Biotehnologia mediului

Biotehnologia are ca obiect utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei i ingineriei pentru ob inerea de bunuri industriale, agricole, protec ia s n t ii sau protec ia mediului folosind poten ialul microorganismelor, celulelor animale sau vegetale cultivate sau unor p r i ale acestora

Obiective: 1. Eliminarea polu rii existente n mediu (ap , sol, aer), prin detec ia contaminan ilor i bioremediere.
Etapele reduceri i polu rii: - determinarea naturii compu ilor chimici poluan i - determinare concentra iei acestora - alegerea metodei de bioremediere - tratamentul i ndep rtarea poluan ilor din mediu prin metoda aleas Monitorizarea polu rii: bioindicatori, biomarkeri

Bioindicatori
Utilizarea trandafirilor ca bioindicatori pentru prezen a unor patogeni ai vi ei de vie

Utilizarea unor bacterii ca bioindicatori pentru pH-ul apei

Organismele (sau popula iile de organisme) pot oferi informa ii despre poluarea mediului sau cantitatea unor poluan i care se g sesc n mediu, prin apari ia unor modific ri fiziologice, chimice, sau comportamentale. Aceste informa ii pot fi ob inute prin studierea: Con inutului n anumite elemente sau compu i chimici Structurii celulare sau morfologiei Modific rii unor procese metabolice sau biochimice Comportamentului Structurii popula iei

Biomarkeri
Biomarkerii reprezint caracteristici fiziologice, biochimice sau moleculare care permit monitorizarea n mediu a unor organi sme care sunt afectate de prezen a poluan ilor.

Imaginea microscopic a unor celule de Arthrobacter, con innd gena gfp, n sol

2. Tratarea poluan ilor rezulta i din procese industriale, agricole sau casnice c ror prezen nu poate fi prevenit .
Bioremedierea poate fi inclus ca etap tehnologic distinct nainte ca apele sau gazel e reziduale rezultate s fie eliminate n mediu. Exemple: - epurarea bi ologic a apelor reziduale casnice i a celor provenite din anumite industrii (alimentar ) - degradarea cu mi croorganisme a hi drocarburilor care ar putea po lua mediul Xenobiotice - compu i organici care nu sunt prezen i n natur - eliminarea prin bioremediere a poluan ilor de natur gazoas : bioxid de sulf, oxizi de azot, bi oxid de carbon - biofiltre Reducerea efec tului de ser !

3. Reducerea sau eliminarea surselor de agen i poluan i

Este de preferat s fie aplicate procese care s nu fie nso ite de formarea unor compu i cu efect poluant asupra mediului, dect s fie necesar dup aceea degradarea pol uan ilor respectivi.

Exemple de tehnologii nepoluante sau cu poluare redus Procese biocatalitice : folosirea enzimelor sau bacterii lor pentru a ob ine anumite produse chi mice: peniciline, aminoacizi, medicamente Avantaje: - folosirii unor materii prime rennoibile - reducerea energiei necesare proc esului - enzimele sau bacteriile sunt biodegradabile, spre deosebire de catalizatorii chimici. Biopolimeri ob inu i cu ajutorul microorganismelor Reducerea emisiilor de CO 2 prin folosirea surselor de energie alternative, bazate pe biotehnologii, pentru a nlocui resursele fosile de energie

Microorganisme utilizate n biotehnologii

Condi ii pentru ca o struc tur s poat fi considerat form de via :
s posede o membran celular care s o diferen ieze de mediul nconjur tor s fie capabil s se reproduc s fie capabil s realizeze ni te activit i biochimice cunoscute sub denumirea de metabol ism s con in ADN, ARN i proteine Microorganisme - acele organisme a c ror m rime este mai mic de 0,1 mm i nu sunt vizibile cu ochiul liber 1. Procariote - nu au nucleu individualizat i nici membran nuclear viru i, bacterii alge albastre, arheobacterii 2. Eucariote -organisme mai evoluate care au nucleu nuclear strict individualizate fungii, drojdii i membran -

Bacterii
Organisme unicelulare formate di ntr-o mas protoplasmatic , m rginit de o membran rigid , f r a avea un nuc leu definit. Forma: sfere (coci), bastona e (bacili), spirale (spirili) Dimensiuni: 0,5-10 m, uzual n jur de 2 m

Structura celular a unei procariote

Fungii (mucegaiuri)
Organisme eucariote filamentoase Caracteristici: au aparat vegetati v (tal) bine diferen iat n membran , citoplasm i nucleu formeaz micelii (re ele de hife) se dezvolt prin nmugurire n mod nelimitat, iar nmul irea are loc prin sporulare

Hif

Conidii de Penicillium

Drojdii
Ciuperci unicelulare, care se g sesc mai ales n sol Caracteristici: se pot nmul i prin diviziune (nmugurire) i prin spori. form rotund , eliptic sau alungit dimensiuni cuprinse ntre 4-20 m

Celul de drojdie (imagine microscopic )

Alge

Alge verzi

Alge ro ii

Selectarea i ameliorarea microorganismelor

Etapele select rii i amelior rii microorganismelor Izolarea microorganismului sau alegerea s a din colec iile de culturi Testarea microorganismului prin realizarea unor culturi pure sau mixte Ameliorarea microorganismului prin mutagenez sau inginerie genetic Factorii de care depinde dezvoltarea microorganismelor Factori fizici: temperatura, lumi na, umiditatea, presiunea hidrostatic , agitarea, radia iile electromagnetic e Factori chimici : concentra ia substan elor nutritive anorganice i organice din mediu, aciditatea mediului, prezen a oligoelementelor i factorilor de cre tere, concentra ia metaboli ilor i substan elor toxice Factori biologici : organismele inferioare sau superioare existente n mediul respectiv Rela iile posibile cu alte organisme: simbioz , metabioz , antagonism, neutralism

Ameliorarea microorganismelor prin mutagenez i inginerie genetic

Mutan ii - indivizi care difer de popula ia speciei prin una sau mai multe caracteristici, care se transmi t ereditar. Mutagenez indus - folosirea de agen i mutageni fizici (radia iile ultraviolete) sau chimici (etilenimina) Ingineria genetic - modificarea material ului genetic (ereditar) al organismului n scopul elimin rii unor caracteristici nedorite i inducerii altora dorite Tehnica ADN recombinat - una sau mai multe gene ale unui organism sunt izolate i introduse ntr-un alt organism Acidul dezoxiribonucleic (ADN) - macromolecul cu schelet polinucleotidic i form de dublu helix care con ine ntr-o form codificat informa ia necesar sintezei proteinelor i enzimelor, ct i pe cea privind replicarea material ului genetic necesar asigur rii reproducerii. Gena - un segment di n macromolecula de ADN care ac ioneaz ca unitate func ional i con ine informa ia necesar sintezei unei catene polipeptidice

Structura ADN

Obiectivele ingineriei genetice

1. Inserarea unei singure gene str ine ntr-un alt organism, pentru a-i conferi acestuia o caracteristic nou 2. Modificarea felului n care ac ioneaz o gen existent n organismul dat, avnd ca rezultat schimbarea anumitor caracteristici ale organismului respectiv 3. Inserarea unei gene n organismul gazd , astfel ca acesta s produc un compus anumit pe care nu l produce n condi ii normale, n general o protein Organisme modificate genetic (GMO)

Factorii care influen eaz dezvoltarea microorganismelor

a. Apa
disponibilitatea apei n sistem - activitatea apei pH-ul s rurile con inute posibilii contaminan i prezen i

b. Oxigenul
Clasificarea microorganismelor n func ie de comportarea lor fat de oxigen: v aerobe v anaerobe Variante intermediare - microaerofile - anaerobe facultative

c. Surse de energie i nutrien i

Metabolism - totalitatea reac iilor care au loc n celule avnd ca scop generarea energiei i formarea componentelor necesare celulei - anabolism - catabolism Tipuri de metabolism celular Fotoautotrofie - folosirea energiei solare ca surs de energe i bioxid de carbon pentru construirea celulelor Ex: plantele i algele Fotoheterotrofie - sursa de energie este tot energia solar , ns componentele celulei sunt construite pe seama unei surse de carbon organic Ex: bacteriile verzi nesulfuroase Chemoautotrofie - organismele care i procur energia din substan e anorganice iar ca surs de carbon folosesc bioxid de carbon Ex: bacteriile nitrifiante Chemoheterotrofie - utilizarea compu ilor organici att ca surs de carbon ct i de energie. Ex: majoritatea bacteriilor i eucariotelor (fungii, drojdii, animale)

Metabolismul microorganismelor chemoheterotrofe

v Degradarea catabolic a hidra ilor de carbon cu structur mai complex la glucoz , care este apoi degradat la rndul ei la bioxid de carbon i ap , cu eliberare de energi e. v Energia metaboli c rezultat este nmagazinat sub form de ATP

Metabolismul aerob substraturile organice sunt transformate in procese care au loc n mai multe etape ntr-o serie de produse cu struc tur mai complex : acid citric, acid glutamic, lizin , proteine bioactive, antibiotice, biostimulatori, etc. sunt intens exoterme Metabolismul anaerob (fermenta ii) n general sunt nso ite de degajarea unui gaz (bi oxid de carbon) produc mai pu in energie dect n cele aerobe produ ii de fermenta ie ob inu i au n general cifr de oxidare mic i pot fi ob inu i pe mai multe c i metabolice: - fermenta ia alcoolic - rezult alcool etilic i bioxid de carbon - fermenta ia lactic - rezult acid lactic - metanogenez a - rezult metan ( i bioxid de carbon)

Principalele componente nutritive

Apa Sursa de energie (sursa de carbon): amidon (din porumb, gru, orez, cartofi i altele), melas Sursa de azot: azot anorganic (azota i, s ruri de amoniu) sau azot organic (aminoacizi, proteine) extract de porumb, f in i rot de soia, f in din semin e de bumbac, f in din germeni de porumb Compu i minerali: fosfat, sulfat, clorur , calciu, magneziu, sodiu, potasiu fosfat monopotasic, sulfat de magneziu, clorur de potasiu, carbonat de calciu - microelemente: fier, zinc, cupru, cobalt, mangan Factori de cre tere: vitamine, hormoni

d. Temperatura
Optimul de temperatur al majorit ii microorganismelor: 30 -37C de cre tere ntre 15-45C:

Microorganisme mezofile - au temperatura optim

Microorganisme capabile s tr iasc n condi ii de temperatur extreme: psichrofile - au optimul de temperatur la 15C i pot cre te la 0C sau chiar mai jos dac au la dispozi ie ap lichid termofile - au optimul de temperatur ntre 45-60C hipertermofile - capabile s creasc la temperaturi de 80-110C.

e. pH-ul
Valoarea optim de pH pentru cre terea microorganismelor se situeaz n domeniul neutru (in jur de 7,0) Tipuri care prefer condi ii acide sau alcaline: acidofile - nu pot cre te dect la valori de pH cuprinse ntre 1 i 4 alcalifile - cresc la valori pH de peste 9

Realizarea de condi ii sterile de cultivare

Sterilizarea termic : se face cu abur sau aer fierbinte Sterilizarea cu radia ii (UV, raze X, etc.): sterilizarea aerului din laboratoare biologice sau unele sec ii de fabrica ie Sterilizarea prin filtrare: mai ales pentru aerul destinat aer rii culturilor de microorganisme aerobe Sterilizarea chimic : pentru utilaje, rezervoare, hale de fabrica ie - substan e antiseptice - substan e dezinfectante

Dezvoltarea culturilor de microorganisme

nmul irea microorganismelor prin diviziune transversal

Fazele dezvolt rii unui microorganism

Faza de adaptare la mediu (sau lag = ntrziere n lb. englez ) - celulele cresc n volum i sintetizeaz proteinele i materialul genetic, dar nc nu se nmul esc. Faza cre terii exponen iale (sau log) - celulele se divid i are loc o cre tere constant a popula iei celulare care se dubleaz la intervale regulate, dup fiecare timp de genera ie. Popula ia este format din celule tinere, dar foarte sensibile la factori nocivi. Faza sta ionar (post-log) - datorit s r cuirii mediului n resurse nutritive cre terea este mult ncetinit . Num rul diviziunilor scade mult i pe ansamblu num rul de celule r mne constant. Celulele sunt ns mai mature, mai rezistente la factori nocivi i unele ncep s sporuleze. Faza de declin - majoritatea celulelor mor, celulele sunt b trne sporuleaz intens. i

Cinetica dezvolt rii microorganismelor

Calculul vitezei de cre tere

X t = X0 2N
Xt - num rul de celule prezente dup un anumit timp t X0 - num rul ini ial de celule N - num rul de dubl ri n intervalul de timp

t td td - timpul de dublare (timpul de genera ie) N=

X ln t = ln 2 t d X 0
t

ln X t - ln X 0 ln 2 0,693 = = t td td X t 0,693 ln X = t t d 0
este ecua ia unei drepte cu panta egal cu 0,693/t d care reprezint viteza de cre tere

Dependen a vitezei de cre tere de concentra ia substratului nutritiv. Ecua ia Monod

v = v max

CS K S + CS

vmax - viteza maxim de cre tere n condi ii optime Cs - concentra ia substratului Ks - constant care exprim afinitatea microorganismului pentru substratul
respectiv (concentra ia de substrat pentru care viteza de cre tere este jum tate din cea maxim )

Bioremedierea
Defini ia bioremedierii : procesul n care de euri de natur organic sau anorganic sunt degradate n condi ii controlate, pe cale biologic , pn la o form netoxic sau la un nivel de concentra ie admis de legisla ia in vigoare.

Contaminan i importan i
Clase de contaminan i
Solven i Pesticide Ierbicide Fungicide Insecticide Substan e petrochimice

Exemple reprezentative
cloroform, tetraclorur de carbon tricloretilen DDT, lindan atrazin , araclor, acid 2,4-diclorfenoxiacetic pentaclorfenol compu i organofosforici benzen, toluen compu i aromatici polinucleari

Surse posibile
uzine chimice cur torii chimice agricultur agricultur , uzine chimice tratamentul lemnului agricultur , uzine chimice, tratamentul lemnului aeroporturi, instala ii portuare, uzine petrochimice instala ii de gazeificare a c rbunilor, instala ii de producere i utilizare a gudroanelor zone miniere, zone militare uzine chimice uzine de prelucrare a minereurilor

Explozivi Fenoli i clorfenoli Metale grele

trinitrotoluen nitrofenol, clorfenol cadmiu, plumb, mercur

Evolu ia poluan ilor care ajung n mediu

POLUANTI

nevolatili

volatili

solubili in apa

insolubili in apa

se adsorb

nu se adsorb nedegradabil

solubili in lipide nedegradabil

insolubili in lipide

nereactivi

reactivi

Acumulare in sol

Acumulare in apa

Biodegradare

Acumulare in lantul trofic

Biodegradare

Acumulare in sol

Acumulare in atmosfera

Degradare

Eliminarea compu ilor poluan i din sol

Metode tradi ionale :
izolarea i acoperirea stratului contaminat ndep rtarea stratului contaminat i transportarea l ui ntr-un deponeu special

Metode fizico -chimice :

incinerarea v descompunerea chi mic (Ex: declorurarea catalizat de baze, oxidarea catalizat de radia ii UV)
v

Bioremedi ere
Controlul i optimizarea unui proces de bioremediere - identificarea popula iei microbiene capabile s degradeze pol uan ii respectivi, - identificarea accesibilit ii poluan ilor pentru degradare - asigurarea condi iilor pentru biodegradare (c ompozi ia i umiditatea solului, temperatur , pH, factori nutrien i, concentra ie de oxigen, concentra ii metale grele)

Microorganisme capabile s degradeze compu ii poluan i

Aerobe exemple: Pseudomonas, Alcaligenes, Sphingomonas, Rhodococcus i Mycobacterium. Pot degrada pes ticide, alcani, sau hidrocarburi aromatice i de multe ori pot utiliza asemenea compu i drept singura surs de carbon i energie. Anaerobe - Nu sunt la fel de mult folosite ca cele aerobe, dar exist anumite tipuri care au trezit mare interes . Exemplu: microorganismele care pot degrada compu i bifenilici policlorura i care se g sesc n sedimentele unor r uri. Fungii lignilolitice - Exemplu Phanaerochaete chrysosporium - pot cre te pe substraturi foarte comune ca paie sau coceni de porumb i pot degrada o mare varietate de contaminan i persisten i

Strategii de bioremediere
1. Folosire a de microo rganisme indigene 2. Stimulare a cre terii microorganismelor indig ene
favorizarea degrad rii aerobe
oxigen asigurarea unei cantit i suficiente de

temperatura mai ridicat va avea efect favorabil ad ugarea unor substan e fertilizante cu con inut de azot pH-ul solului - influen eaz att viteza de cre tere a microorganismelor
ct i solubilitatea i prin aceasta accesibilitatea compusului care trebuie degradat

controlul con inutului de metale grele

3. Bioaugmenta re - suplimentarea popula iei microbiene care exist

ntr-o zon contaminat , prin ad ugarea unui microorganism selec ionat, cu scopul de m ri viteza de degradare

4. Utilizarea de mic roorganisme manipulate gen etic

Tehnici de bioremediere
Tehnici in situ (adic la fa a
locului) Aratul solului - nivelul de oxigenare al solului cre te i contaminan ii vor fi dispu i n mod mai uniform Bioventila ia - favorizarea p trunderii aerului sau oxigenului n sol pentru a cre te activitatea biologic , concomitent cu evacuarea substan elor volatile

Tehnici de bioremediere - in situ

Biobarbotarea - injectarea de aer sub presiune sau oxigen pur n zona contaminat , care poate fi sol sau ap

Tehnici de bioremediere - ex situ

Excavarea i ndep rtarea solului contaminat Compostarea - combinarea solului contaminat excavat cu diferite de euri agricole sau forestiere u or biodegradabile i compostare conform tehnicii cunoscute Utilizarea bioreactoarelor Variante constructive : cu agitare, cu strat fix, cu strat fluidizat, cu n mol activ, vase cilindrice (tobe) rotative

Schema flux a bioremedierii solului contaminat, prin folosirea de microorganisme exogene, n bioreactor
Mediu de cultur (ap , nutrien i) abur aer transportul solului la bioreactor dezvoltarea culturii cultur de microorganisme

sol poluat
excavarea solului

sterilizare

aer

bioremedierea n bioreactor

ap , nutrien i

sol depoluat

Fitoremedierea
Defini ie: utilizarea plantelor pentru ndep rtarea
contaminan ilor i metalelor grele din sol i ap

Avantaje
Poate fi utilizat pentru eliminarea anumitor compu i toxici pe care microorganismele nu le pot degrada. Este considerat cu 50-80% mai ieftin dect alte alternative, Este superioar estetic Solul nu trebuie excavat

Dezavantaje
Durata mai mare a procesului , care necesit cteva cicluri de vegeta ie, Prezen a contamina ilor poate reduce considerabil viteza de cre tere a plantelor Plantele care au acumulat compu ii toxici pot reprezenta un pericol pentru viet ile s lbatice i pot ajunge n lan ul trofic.

Factor de bioconversie
Condi ii ca o plant s poat fi utilizat pentru fitoremedier e
s tolereze poluantul respectiv s aib vitez mare de cre tere i un randament ridicat pe hectar de cultur s acumuleze compusul toxic (n general un metal) de preferin n partea care se poate recolta s aib un factor de bioconversie ridicat

Defini ia factorului de bioconv ersie : concentra ia poluantului n plant

raportat la cea din mediu . Condi ia ca o contaminare s fie redus la mai pu in de 50% din valoarea ini ial n 10 recolte este ca planta respectiv s aib un factor de bioconversie de cel pu in 20.

Hiperacumulatori : plante care pot acumula de 50 -100 ori mai multe metale
dect plantele obi nuite (aproximativ 400 de specii cunoscute). Exemplu: Thlaspi caerulescens poate acumula 10 -15 g Zn /kg, dar produce numai 2-5 t biomas /ha

Modalit i pentru realizarea fitoremedierii

Fitoextrac ie (Fitoacumulare)

ndep rtarea contaminan ilor sau metalelor din sol i stocarea lor n plante Fitodegradare preluarea de c tre plante a compu ilor organici din sol, sedimente sau ape i degradarea lor Fitovolatilizare trecerea poluantului prin corpul plantei, fiind apoi volatilizat prin frunze Fitostabilizare transformarea unor specii moleculare n altele mai pu in toxice Fixarea unor poluan i gazo i din atmosfer de c tre plante

Biormedierea poluan ilor gazo i

a). Biofiltru

b). Bioreactor cu strat de sol deschis

Biotehnologiile ca alternative de tehnologii curate

Tehnologii curate - acele tehnologii care permit reciclarea substan elor, de eurilor sau valorificarea poluan ilor ca materii prime secundare. Domenii de aplica ie ob inerea de compu i chimici (de tonaj mare i de sintez fin ) realizarea de procese industriale mai pu in poluante ob inerea de energie tratarea apelor rezi duale i bioremedierea monitorizarea mediului agricultur

Direc ii de dezvoltare
1. Utilizarea componentelor plantelor ca materii prime pentru produse chimice sau ca mediu nutritiv pentru cultivarea microorganismelor: hidra i de carbon, proteine, gr simi - 70 mil. t produse chimice se ob in anual pe baz de plante 2. Ob inerea de compu i chimici care sunt metaboli i ai microorganismelor: etanol, glicerin , aceton , butanol, 1,3-propandiol, acid lactic, acid citric 3. Ob inerea de polimeri biodegradabili de origine microbian : acid polilactic, xantan, polihidroxialcanoa i - Anual se produc 150 mil. t mase plastice, din care 25 mil. t sunt nedegradabili i se acumuleaz n mediu

Produse chimice ob inute prin procedee biotehnologice

Etanolul - se ob ine prin fermenta ia zaharurilor cu drojdii - materie prim de baz n industria chimic , practic orice compus chimic putndu-se ob ine pornindu-se de la etanol. - bioetanol Glicerina - produs secundar al fermenta iei alcoolice - pentru a ob ine cantit i mari de glicerin , calea de metabolizare anaerob a zaharurilor trebuie modificat pentru a se produce cantit i mari de glicerin i nu de alcol etilic Acetona i butanolul - au fost produse prin fermenta ie nc din anul 1914, cu bacterii din specia Clostridium acetobutylicum pe baz de zaharuri, prin fermenta ie aerob . Avantaje comparativ cu ob inerea petrochimic : - folose te materii prime regenerabile - prin inginerie genetic au fost create noi variet i de microorganisme care pot cre te pe reziduuri - cantitatea mare de ape reziduale care se formeaz nu mai reprezint un dezavantaj - procesul de fermenta ie poate avea loc la 60C, iar solven ii produ i pot fi izola i din mediul de fermenta ie prin evaporare pe m sur ce se formeaz .

Produse chimice ob inute prin procedee biotehnologice

1,3-Propandiolul - reprezint o materie prim important pentru ob inerea unor pol imeri, dar are i utiliz ri de solvent i lubrifiant. - ob inerea pe cale biotehnologic a 1,3-propandiolului: din glucoz , cu o tulpin de Escherichia coli recombinat

Acidul lactic - se fabric industrial prin fermenta ie cu bacterii lactice, din substraturi ca glucoz , zaharoz (din melas ), maltoz - este folosit ca materie prim pentru lacuri i diverse mase plastice. Acidul citric - se ob ine din culturi de Aspergillus niger prin fermenta ie pe substraturi de glucoz sau zaharoz - este utilizat n industria alimentar i n industria chimic

Polimeri de origine microbian

Xantanul polizaharid produs de microorganismul Xanthomonas campestris -se produce la un nivel de peste 20.000 tone anual i este utilizat mai ales n industria alimentar .

Polihidroxialcanoa ii de diverse tipuri, de exemplu pol ihidroxibutira ii, produ i de un foarte mare num r de specii bacteriene (ca Bacillus megaterium) - se acumuleaz intracelular, ajungnd la un con inut de pn la 90% din greutatea n substan uscat a celulei - pot fi produ i din resurse regenerabile ( zaharoz , amidon, celuloz , trigliceride), produse secundare (melas , zer, glicerin ) sau chimicale (acid propionic, acid 4-hidroxibutiric). - au dezavantajul c sunt casan i i au stabilitate termic sc zut , de aceea se utilizeaz sub form de copolimeri, care au propriet ti mai bune

Procese industriale curate realizate cu ajutorul biotehnologiilor

Decontaminarea unor materii prime - desulfurizarea petrolului - desulfurizarea c rbunilor Procedee biocatalitice - industria detergen ilor - hidroliza amidonului la glucoz i alte zaharuri fermentesc ibile cu a-amilaz i amiloglucozidaz - industria maselor plastice: hidroliza acrilonitrilului la acrilamid (materia prim pentru fabricarea poliacrilamidei) cu enzima nitrilaz Degradarea i reciclarea de eurilor - epurarea bi ologic a apelor reziduale i ob inerea de biogaz