul este o resursă limitată, care vine de la materialele specifice,
biocarburanţii pot fi fabricaţi dintr-o gamă largă de materiale, inclusiv a deşeurilor vegetale,
resturi animale din grajd şi a produselor înrudite, ceea ce face un pas eficient în reciclare.
c) Siguranţa: prin reducerea dependenţei de alte surse de combustibil străin, tările pot
proteja integritatea resurselor energetic.
d) Stimularea economică: de vreme ce biocombustibilii sunt fabricaţi la nivel local,
uzinele de fabricare a biocarburanţilor pot crea noi locuri de muncă prin angajarea a sute sau mii
de muncitori.
e) Biodegradabilitate: biocarburanţii sunt uşor biodegradabili şi mult mai uşor de
manevrat decât combustibilii tradiţionali, ceea ce face scurgerile mai puţin periculoase şi mai
puţin costisitoare .
f) Scăderea emisiilor de carbon: când biocombustibilii sunt arşi, aceştia produc CO2 şi
toxine într-o cantitate semnificativ redusă, făcându-le o alternativă mai sigură pentru păstrarea
calităţii atmosferice, alături de micşorarea gradului de poluare al aerului.

Dezavantaje
a) Energia produsă: biocarburanţii au o putere mai scazută decat combustibilii traditionali
,prin urmare, necesită o cantitate mai mare de consum, cu scopul de a produce acelaşi nivel de
energie.
16
 b) Emisiile de carbon mari în cadrul producţiei: mai multe studii au fost efectuate pentru
a analiza amprenta de carbon a biocombustibililor. Rezultatele arată că în timp ce ele pot fi mai
curate la ardere, există indicii conform cărora procesul puternic  de producţie - inclusiv
mecanismele necesare pentru a cultiva culturile şi plantele necesare pentru a produce combustibil
– emană emisii solide de carbon.
c) Cost ridicat: rafinarea  biocarburanţilor către rezultate mai eficiente şi construirea unor
instalaţii de producţie potrivite pentru creşterea cantităţilor de biocombustibil  necesită o
investiţie iniţială mare.
d) Utilizarea apei: sunt necesare cantităţi masive de apă pentru irigarea corespunzătoare a
culturilor biocombustibililor, precum şi pentru fabricarea de combustibil.
e) Disponibilitate: Biocarburanţii nu sunt disponibili la scară largă pentru achiziţionare
iar cele mai multe vehicule nu sunt echipate pentru a rula pe  biocombustibil. Disponibilitatea
limitată reduce necesitatea de biocombustibilil ca sursă alternativă de energie.
f) Biocarburanţii sunt o resursă alternativă fiabilă de energie, însa este necesară mai multă
dezvoltare şi cercetare pentru a depăşi avantajele şi dezavantajele biocombustibililor şi de a le
face potrivite pentru utilizarea la scară largă.
În cazul în care tehnologia este disponibilă, multe dintre dezavantaje vor fi limitate iar
consumatori vor putea începe să se bucure de toate beneficiile durabile ale sursei de energie
regenerabilă.

1.5. MATERII PRIME FOLOSITE LA FABRICAREA BIOALCOOLULUI

Materiile prime pentru fabricarea alcoolului etilic pot fi clasificate în:

- materii prime cerealiere: orz, grâu, secară, porumb, sorg;
- materii prime tuberculi/rădăcini: cartofi, topinambur;
- subproduse din industria alimentară: melasă din sfeclă şi trestie (subproduse din
industria zahărului), precum şi zer (subprodus din industria laptelui);
- materii ligno-celulozice (paie, coceni, tulpini de floarea-soarelui, vrejuri de mazăre, de
fasole, de soia, deşeuri forestiere) şi celuloze (hârtie).

17
 Fig. 1.6. Obţinerea bioalcoolului din divrse surse de biomasă

1.5.1 Materii prime cerealiere

Acestea sunt folosite pe scară largă pentru producţia de alcool etilic alimentar şi
biocarburant, având în vedere suprafeţele mari cultivate şi producţia mare de cereale/ha în
condiţiile unei agriculturi performante şi folosirii unor soiuri productive,conţinut ridicat în
amidon. Principalele cereale ce pot fi utilizate sunt: orzul, grâul, sorgul, porumbul.

18
 Porumbul (Zea mays) reprezintă o materie primă importantă pentru producţia de alcool
etilic, dar cu utilizări şi pentru obţinerea de mălai, crupe, amidon şi derivate de amidon, bere (ca
nemalţificat), ulei (germene de porumb), conserve (porumbul dulce) etc.
Utilizarea porumbului în producţia de alcool este dependentă de conţinutul în amidon. în
România, porumbul ocupă primul loc ca importantţă între plantele cerealiere cultivate, deoarece:
- are o mare capacitate de producţie (cu 40-45% mai mare decăt a celorlalte cereale);
- se păstrează bine în condiţii economicoase.
Porumbul boabe destinat industrializării se livrează în două categorii: categoria A, folosit
la fabricarea amidonului, dextrinei, glucozei, butanolului; categoria S-j folosit în special la
fabricarea spirtului (alcoolului etilic). Porumbul pentru industrializare trebuie să provină din
soiuri sau hibrizi cu conţinut bogat în amidon.

1.5.2. Materii prime tuberculi

Dintre materiile prime tuberculi, cartofii reprezintă una din sursele importante de amidon
în vederea producţiei de alcool etilic. Cartofii conţin însă şi pectine din care se formează şi alcool
metilic la fermentaţie grupările metil ale pectinelor sunt eliberate de pectin esterazele din cartofii
măcinaţi. Dezesterificarea este continuată şi la fierbere, fiind mai pronunţată la fierberea sub
presiune decât la fierberea fără presiune.

Tabelul 1.4
Compozitia chimică globală a unor cereale, in %
Componenta Orz Grau Secara Porumb Sorg
Apa 14 14 14 14.14 13.5
Proteine 11.5 11.6-12.7 99.9 10.3 11.1
Grasime 2.41 2.11-2.31 2.18 4.85 4.12
Amidon 50.1 52.4-53.7 54.0 54.3-56.9 56
Fibra:
hemiceluloza 6.7 53-7.7 6.9 4.2 4.0
celuloza 4.1 2.4-2.5 2.6 2.1 3.5
Cenusa 1.7 1.7 1.7 1.2 2.2

19
 Cartoful (Solanum tuberosum) se cultivă cu predilecţie în judeţele Harghita Covasna şi
Suceava. Pentru industria alcoolului (dar şi a amidonului), cultura cartofului are avantajul că
producţia exprimată în amidon este dublă faţă de cea a porumbului reprezentând ~3000-4000 kg
amidon/ha, faţă de porumb, la care se obţin 1500-2000 t amidon/ha.
Cantitatea de amidon din cartofi depinde de soi, condiţiile de cultivare, clima şi
îngrăşămintele folosite. Datorită conţinutului de tirozină liberă şi polifenoloxid-azelor, cartofii
tăiaţi, în contact cu aerul, se înnegresc (îmbrunare enzimatică). Cartofi imaturi au un conţinut
mai mare de proteine, care produc spumă abundentă lai fermentarea plămezii.
După Talburt şi Smith (1987), compoziţia chimică medie a tuberculilor de cartofi este influenţată
de varietate, condiţiile pedoclimatice şi tehnologia de producţie. Materia primă (cartofii) pentru
spirt trebuie să fie bogată în substanţă uscată, în principal amidon. Substanţa uscată la cartofi se
determină cu un feculometru prin imersarea a 5 kg cartofi în apă.
Topinamburul, denumit şi pară de pământ, este un tubercul caracterizat într-un mare
conţinut de inulină (11-12%) şi de fructoză (5-6%). Inulina este un polizaharid care nu este
solubil în apă rece, dar este solubil în apa la cald (70...80°C), când se formează un lichid siropos-
cleios.

1.5.3 Sfecla de zahăr

Sfecla de zahăr (Beta vulgaris saccharifera) este o plantă erbacee aparţinând familiei
Chenopodiaceae. Se utilizează sfecla din primul an de vegetaţie, când se formeaza rădăcina şi
frunzele.
Sfecla de zahăr, matură, sănătoasă, cu o masă de 300-1000 g şi chiar mai mult conţine apă,
zaharoză, substanţe pectice (protopectină), celuloză şi hemiceluloză, substanţe proteice, substanţe
neproteice cu azot şi fără azot şi cenuşă (substanţe minerale).
Sfecla de zahăr (şi alte sortimente de sfeclă) conţine 80% apă şi 20% substanta uscată, în cadrul
substanţei uscate zaharoza este componentul principal şi, având în vedere acest fapt, sfecla se poate
constitui ca o materie primă pentru fabricarea etanolului.

1.5.4. Subproduse din industria alimentară

Cele mai importante subproduse din industria alimentară care pot fi utilizate la fabricarea
alcoolului etilic sunt melasele şi zerul.
20
 Melasa (de trestie şi de sfeclă de zahăr) reprezintă un subprodus al industriei zaharului şi
se prezintă ca un fluid foarte vâscos, de culoare brun-închis până la negru cu masă specifică de
1,3-1,45 g/cm3, cu miros de cafea prăjită şi gust dulce-amarui (Petculescu, ş.a., 1979).
Concentraţia melasei se exprimă în grade Balling sau Brix. Un grad Balling sau Brix reprezintă 1
g substanţă uscată conţinută de 100 g soluţie. Melasa are concentraţie de 75-80 grade Brix. Din
punct de vedere chimic melasa este o soluţie concentrată ce conţine zaharuri, substanţe organice
şi substante minerale. Zaharurile din melasă sunt reprezentate de zaharoză, rafinoză(trizaharid)
şi, în funcţie de gradul de degradare microbiană, conţine cantităţi de peste 1% zahăr invertit
(melasa normală are 0,25-1% zahăr invertit).

1.5.5. Materii prime lignocelulozice

Aceste materii prime sunt reprezentate de deşeurile din agricultură (paie, coceni, etc.) şi
deşeurile de material lemnos tare şi moale din păduri, respectiv de la prelucrarea iniţială a
lemnului (aşchii, rumeguş etc). In structura materiilor prime lignocelulozice intră celuloza,
hemiceluloza şi lignina (tabelul 1.5).

Tabelul 1.5
Continutul de hemiceluloză, celuloză şi lignină din materialele lignocelulozice
Deseuri din Deseuri de Deseuri de lemn
Componentul
agricultura lemn tare moale
Hemiceluloza 30-35% 28-33% 28-33%
Celuloza 35-45% 35-48% 38-42%
Lignina 20-25% 20-24% 25-30%

Pe plan mondial se manifestă în prezent o tendinţă accentuată de recuperare şi

reintroducere în circuitul economic a resurselor materiale, ca parte componentă a strategiilor de
armonizare a relaţiilor dintre creşterea economică, consumul de resurse şi protecţia mediului
natural. La scară globală, sunt evidente o serie de restricţii în privinţa resurselor materiale, ceea
ce a făcut că reciclarea acestora să devină o necesitate obiectivă.
În acest context, interesul pentru valorificarea biomasei lignocelulozice, a crescut
considerabil, ştiindu-se ca acestea reprezintă cea mai abundentă materie organică regenerabilă.
21
Este cunoscut faptul că mai mult de jumătate din biomasa vegetală obţinută în agricultură şi
silvicultură, nu se utilizează decât parţial sau chiar se aruncă.
Cantităţi mari de deşeuri lignocelulozice sunt generate de prelucrările agricole şi
forestiere, de industria celulozei şi hârtiei, a lemnului şi alte nenumărate agro-industrii şi ridică
serioase probleme legate de poluarea mediului înconjurător.
Din păcate, o mare parte a deşeurilor lignocelulozice se pierde prin arderea acestora pe
câmp, practică extinsă la nivelul întregii planete. Ori acest produs secundar sau chiar deşeu
lignocelulozic are un potenţial remarcabil că sursa de C şi energie, a cărei exploatare poate
conduce la dezvoltarea unor procese durabile, pentru obţinerea de produse deficitare sau care în
prezent se obţin din materii prime epuizabile.
Astfel se justifica numeroasele cercetări care se desfăşoară în prezent, pe plan mondial,
pentru bioconversia deşeurilor lignocelulozice într-o gamă largă de produse ca: substanţe
organice de bază pentru industria chimică, mase plastice, pesticide, biocombustibili, acizi
organici, aminoacizi, vitamine, monozaharide, polizaharide bacteriene şi fungice, proteină
furajeră, alţi compuşi organici care reprezintă intermediari utili pentru industria chimică şi
farmaceutică etc.
Enzimele lignocelulozice au de asemenea aplicaţii semnificative în diferite domenii,
precum: industria chimică, alimentară, a combustibililor, a berii şi vinului, a nutreţurilor, a
celulozei şi hârtiei, în industria textilă şi în agricultură.
Pentru ca aceste resurse de origine vegetală să poată fi valorificate în mod eficient se
impune cunoaşterea aprofundată a compoziţiei lor (plantă întreagă sau componente ale acesteia),
astfel încât să se utilizeze acele metode de prelucrare care asigură conservarea elementelor
funcţionale specifice unui anumit produs. Proprietăţile chimice ale componentelor materialelor
lignocelulozice dau acestui substrat o importantă valoare biotehnologică.

22
 Lignoceluloza

Fermentatie Fara pretratament Pretratament Nutreturi

Proteine unicelulare (SCP) Enzime Zaharificare

lignocelulolitice

Nutritie umana
sau animala Glucoza Manoza Xiloza Compusi
fenolici
Industrie alimentara
si chimica
Fermentatie Xilitol Furfural Benzen

SCP Alcooli Metan Enzime Polizaharide Substante Antibiotice

microbiene chimice pure

Compusi petrochimici, Produse alimentare

combustibil si nutreturi

Fig. 1.7 Etapele generale de valorificare a materialelor lignocelulozice prin

bioconversie

Indiferent de provenienţa lor, materialele lignocelulozice sunt alcătuite din aceleaşi

componente majore: celuloză, hemiceluloză şi lignină, în diferite proporţii, după cum rezultă din
tabelul 1.6.

23
 Tabelul 1.6
Tipuri de materiale lignocelulozice şi utilizarea lor actuală
Sursa Reziduul Utilizare

Recoltarea boabelor Paie, ştiuleţi, lujeri, coji, Furaje, combustibil

Grâu, orez, orz, ovăz şi porumb
Procesarea boabelor
Porumb, grâu, orz, soia
Recoltarea fructelor şi legumelor
Procesarea fructelor
legumelor
Trestie de zahăr şi alte produse
ce conţin zahăr
Plante şi seminţe
uleioase: nuci, seminţe de
bumbac, măsline, soia
Deşeuri animale
Industria forestieră şi a celulozei
şi hârtiei
Recoltarea buştenilor
Deşeuri de cherestea şi placaj
Fabrici de celuloză şi
hârtie
Deşeuri lignocelulozice
comunitare
Ape reziduale, tărâţe
Seminţe, coji, sâmburi,
fructe întregi căzute, suc
şi Seminţe, coji, sâmburi,
fructe întregi degradate,
suc, Ape reziduale
borhot
Coji, fibre, şlam presat, ape
reziduale
Bălegar, gunoi de grajd
Reziduuri lemnoase,
scoarţă, frunze
Talaş, praf de cherestea,
rumeguş
Deşeuri fibroase, leşii
sulfitice
Ziare vechi, hârtii,
cartoane, mobilă
(ardere), îngrijirea solului
Furaje
Hrană pentru animale şi
peşti, extragerea uleiului din
anumite seminţe
Combustibil (ardere)
Furaje, fertilizatori,
combustibil
Îngrijirea solului
Îngrijirea solului,
combustibil
Industria celulozei şi hârtiei,
carton de talaş şi fibre
Refolosite drept combustibil
în industria hârtiei şi
cartonului
Reciclare (un procentaj
mic), restul drept
combustibil

Tabelul 1.7
Conţinutul lignocelulozic al unor reziduuri şi deşeuri lignocelulozice

Materialul lignocelulozic Celuloza (%) Hemiceluloza (%) Lignina (%)

Tulpina de lemn tare 40 -55 24 - 40 18 - 25

Tulpina de lemn moale 45 - 50 25 - 35 25 -35
Coaja de nuca 25 - 30 25 - 30 30 -40
Stiulete de porumb 45 35 15
Hartie 85 -99 0 0 - 15
Paie de grau 30 50 15
24
Paie de orez 32,1 24 18
Rebuturi lemnoase sortate 60 20 20
Frunze 15 -20 80 - 85 0
Fibre din seminte de bumbac 80 - 95 5 - 20 0
Ziare 40 - 55 25 - 40 18 - 30
Reziduu de hartie de la prelucrarea chimica 60 - 70 10 - 20
Solide din rezidii primare apoase 8 - 15 NA 24 - 29
Borhot proaspat 33,4 30 18,9
Dejectii de porc 6 28 NA
Balegar solid de vita 1,6 – 4,7 1,4 – 3,3 2,7 – 5,7
Ierburi (valori medii) 25 - 40 25 - 50 10 - 30

Celuloza, principalul component al peretelui celular vegetal, este un poliglucid cu masă

moleculară mare, ce conţine în medie 3.000 de resturi de glucoză legate β-1,4.
Prezenţa legăturilor β-1,4 conferă celulozei o structură liniară, ceea ce permite formarea
de legături de hidrogen între resturile de glucoză ale aceluiaşi lanţ sau între resturile de glucoză
ale unor lanţuri învecinate, realizându-se astfel o structură cristalină.

Datorită compoziţiei şi structurii macromoleculare caracteristice, celuloza prezintă

proprietatea de reţinere a apei.
Hemicelulozele pot fi definite ca un amestec complex de poliglucide de natură foarte
diferită, incluzând homopoliglucide şi heteropoliglucide. Cele din urmă pot fi hidrolizate în
mediu alcalin la hexoze, pentoze şi acizi uronici. Clasificarea hemicelulozelor se face pe baza
naturii monomerului preponderent. Scheletul central este reprezentat de obicei de un polimer de
xiloză sau glucoză format prin legături β-1,4 glicozidice. Pe acest schelet sunt grefate ramificaţii
de mono- şi poliglucide formate din arabinoză, glucoză, manoză, galactoză sau acid glucuronic
sau galacturonic.
25
 Hemicelulozele au fost împărţite în două categorii:
-hemiceluloze A, slab ramificate şi bogate în xilan; ele conţin de fapt arabinoxilani
(pentozani) care sunt formaţi din arabinoză legată de lanţuri de xiloză.
-hemiceluloze B ce au un grad înalt de ramificare, în special cu ramificaţii formate din
polimeri ai acidului uronic şi arabinozei.
Hemicelulozele au o mare capacitate de reţinere a apei. Cele care conţin grupări acide au
proprietăţi de schimbători de ioni şi sunt în general mai digerabile decât celuloza, în funcţie de
origine şi de specia animalului consumator: la om digestibilitatea hemicelulozelor este de 60%
faţă de 30% pentru celuloză.
Lignina este un polimer complex heterogen, reprezentând cel mai răspândit component,
după celuloză, din pereţii celulari ai anumitor plante, compus din monomeri fenil-propanoidici
derivaţi din compuşi simpli (nuclee benzenice substituite = monolignoli): alcool p-cumarilic,
alcool coniferilic, alcool sinapilic legaţi între ei prin legături C-C.
Pe lângă aceşti fenoli propanoidici, moleculă ligninei mai conţine şi resturi de acid
cumaric, care se cuplează, prin legături esterice, cu alcoolul coniferilic sau cu alcoolul sinapilic.
Polilignolul se leagă de structurile polizaharidice ale peretelui celular vegetal, prin
reticulare, prin intermediul unui compus bifuncţional, acidul ferulic, ce formează legături
covalente de diferite tipuri, în special cu arabinoza din scheletul xilanului.
Structura astfel formată este foarte rigidă şi conferă rigiditate şi stabilitate şi matricei
peretelui celular vegetal, împiedicând degradarea structurilor polizaharidice ale acestuia, având
funcţii critice în transportul apei, şi, în ultimă instanţă, constituind o barieră impenetrabilă de
către agenţi patogeni, soluţii şi enzime.

26
 Fig. 1.8 Reprezentarea schematica a structurii ligninei

1.6 ENZIME LIGNOCELULOZOLITICE

Lignazele
Identificarea microorganismelor care au capacitatea de a degrada lignina a fost până de
curând o problemă foarte dificilă, datorită lipsei unor metode de analiza adecvate. În ultimul timp
s-au făcut progrese semnificative ca urmare a introducerii metodelor de identificare a ligninei
marcată cu izotopul 13C.
Fungii au capacitatea de a degrada lignina în condiţii aerobe prin intermediul unei familii
de enzime extracelulare, denumite cu termenul colectiv de „lignaze”. În momentul de faţă se
27
consideră că două familii de lignaze sunt implicate în mod esenţial în degradarea ligninei:
fenoloxidaza (laccaza) şi peroxidazele (lignin-peroxidaza – LiP şi mangan-peroxidaza (MnP).
Rolul altor enzime menţionate în legătură cu degradarea ligninei nu este clarificat încă.
Printre acestea se număra enzimele care produc H2O2: glioxal oxidaza, glucozoxidaza, veratril-
alcooloxidaza, metanoloxidaza şi oxido-reductaza.
Studii recente au evidenţiat faptul că mecanismul degradării ligninei implica două tipuri
de reacţii: scindarea oxidativa a catenelor laterale propanoidice şi scindarea nucleelor aromatice
prin demetilare şi oxidare. Se pare că biodegradarea ligninei nu se produce prin îndepărtarea
ordonată a subunităţilor periferice, ci prin oxidarea nucleelor aromatice şi a catenelor laterale în
interiorul polimerului, ceea ce conduce la solubilizarea porţiunii interioare a polimerului
concomitent cu eliberarea unor fragmente de diferite dimensiuni.
Lignin peroxidaza (LiP) a fost descoperită în Phanerochaete chrysosporium, dar este
produsă de mai mulţi fungi. Este o hemproteina extracelulara, dependentă de H 2O2, cu un
potenţial redox deosebit de mare şi un pH optim scăzut. Are specificitate redusă de substrat,
reacţionând cu o varietate de compuşi cu elemente structurale asemănătoare ligninei şi chiar cu
alte tipuri de structuri. Are capacitatea distinctă de a oxida nuclee aromatice metoxilate care nu
conţin grupa fenol liberă, generând radicali cationici liberi, care pot reacţiona pe diverse căi, cu
scindarea legăturilor C-C, deschiderea ciclurilor, demetilare şi fenoldimerizare.
Mangan peroxidaza (MnP) Este un alt tip de hem peroxidaza, descoperită mai târziu în
mediul de cultură al aceloraşi fungi, care prezintă mare afinitate pentru Mn (II) că substrat
reducător. Produsul oxidat, Mn(III), formează un complex cu acizii organici şi se desprinde de
enzimă, oxidând ulterior alte substraturi, că lignina.
Mangan peroxidaza pare a fi mai răspândită în fungi decât lignin peroxidaza [40] şi poate
fi detectată mai uşor în culturile pe substraturi lignocelulozice.
Laccaza este o metaloenzima ce conţine mai mulţi atomi de cupru şi nu depinde de H 2O2.
Ca şi mangan peroxidaza, oxidează în mod normal numai compuşii asemănători ligninei cu grupe
fenol libere, formând radicali fenoxi. Totuşi, în prezenţa unor substraturi artificiale - ABTS (2,2´-
azinobis (3-etillbenztiazolin-5-sulfonatul) sau a altor mediatori sintetici, laccaza poate oxida
anumiţi compuşi non-fenolici.
Laccaza nu este produsă în mod normal de Phanerochaete chrysosporium, ci de alţi
fungi. Are capacitatea de a depolimeriza şi polimeriza compuşi asemănători ligninei. Faţă de LiP
28
Şi MnP, care sunt oxidanţi mai puternici, laccaza are un potenţial redox mai mic, fiind capabilă să
catalizeze reacţii de oxidare cu participarea unui singur electron, respectiv ale substraturilor
fenolice uşor oxidabile din structura ligninei, concomitent cu reducerea unui atom de oxigen şi
formarea apei. Acţiunea oxidanta a laccazei asupra altor substraturi decât derivaţii fenolici poate
fi explicată prin intervenţia unui mediator, cu rol de transportor de echivalenţi reducători.

Hemicelulazele
Hemiceluloza este alcătuită dintr-un un grup de heteropolizaharide solubile în mediu
alcalin, care sunt asociate cu celuloza şi intră în constituţia peretelui celular vegetal, incluzând β-
D-glucani necelulozici, substanţe pectice (poligalacturonani) şi mai multe heteropolizaharide cum
sunt cele formate în mod predominant din galactoză (arabinogalactani), manoză (galactogluco- şi
glucomanani) şi xiloză (arabinoglucurono- şi glucuronoxilani). De fapt, sunt în general denumite
hemiceluloze heteropolizaharidele cu un grad de polimerizare redus (100–200 unităţi) comparativ
cu al glucozei (10000–14 0000). Principalii componenţi glucidici ai heteropolizaharidelor
hemicelulozice sunt: D-xiloza, D-manoza, D-glucoza, D-galactoza, L-arabinoza, acidul D-
glucuronic, acidul D-galacturonic şi mai puţin L-rhamnoza, L-fucoza şi diferite glucide O-
metilate.
Hemicelulazele, ca multe alte enzime care hidrolizează polizaharidele din peretele celular
al plantelor sunt ptoteine alcătuite din mai multe domenii. Aceste proteine conţin în general
module catalitice şi necatalitice structural distincte. Cele mai importante module necatalitice
constau în domenii de legare a carbohidraţilor (CBD) care facilitează fixarea acestora, liganzi
interdomenii şi module „dockerin” care mediază legarea domeniului catalitic al enzimei, prin
interacţii de coeziune-dockerin, fie de suprafaţa celulei microbiene, fie de complexe enzimatice
precum celulozomul.
Xilanul este cea mai abundentă hemiceluloză, iar xilanazele sunt hemicelulazele majore
care hidrolizează legăturile β-1,4 din scheletul xilanului, determinând formarea de xilooligomeri,
care sunt hidrolizaţi ulterior la unităţi de xiloză de către β-xilozidaze. Cele mai cunoscute
xilanaze aparţin familiilor GH 10 şi GH 11, iar β-xilozidazele sunt distribuite în familiile 3, 39,
43, 52 şi 54. Enzimele bifuncţionale xilozidaz-arabinozidaze se găsesc în mod special în familiile
3, 43 şi 54. β-mananazele hidrolizează hemicelulazele pe bază de manan şi eliberează β-1,4-
mano-oligomeri mici, care ulterior pot fi hidrolizaţi la manoză, de către β-manozidază.
29
 În familiile GH 5 şi 26 se găsesc aproximativ 50 de manaze, iar în familiile GH 1, 2 şi 5
se găsesc aproximativ 15 β-manozidaze. α-L-arabinofuranozidazele şi α-L-arabinanazele
hidrolizează arabinofuranozil-hemicelulozele şi se găsesc în familiile GH 3, 43, 51, 54 şi 62.
Câteva din aceste enzime prezintă o specificitate kargă de substrat, acţionând asupra
arabinofuranozidelor la nivelul legăturilor O-5, O-2 şi O-3, ca şi asupra legăturilor O-2 şi O-3
din xilanii dublu substituiţi, xilooligomeri şi arabinani [51].
Alte xilanaze şi D-glucuronidaze, care hidrolizează legătura α-1,2-glicozidică din catena
laterală a xilanilor, formată din acid 4-O-metil-D-glucuronic, se găsesc în familia 67. Esterazele
hemicelulozolitice includ acetil esteraze, care hidrolizează substituenţii acetil de pe molecula
xilozei şi feruloil esteraze, care hidrolizează legătura esterică dintre substituenţii arabinozei şi
acidul ferulic. Feruloil esterazele contribuie la desfacerea hemicelulozei de lignină, făcând
produsul polizaharidic accesibil biodegradării ulterioare de către hemicelulaze.

Celulaze
Celulazele, enzimele responsabile de hidroliza celulozei, sunt compuse dintr-un amestec
complex de proteine enzimatice, cu diferite specificităţi de hidroliză a legăturilor glicozidice. În
funcţie de activitatea lor enzimatică, ele pot fi împărţite în trei clase majore, endoglucanaze sau
endo-1,4-β-glucanaze (E.C.3.2.1.4), celobiohidrolaze (E.C.3.2.1.91) şi β-glucozidaze
(E.C.3.2.1.21). Se consideră că endoglucanazele, deseori denumite carboximetilcelulozo (CM)-
celulaze, iniţiază atacul aleatoriu la multiple situsuri din interiorul regiunilor amorfe ale fibrei
celulozice, deschizând astfel calea celobiohidrolazelor.
Celobiohidrolazele, deseori denumite exoglucanaze, formează componenta majoră a
sistemului celulazic fungic, reprezentând aproximativ 40-70% din proteina celulazică totală şi se
caracterizează prin faptul că hidrolizează celuloza cristalina. Celobiohidrolazele îndepărtează
mono- şi dimeri de la capătul lanţului celulozic. β-glucozidaza hidrolizează dimerii şi în anumite
cazuri, celo-oligozaharide la glucoză.
În general, endoglucanazele şi celobiohidrolazele acţionează în mod sinergic, dar detaliile
mecanismelor lor de acţiune încă nu sunt cunoscute. Se pare că microorganismele au mai multe
variante distincte de endo- şi exoglucanaze. Ca şi hemicelulazele, celulazele sunt proteine
formate din mai multe domenii. Definiţia curentă şi clasificarea “adevăratelor” celulaze este încă
incertă. În tabelul 5 este prezentată clasificarea actuală a celulazelor.
30
 Există studii care demonstrează multifuncţionalitatea glucanazelor, inclusiv a unor
hemicelulaze şi celulaze, conform cărora conceptul “o enzimă – o activitate” nu este general
valabil, mai ales în cazul glucanazelor. O proteină multifuncţională este o proteină care este
alcătuită dintr-un singur tip de lanţ polipeptidic, dar care are multiple activităţi catalitice şi de
legare. De exemplu, XylA din Neocallimastrix patricianum are două domenii identice. De
asemenea, în microorganismul Caldocellum saccharolyticum s-a identificat o celulază cu endo- şi
exo- activitate.

31
 CAPITOLUL 2
MATERIALE ŞI METODE DE LUCRU

Cercetările privind producţia de bioalcool din materiale lignocelulozice au fost realizate

în Laboratorul de Biotehnologii Fermentative din cadrul Facultăţii de Biotehnologii şi au avut
următoarele obiective:
-stabilirea potenţialul glucidic şi deci potenţialul alcoolic al unor reziduuri
lignocelulozice;
-influenţa pretratamentelor, chimice şi enzimatice asupra creşterii concentraţiei în glucide
la materialele lignocelulozice.

2.1. MATERIALE UTILIZATE

In studiile care au stat la baza lucrării de disertaţie au fost utilizate:

-2 tipuri de materiale lignocelulozice – reziduuri agricole din cultura de porumb şi grâu;
-2 tipuri de enzime, pentru tratamentul enzimatic ale acestor materiale;
-1 suşă de drojdie, din specia Saccharomyces cerevisiae.

1. Materialele lignocelulozice studiate sunt reprezentate de 2 tipuri de reziduuri din

agricultură, din cultura de porumb şi grâu:
-coceni de porumb;
-paie de grâu
Aceste subproduse agricole sunt, de regulă utilizate fie ca şi combustibil (prin arderea ca
atare), fie ca fertilizanţi organici, prin încorporare în sol sau prin compostare.
Datorită noilor directive europene şi chiar la nivel mondial, de obţinere şi utilizare de
biocombustibili, obţinuţi din reziduuri provenite din agricultură sau diverse industrii, cercetările
noastre s-au axat pe studiul unor reziduuri agricole, lignocelulozice, care vor fi utilizate în
producţia de biocombustibili.
Reziduurile din agricultură, de natură lignocelulozică, în cazul studiilor noastre ştiuleţii de
porumb şi paiele de grâu au prezentat următorul conţinut lignocelulozic:
32
 Cocenii de porumb: 48,5% celuloză, 33% hemiceluloză şi 18,5% lignină;
Paiele de grâu: 34,5% celuloză, 51% hemiceluloză şi 14,5% lignină

2. Enzimele utilizate în prezentele studii, au fost:

-Enzima lacaza, provenită din Trametes versicolor (ciupercă lignivoră, care se hrăneşte
cu lemn umed şi care este vector al putregaiului alb), achiziţionată de la firma SIGMA-
ALDRICH®, sub formă de pulbere, de culoare maro deschis.
Lacaza este o enzimă din clasa oxidoreductazelor (p-difenol: dioxigen oxidoreductaza),
care catalizează oxidarea de fenoli sau amine aromatice, în prezenţa oxigenului molecular.
Datorită însuşirii de oxidare a fenolilor se utilizează, în ultimul timp şi în tratamentul
enzimatic al materialelor lignocelulozice, lacaza fiind capabilă să catalizeze reacţii de oxidare ale
substraturilor fenolice uşor oxidabile din structura ligninei.
-Complex enzimatic VISCOFLOW MG, care conţine conţine beta-glucanaze, xilanaze,
arabino-xilanaze, pentozanaze, celulaze şi hemicelulaze.

33
 Viscoflow MG., achiziţionat de la Grama Trading (Sibiu, România), este produs prin
fermentare submersă de catre specii selectate de Aspergillus aculeatus, Humicola şi Bacillus.

3. Drojdia utilizată la fermentare pentru producerea de bioetanol este o suşă, notată cu T 2,

din specia Saccharomyces cerevisiae (Catedra de Microbiologie, Facultatea de Biotehnologii).

2.2. METODE DE LUCRU

1. Pretratamentul mecanic
Înaintea celorlalte tratamente, materialele lignocelulozice - paiele de grâu şi ştiuleţii de
porum au fost supuse unui tratament mecanic de mărunţire, la dimensiuni mici, cu scopul
creşterii suprafeţei de acţiune a celorlalte tratamente (chimice, enzimatice).

2. Pretratamentul termic
Inainte de tratamentul termic, au fost realizate soluţii de 3% (3 g material la 100 ml apă)
din paiele de grâu şi ştiuleţii de porumb, mărunţite anterior.

34
 Tratamentul termic a constat în tratarea materialelor lignocelulozice, sub formă de
soluţie, la 1210C, în autoclav, timp de 30 minute . După autoclavare, soluţia a fost centrifugată şi
s-a determinat conţinutul în glucide reducătoare.

3. Pretratamentul chimic
Tratamentele chimice sunt multiple şi variate, de la exploziile cu abur sau CO 2 la
tratamentele chimice cu acizi (sulfuric, clorhidric, fosforic) sau tratamentele alcaline (hidroxid de
sodiu, sulfit de amoniu, amoniac), precum şi tratamente cu gaze: dioxid de clor, dioxid de azot,
dioxid de sulf etc).
In studiile noastre s-au realizat 2 tipuri de tratamente chimice:
-tratament acid, cu acid fosforic (H3PO4);
-tratament alcalin, cu NaOH

Supernatantele rezultate în urma tratamentului mecanic şi termic au fost tratate cu acid

fosforic, respectiv cu hidroxid de sodiu, până la atingerea unui pH de 3 (în cazul tratamentului
acid), respectiv de 12 (în cazul tratamentului alcalin).
Supernatantele tratate chimic au fost menţinute, sub agitare la 220 rpm, timp de 120 de
minute, pentru desăvârşirea reacţiilor chimice.

4. Pretratamentul enzimatic
Pretratamentul enzimatic a constat din tratamentul supernatantelor rezultate de la
tratamentele anterioare, cu lacază.
Pentru acest pretratament enzimatic, a fost necesară corectarea pH-ului soluţiilor, la o
valoare de pH = 6, valoare necesară unei activităţi optime a enzimei. Corecţia s-a făcut cu
NaOH, respectiv cu H3PO4.

Pregătirea soluţiilor s-a realizat astfel:

-corectarea pH-ului, la pH = 6;
-adăugarea de lacază, în concentraţie de 1% (din greutatea materialului vegetal uscat);
-tratarea termică a soluţiilor, la 55°C, sub agitare la 220 rpm, timp de 18 ore;

35
 -ridicarea temperaturii de la 55°C la 95°C, timp de 15 minute (în vederea inactivării
lacazei).
După răcire, s-au determinat glucidele reducătoare din supernatante.

5. Tratamentul enzimatic cu complexul de enzime VISCOFLOW MG

Tratamentul enzimatic final, a avut ca scop hidroliza enzimatică a celulozei,
hemicelulozei şi ligninei, glucanilor etc, complexul enzimatic conţinând o serie de enzime ca:
beta-glucanaze, xilanaze, arabino-xilanaze, pentozanaze, celulaze şi hemicelulaze.

Pregătirea soluţiilor s-a realizat astfel:

-corectarea pH-ului, tot la pH = 6;
-adăugarea de complex enzimatic, în concentraţie de 1% (din greutatea materialului
vegetal uscat) în supernatantele pretratate mecanic, termic, chimic şi enzimatic;
-tratarea termică a soluţiilor, la 55°C, sub agitare la 220 rpm, timp de 4 ore.
In soluţiile răcite au fost determinate concentraţiile de glucide reducătoare.

6. Fermentarea soluţiilor zaharate (care conţin glucide fermentescibile)

Soluţiile hidrolizate, conţinând zaharuri fermentescibile, au fost inoculate cu suşa de
Saccharomyces cerevisiae şi supuse fermentaţiei alcoolice, pentru detrminarea concentraţiei
alcoolice a acestora.

Pregătirea soluţiilor s-a realizat astfel:

a. Prepararea mediilor de cultură pentru fermentaţie:

Compoziţie:
-100 ml de supernatant provenit din tratamentele anterioare (fizic, chimic, enzimatic);
-0,4% extract de drojdie (raportat la volumul de supernatant);
-0,4% (NH4)2SO4 (raportat la volumul de supernatant);
-0,2% KH2PO4 (raportat la volumul de supernatant).

36
 Mod de lucru:
-se corectează pH-ul cu soluţie de NH3 25% sau HCl 2N la valoarea 4,5;
-se sterilizează la 1150C, timp de 15 minute.

b. Insămânţarea cu drojdii:
Mod de lucru:
-răcirea mediilor pregătite anterior;
-însămânţarea cu Saccharomyces cerevisiae, în doză de 10%;

c. Fermentaţia alcoolică
Probele au fost menţinute în incubator, la 28°C, pe o durată de 72 de ore.
In urma fermentaţiei alcoolice, s-a determinat concentraţia în alcool etilic a probelor.

2.3. ANALIZE REALIZATE

1. Determinarea substanţei uscate

Pentru determinarea substanţei uscate s-a procedat astfel:
-a fost prelevat un volum exact din suspensiile cu materiale lignocelulozice (după o
agitare prealabilă);
-s-a cântărit acest volum la balanţa electronică;
-se usucă volumul de soluţie cântărit.
-se calculează substanţa uscată după formula:

s.u. (%) = greutatea finală (g) x 100 / greutatea iniţială (g)

2. Determinarea glucidelor reducătoare

Pentru determinarea concentraţiei în glucide reducătoare s-a utilizat metoda
spectrofotometrică, bazată pe reacţia de culoare a glucidelor reducătoare cu reactivul acid
dinitrosalicilic (DNS); s-a utilizat spectrometrul UV VIS.

37
 Modul de lucru:
-într-o eprubetă se introduc 0,5 ml de probă şi 3 ml reactiv DNS;
-eprubeta se menţine timp de 5 min într-o baie de apă, la temperatura de fierbere;
-se răceşte la temperatura camerei şi se diluează cu 20 ml apă distilată;
-se citeşte absorbanţa soluţiei la λ=540 nm faţă de o probă de apă distilată.
Concentraţia în glucide reducătoare se determină pe baza curbei de etalonare pentru
glucoză.

Trasarea curbei de etalonare pentru glucoză:

Se prepara o soluţie stoc de glucoză de 10 mg/ml (soluţie A) din care se fac următoarele
diluţii:

Tampon Concentraţie
Nr. Soluţie A
citrat glucoza
crt. (ml)
(ml) (mg/ml)
1 0,5 1 3,33
2 0,5 2 2,00
3 0,5 2,5 1,67
4 0,5 4,5 1,00

Din fiecare probă cu soluţie A diluată se pipetează astfel:

38
 Sol. A Tampon

Diluare cu 20 ml AD
Nr. DNS
diluată citrat
crt. (ml)
(ml) (ml)

Fierbere 5 min
1 0,5 0,5 3

Citire E λ=540
2 0,5 0,5 3
3 0,5 0,5 3
4 0,5 0,5 3
5 - 1,0 3

Valorile obţinute se reprezintă grafic pe hârtie milimetrică notând pe ordonată extincţia,

iar pe abscisă concentraţia de glucoză.

3. Determinarea conţinutului în alcool în mediul de fermentaţie

Determinarea concentraţiei alcoolice s-a realizat prin metoda distilării simple, cu ajutorul
aparatului de distilare.
Principiul metodei se bazează pe separarea alcoolului din vin prin distilare şi apoi
determinarea concentraţiei alcoolice pe cale densimetrică (cu alcoolmetrul).
Cuprinde următoarele operaţii:
- distilarea soluţiei;
- determinarea densităţii relative a amestecului hidroalcoolic;
- calculul concentraţiei alcoolice.

2.4. VARIANTE DE LUCRU

Pretratament termic
V1 – coceni de porumb
V2 – paie de grâu
Pretratament chimic
V1A – coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină ;
V1 Ac - coceni de porumb trataţi cu acid ;
V2 A – paie de grâu tratate cu soluţie alcalină ;
39
V2 Ac - paie de grâu tratate cu acid.
Pretratament enzimatic cu lacază
V1AL – coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină şi lacază ;
V1 AcL - coceni de porumb trataţi cu acid şi lacază ;
V2 AL– paie de grâu tratate cu soluţie alcalină şi lacază ;
V2 AcL - paie de grâu tratate cu acid şi lacază.
Tratament enzimatic cu complex enzimatic
A – coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină, lacază şi complex enzimatic ;
B - coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină şi complex enzimatic ;
C - coceni de porumb trataţi cu acid, lacază şi complex enzimatic ;
D - coceni de porumb trataţi cu acid şi complex enzimatic ;
E – paie de grâu tratate cu soluţie alcalină, lacază  şi complex enzimatic ;
F – paie de grâu tratate cu soluţie alcalină şi complex enzimatic ;
G - paie de grâu tratate cu acid, lacază şi complex enzimatic ;
H - paie de grâu tratate cu acid şi complex enzimatic.

40
 CAPITOLUL III
REZULTATE ŞI INTERPRETAREA DATELOR

1. Determinarea substanţei uscate

Substanţa uscată s-a determinat aşa cum sa- arătat în capitolul precedent, rezultatele fiind
redate în tabelul 3.1.

Tabel 3.1
Conţinutul în substanţă uscată a reziduurilor lignocelulozice

Material lignocelulozic Conţinut în substanţă uscată (%)

Coceni de porumb 85
Paie de grâu 83

2. Determinarea glucidelor reducătoare după tratamentul mecanic

Materialele lignocelulozice au fost mărunţite şi s-a determinat conţinutul iniţial în glucide
reducătoare (fig. 3.1).

3. Influenţa pretratamentului termic asupra conţinutului în glucide reducătoare a

materialelor lignocelulozice
Scopul acestui pretratament a fost influenţa pe care o are tratamentul termic asupra
creşterii concentraţiei în glucide reducătoare şi ulterior, influenţa acestuia asupra succeptibilităţii
materialelor lignocelulozice la atacul complexului enzimatic.
Experimentele s-au realizat conform protocolului arătat în capitolul Materiale şi Metode
de lucru. Determinările s-au efectuat separat pentru fiecare tip de material lignocelulozic, iar
rezultatele obţinute sunt prezentate în tabelul 3.2 şi fig. 3.1.

Tabelul 3.2
41
 Influenţa tratamentului termic asupra creşterii concentraţiei în glucide reducătoare
Material Concentraţia în glucide reducătoare
Varianta E λ=540
lignocelulozic mg/ml % material lignocelulozic
Coceni de porumb V1 0.090 0.21 0.66
Paie de grâu V2 0.078 0.17 0.54
V1 – coceni de porumb
V2 – paie de grâu

Figura 3.1 Concentraţia în glucide reducătoare a materialelor lignocelulozice, în urma

pretratamentului termic

După cum se poate observa din fig. 3.1 tratamentul termic influenţează uşor creşterea în
glucide reducătoare, în cazul ambelor variante.

42
 4. Influenţa pretratamentului chimic asupra conţinutului în glucide reducătoare a
materialelor lignocelulozice
Supernatantele rezultate în urma tratamentului termic au fost supuse tratamentului
chimic, atât unui tratament alcalin, cu NaOH, cât şi tratamentului acid, cu acid fosforic.
Experimentele au urmărit creşterea conţinutului în glucide reducătoare; rezultatele
tratamentului sunt redate în tabelul 3.3 şi fig. 3.2.

Tabelul 3.3
Influenţa tratamentului chimic asupra creşterii concentraţiei în glucide reducătoare
Concentraţia în glucide reducătoare
Material
Varianta E λ=540 concentraţia iniţială după tratament
lignocelulozic
% %
Coceni de porumb V1A 0.155 0.66 1.13
Coceni de porumb V1 Ac 0.192 0.66 1.31
Paie de grâu V2 A 0.149 0.54 1.07
Paie de grâu V2 Ac 0.153 0.54 1.17
V1A – coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină ;
V1 Ac - coceni de porumb trataţi cu acid ;
V2 A – paie de grâu tratate cu soluţie alcalină ;
V2 Ac - paie de grâu tratate cu acid

Din fig. 3.2 se poate observa influenţa tratamentului chimic asupra concentraţiei în
glucide; astfel, atât tratamentul alcalin cât şi cel acid a avut influenţă pozitivă asupra creşterii
conţinutului în glucide reducătoare. Totuşi, dintre cele 2 tratamente chimice, cel acid a condus la
o hidroliză mai avansată, iar dintre cele 2 materiale lignocelulozice, cocenii de porumb au fost
materialele care au răspuns mai bine tratamentului.

43
 Figura 3.2 Influenţa tratamentului chimic asupra creşterii concentraţiei în glucide
reducătoare (%)

5. Influenţa tratamentului enzimatic cu lacază asupra conţinutului în glucide

reducătoare a materialelor lignocelulozice
Tratamentul enzimatic cu lacază a avut ca scop evidenţierea influenţei asupra creşterii
concentraţiei în glucide reducătoare şi pregătirii materialului pentru tratarea cu complexul
enzimatic.
Tratamentul cu lacază s-a realizat conform protocolului arătat în capitolul precedent.
Rezultatele tratamentului sunt arătate în tabelul 3.4 şi fig. 3.3.

44
 Tabelul 3.4
Influenţa tratamentului enzimatic cu lacază asupra creşterii concentraţiei în glucide reducătoare
Concentraţia în glucide reducătoare
Material
Varianta E λ=540 concentraţia iniţială după tratament
lignocelulozic
% %
Coceni de porumb V1AL 0.185 1.13 1.20
Coceni de porumb V1 AcL 0.202 1.31 1.45
Paie de grâu V2 AL 0.202 1.07 1.47
Paie de grâu V2 AcL 0.259 1.17 1.75
V1AL – coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină şi lacază ;
V1 AcL - coceni de porumb trataţi cu acid şi lacază ;
V2 AL– paie de grâu tratate cu soluţie alcalină şi lacază ;
V2 AcL - paie de grâu tratate cu acid şi lacază.

Figura 3.3 Influenţa tratamentului enzimatic cu lacază asupra creşterii concentraţiei

în glucide reducătoare

45
 Din fig 3.3 se observă că tratamentul enzimatic cu lacază a influenţat şi el creşterea
conţinutului în glucide reducătoare, dar cu valori mai mici decât în cazul tratamentului chimic; în
cazul tratamentului cu lacază, paiele de grâu au reacţionat mai bine în comparaţie cu cocenii de
porumb, creşterea fiind mai mare la aceste materiale lignocelulozice.
Totuşi, rolul important al tratamentului enzimatic cu lacază nu este creşterea concentraţiei
în glucide cât, mai ales slăbirea legăturilor moleculelor de poliglucide (lignină, celuloză,
hemiceluloză) şi vulnerabilizarea lor în vederea hidrolizei cu un complex enzimatic.

6. Influenţa tratamentului enzimatic cu complex enzimatic asupra conţinutului în

glucide reducătoare

Supernatantele tratate în prealabil, termic, chimic şi enzimatic cu lacază, au fost supuse

unui tratament enzimatic cu un complex enzimatic VISCOFLOW MG, complexul enzimatic
conţinând o serie de enzime ca: beta-glucanaze, xilanaze, arabino-xilanaze, pentozanaze,
celulaze şi hemicelulaze.
Tratamentul enzimatic final, a avut ca scop hidroliza enzimatică a celulozei,
hemicelulozei şi ligninei, glucanilor etc,
Protocolul de lucru a fost descris în capitolul Materiale şi Metode de lucru.
Variantele utilizate au fost:

A – coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină, lacază şi complex enzimatic ;

B - coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină şi complex enzimatic ;
C - coceni de porumb trataţi cu acid, lacază şi complex enzimatic ;
D - coceni de porumb trataţi cu acid şi complex enzimatic ;
E – paie de grâu tratate cu soluţie alcalină, lacază  şi complex enzimatic ;
F – paie de grâu tratate cu soluţie alcalină şi complex enzimatic ;
G - paie de grâu tratate cu acid, lacază şi complex enzimatic ;
H- paie de grâu tratate cu acid şi complex enzimatic.

46
 Tabelul 3.5
Influenţa tratamentului enzimatic cu complex enzimatic VISCOFLOW MG asupra
creşterii concentraţiei în glucide reducătoare
Concentraţia în glucide reducătoare
Material
Varianta E λ=540 concentraţia iniţială după tratament
lignocelulozic
% %
Coceni de porumb A 0.438 1.20 3.55
Coceni de porumb B 0.249 1.13 1.98
Coceni de porumb C 0.480 1.45 3.77
Coceni de porumb D 0.251 1.31 2.10
Paie de grâu E 0.784 1.47 5.95
Paie de grâu F 0.510 1.07 3.89
Paie de grâu G 0.859 1.75 6.58
Paie de grâu H 0.650 1.17 4.95
A – coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină, lacază şi complex enzimatic ;
B - coceni de porumb trataţi cu soluţie alcalină şi complex enzimatic ;
C - coceni de porumb trataţi cu acid, lacază şi complex enzimatic ;
D - coceni de porumb trataţi cu acid şi complex enzimatic ;
E – paie de grâu tratate cu soluţie alcalină, lacază  şi complex enzimatic ;
F – paie de grâu tratate cu soluţie alcalină şi complex enzimatic ;
G - paie de grâu tratate cu acid, lacază şi complex enzimatic ;
H- paie de grâu tratate cu acid şi complex enzimatic.

47
 Figura 3.4 Influenţa tratamentului enzimatic cu complex enzimatic VISCOFLOW MG
asupra creşterii concentraţiei în glucide reducătoare

Din fig. 3.4 se observă o creştere substanţială a concentraţiei în glucide reducătoare a

soluţiilor în urma hidrolizei poliglucidelor specifice materialelor lignocelulozice, ceea ce era de
aşteptat. Din analiza datelor se poate spune totuşi, că procesul de hidroliză s-a desfăşurat
diferenţiat, în funcţie de pretratamentele prealabile.
Asttfel, tratamentul enzimatic cu lacază a avut o influenţă foarte mare, creşterile în cazul
ambelor materiale lignocelulozice fiind semnificative.
In ceea ce priveşte hidroliza în funcţie de materialul de start, se observă că paiele de grâu,
au reacţionat mai bine la hidroliză în comparaţie cu cocenii de porumb, ceea ce s-a întâmplat şi
în cazul tratamentului chimic şi al tratamentului cu lacază.

48
 7. Influenţa pretratamentelor fizico-chimice şi enzimatice asupra diferitelor substraturi
glucidice analizate

Figura 3.5 Influenţa pretratamentelor chimic alcalin şi enzimatic asupra

cocenilor de porumb

După cum se observă din fig. 3.5 şi 3.6, aplicarea pretratamentelor fizico-chimice şi
enzimatice au condus la o creştere semnificativă a concentraţiei în glucoză rezultată după
hidroliza enzimatică. Cele mai mari creşteri, în urma hidrolizei s-au înregistrat totuşi, în cazul
pretratamentului acid.
Acelaşi fenomen s-a înregistrat şi în cazul paielor de grâu, cu creşteri semnificative tot în
cazul tratamentului acid; diferenţa dintre cele două materiale lignocelulozice există, o hidroliză
enzimatică avansată înregistrându-se în cazul paielor de grâu (fig. 3.7 şi 3.8).
Se poate spune că pretratamentele fizice şi chimice aplicate materialelor lignocelulozice
au consecinţe favorabile, pentru creşterea prealabilă a concentraţiei în glucide reducătoare
precum şi pentru slăbirea legăturilor poliglucidelor, în vederea hidrolizei.

49
 Figura 3.6 Influenţa pretratamentelor chimic acid şi enzimatic asupra
cocenilor de porumb

Figura 3.7 Influenţa pretratamentelor chimic alcalin şi enzimatic asupra

paielor de grâu

50
 Figura 3.8 Influenţa pretratamentelor chimic acid şi enzimatic asupra
paielor de grâu

Cel mai bun tratament chimic, în cazul ambelor materiale a fost tratamentul acid, cu acid
fosforic.
Pretratamentul enzimatic cu lacază, deşi nu a condus la creşteri semnificative de glucide
dar a avut o influenţă semnificativă asupra hidrolizei ulterioare cu complexul enzimatic.

7. Caracterizarea procesului fermentativ de obţinere a bioetanolului cu Saccharomyces

cerevisiae
Supernatantele pretratate termic, chimic şi enzimatic şi hidrolizate cu un complex
enzimatic (pe bază de glucanaze, xilanaze, arabino-xilanaze, pentozanaze, celulaze şi
hemicelulaze) au fost supuse procesului fermentativ, cu o suşă de Saccharomyces cerevisiae, în
condiţii aseptice.
Fermentaţiile s-au realizat separat pentru fiecare tip de material lignocelulozic şi variantă
de lucru; în urma procesului fermentativ s-a determinat concentraţia alcoolică în probe,
rezultatele fiind prezentate în fig. 3.9.

51
 Figura 3.9 Concentraţia alcoolică a soluţiilor hidrolizate

Din fig. 3.9 se poate observa că randamentele cele mai ridicate în procesul de fermentaţie
alcoolică au fost obţinute în cazul paielor de grâu, în cazul hidrolizei cu pretratament acid,
variantă ce conţinea şi cea mai mare cantitate de glucide reducătoare.

CONCLUZII

Cercetările experimentale care au stat la baza acestei lucrări au vizat stabilirea condiţiilor
optime de disponibilizare a substraturilor glucidice fermentescibile prezente în reziduuri
52
lignocelulozice din agricultură (coceni de porumb şi paie de grâu), folosind atât tratamente
fizico-chimice, cât şi tratamente enzimatice.
Sistemele enzimatice aplicate au vizat un pretratament cu lacază, urmat de hidroliza
materialelor cu un complex de enzime, care conţine, în principal beta-glucanaze, xilanaze şi
celulaze.

1. Cele mai bune rezultate s-au obţinut atunci când pretratamentul s-a realizat în două etape:
-o etapă de pretratare neenzimatică, care include un tratament fizic şi chimic(pentru a
micşora gradul de rezistentă a substraturilor lignocelulozice;
-o etapă de tratament enzimatic, cu lacază;
2. Tratamentele chimice au avut un rol foarte important în reuşita procesului de hidroliză,
dintre cele două tratamente testate pretratarea chimică cu acid, dovedindu-se mult mai
eficientă decât cea alcalină;
3. Rolul cel mai important pentru hidroliza enzimatică a materialelor lignocelulozice testate,
l-a avut pretratamentul enzimatic cu laccază; pretratamentul a condus la o vulnerabilizare
semnificativă a substraturilor lignocelulozice la atacul complexului de enzime din
produsul enzimatic VISCOFLOW MG;
4. Cele mai bune rezultate la hidroliza cu complex enzimatic s-a înregistrat în cazul paielor
de grâu, pretratate termic şi chimic cu acid;
5. Randamentele în fermentaţia alcoolică cele mai ridicate au fost obţinute în cazul paielor
de grâu, în varianta tratată chimic cu acid şi enzimatic cu lacază, care conţineau şi cea mai
mare cantitate de glucide reducătoare.

Bibliografie

1. Anghel, I. Biologia şi tehnologia drojdiilor, Editura Tehnică, Bucureşti, 1993

53
 2. Banu, C. (coordonator). Tratat de ştiinţa şi tehnologia maltului şi berii, vol. 1,
Editura AGIR, 2000.
3. Banu, C, ş.a. Biotehnologii în industria alimentară, Editura Tehnică, Bucureşti, 2000
4. Banu, C, ş.a. Bioalcoolul-combustibilul viitorului, Editura Agir, Bucureşti, 2006
5. Biofuel Production throgh yeast fermentation. www.marietta.edu /bio /introlab
/biofuel
6. Comea, C. P.,. Niculiţă, P. Bazele microbiologice ale biotehnologiilor, Editura
Printed, Bucureşti, 2005
7. Dourado F, Bastos M, Mota M, Gama FM (2002). Studies on theproperties of
Celluclast/Eudragrit L-100 conjugate. J. Biotechnol.
8. E, Johnson PE, Creagh AL, et al. (2000). Structure and bindingspecificity of the
second N-terminal cellulose-binding domain from Cellulomononas fimi endoglucanase C
Biochemistry
9. Gupta R, Beg QK, Lorenz P (2002). Bacterial alkaline proteases: molecular
approaches and industrial applications. Appl. Micobiol. Biotechnol.
10. Montane D, Salvado J, Torras C, Faniol X (2002). High-temperature dilute-acid
hydrolysis of olive stones for furfural production. Biomass Bioenergy
11. Pele, M., Niculiţă, P. Biotehnologie, Editura Ceres, Bucureşti, 2005
12. Prates JAM, Tarbouriech N, Chamock SJ, et al., (2001). The structure of the
feruloyl esterase module of xylanases 10B from Clostridium thermoceiium provides insight
into substrate recognition
13. Priefert H, Rabenhorst J, SteinbCichel A (2001). Biotechnological production of
vanillin. Appl. Microbiol. Biotechnol
14. Rosales E, Couto SR, Sanroman A (2002). New uses of food waste: application
to laccase production by Trametes hisuta. Biotechnol.
15. Shallom D, Shoham Y (2003). Microbial hemicellulases. Curr. Opin. Microbiol.
16. Sun Y, Cheng J (2002). Hydrolysis of Hgnocellulosic material from ethanol
production: A review. Biores. Technol.
17. Walton NJ, Mayer MJ, Narbad A (2003). Molecules of interest: Vanillin.
Phytochemistry

54
 18. Withers SG (2001). Mechanisms of glycosyl transferases and hydrolases.
Carbohydr. Polym.
19. Yeast (from Wikipedia, the free encyclopedia): http:/ en.wikipedia.org. /wiki
/yeast
20. http://en.wikipedia.org/wiki/Ethanol_fuel
21. http://www.agir.ro/buletine/290.pdf
22. http://www.biocombustibil-tm.ro/prezentare.html
23. http://www.esru.strath.ac.uk/EandE/Web_sites/02-03/biofuels/
what_bioethanol.html

55