Bioseparari

1c / 1l.p.
Prof.dr.ing. Anca Galaction
Universitatea de Medicina si Farmacie Gr.T.Popa Iasi
Facultatea de Bioinginerie Medicala

anca.galaction@bioinginerie.ro

Bibliografie selectiva

C.Oniscu, D.Cascaval - Inginerie biochimica si biotehnologie,

vol. 1- Ingineria proceselor biotehnologice, Ed. InterGlobal, Iasi,
2002
D.Cascaval, C.Oniscu, A.I.Galaction - Inginerie biochimica si
biotehnologie, vol. 2- Bioreactoare, Ed. InterGlobal, Iasi, 2002
D.Cascaval, C.Oniscu, A.I.Galaction Inginerie biochimica si
biotehnologie, vol. 3- Bioseparari, Ed. Performatica, Iasi, 2004
A.Galaction. D.Cascaval - Metaboliti secundari si Bioreactoare,
Ed. Bit, Iasi, 2004
A.Galaction, D.Cascaval - Metaboliti secundari cu aplicatii
farmaceutice, cosmetice si alimentare, Casa de Editura Venus,
Iasi, 2007

Directii principale de studiu:

biosinteza
controlul

proceselor chimice si biochimice

separarea si purificarea produselor de
biosinteza
caracterizarea si controlul structurii.

Particularitati ale proceselor de

biosinteza:

produsii biosintetizati se gasesc intr-o dilutie foarte mare in

lichidul de fermentatie;
sunt necesare etape multiple de separare, ceea ce determina
cresterea costului, acesta putand atinge cca. 90% din costul total
al procesului biotehnologic;
comportarea reologica nenewtoniana a lichidelor de fermentatie;
labilitatea chimica, termica, la fortele de forfecare si la tensiunile
interfaciale ridicate ale compusilor biosintetizati, in special ale
compusilor cu masa moleculara mare;
in lichidele rezultate in urma proceselor biochimice, alaturi de
produsul util, exista o serie de compusi secundari cu
caracteristici fizice si chimice asemanatoare cu ale produsului de
baza ;
mobilitatea redusa a compusilor de biosinteza, datorita maselor
moleculare mari.

Consecinte:
Dezvoltarea studiilor au vizat:
cresterea performantelor proceselor de
separare
modificarea proprietatilor reologice ale
biomaselor prelucrate in etapele de
separare.

Directii:
utilizarea

membranelor sintetice si lichide;

separarea prin extractie cu solventi;
adsorbtia selectiva;
separari inalt selective, prin legaturi de tip
afinitate;
utilizarea campurilor intense (centrifugal,
magnetic, electric).

Tehnici de separare clasice:

descoperirea de noi materiale, de exemplu:

membranele sintetice, care sa ofere selectivitati
ridicate, fluxuri adecvate la diferente de presiune
accesibile industrial;
utilizarea unui solvent corespunzator, prin
modelarea moleculara a acestuia (uneori, astfel
de solventi sunt inaccesibili, datorita toxicitatii, a
stabilitatii reduse si a costului ridicat;
in separarea prin adsorbtie, descoperirea unor
adsorbanti extrem de selectivi face ca acest
procedeu sa devina competitiv (economii de
materiale).

Criterii pentru alegerea unei

metode de separare:
localizarea produsului: intracelular sau

extracelular
concentratia finala a produsului in lichid
caracteristicile fizico-chimice ale produsului
utilizarea produsului, respectiv conditiile de
puritate impuse
natura impuritatilor din mediul de cultura
costul etapei de separare.

SEPARAREA PRIN EXTRACTIE

Operatia de separare a componentilor unui amestec lichid
sau solid pe baza diferentei de solubilitate a acestora
intr-unul sau mai multi solventi
extractie lichid - lichid - amestecul supus separarii este
lichid,
extractie solid - lichid amestecul supus separarii este
solid.

extractia este fizica, - extractia se realizeaza numai prin

intermediul fenomenelor fizice de solubilizare si
difuziune,
extractia este reactiva - in timpul procesului intervin si
reactii chimice intre solut si agentul (agentii) de extractie

Etape

contactarea solutiei initiale cu solventul

(amestecarea)
solubilizarea si difuzia solutului in faza
solventului (transferul de masa al solutului)
separarea celor doua faze rezultate (extractul faza solventului care contine solutul, rafinatul solutia initiala epuizata)
recuperarea solventului atit din extract, cit si din
rafinat.

Extractia fizica a produselor de

biosinteza
Produsele de biosinteza se gasesc in lichidul
final de fermentatie in concentratii reduse (0,5
8%)
sunt in general, compusi labili chimic si termic .
in lichidele de fermentatie se gasesc numerosi
compusi secundari, unii cu caracteristici fizicochimice asemanatoare cu ale produselor utile.
Din aceste motive, separarea si purificarea
produselor de biosinteza sint operatii dificile,
care necesita etape laborioase.

Solventi pt. extractie:

Pentru extractia produselor de biosinteza polare:
utilizeaza alcooli, esteri, cetone.
Principala problema o reprezinta solubilitatea lor
relativ ridicata in mediul apos. Cresterea masei
moleculare a acestor compusi reduce
solubilitatea in mediul apos, dar mareste
tendinta de formare a unor emulsii stabile cu
acesta.

Pentru cele nepolare: eter de petrol,

diclormetan, dicloretan etc.

Separarea antibioticelor -lactamice

Extractia fizica reprezinta, deocamdata, singurul

procedeu de separare aplicat industrial.
Concentratia finala a penicilinelor G si V in lichidele de
fermentatie este cuprinsa intre 3 si 6%, in functie de
tulpina utilizata. Datorita dilutiei foarte mari, este
necesara concentrarea solutiei prin extractie si
reextractie.
Penicilinele pot fi extrase fie din solutia apoasa rezultata
in urma filtrarii biomasei, fie direct din lichidul de
fermentatie.
Pentru extractia penicilinelor G si V au fost studiati o
serie de solventi organici, la diferite valori ale pH-ului
fazei apoase si ale temperaturii

Extractia penicilinelor
Extractia penicilinelor in acetat de butil

decurge cu randamente maxime numai in

conditiile in care aceste antibiotice se vor
gasi in solutia apoasa supusa extractiei in
forma nedisociata.
Aceasta deoarece solventii nepolari, sau cu
polaritate redusa (categorie in care intra si
acetatul de butil) pot solubiliza numai
compusii nepolari.

Extractia penicilinelor
cu acetat de butil
Din analiza procesului de extractie fizica a penicilinelor G si V cu acetat de butil s-a
constatat ca :
in solvent sint extrase numai moleculele de penicilina nedisociate
intre moleculele de penicilina, in conditiile in care se realizeaza extractia, nu are loc
formarea unor asociatii
in acetatul de butil penicilinele nu disociaza.
Deoarece contin o grupare carboxilica, penicilinele vor disocia in faza apoasa, conform
echilibrului:
P-COOH(aq)
pka = 2,75 pentru penicilina G

P-COO-(aq) + H+(aq)
pka = 2,70 pentru penicilina V

In aceste conditii, penicilinele G si V vor exista intr-o forma neutra numai

la un pH al fazei apoase mai mic decit 2,70 - 2,75. Influentele pH-ului
asupra coeficientului de distributie al penicilinei G si asupra
randamentului de extractie a unor peniciline sint redate in figurile:
100

Grad de extrac]ie, %

50

Coefcient de distribu]ie, K

40
30
20

80
60
40
20

10

0
1

pH

Influenta valorii pH-ului fazei

apoase asupra coeficientului de
distributie al penicilinei G intre apa
si acetat de butil, K.

pH

Influenta valorii pH-ului fazei

apoase asupra randamentului
extractiei fizice a penicilinelor G si
V cu acetat de butil.

Selectarea solventilor

Solventii sau agentii de extractie pot fi compusi

chimici puri sau amestecuri. Selectarea unui
anumit solvent impune cunoasterea
caracteristicilor fizico-chimice ale acestuia si pe
cele ale compusului care se doreste a fi extras.
De asemenea, este extrem de importanta
cunoasterea echlibrului dintre faze si a altor
proprietati fizice ale amestecului, proprietati care
depind de interactiunile dintre componentii
sistemului de extractie.

SEPARAREA PRIN EXTRACTIE

REACTIVA

Extractia reactiva reprezinta o imbinare intre procesele

chimice, respectiv reactia dintre solut si un extractant, si
procesele fizice de difuziune si solubilizare a compusului
format in urma reactiei chimice.
Extractia fizica necesita utilizarea unui solvent cu o
miscibilitate cit mai redusa cu solventul din solutia
supusa separarii, solvent care sa ofere o selectivitate
ridicata si inertie chimica fata de solut, in scopul
diminuarii pierderilor la recuperare.
Comparativ, extractia reactiva impune adaugarea in
solvent a unui agent de extractie, sau extractant, capabil
sa reactioneze cu solutul, formind un compus miscibil
numai cu solventul, marind astfel fie capacitatea de
retinere a acestuia, fie selectivitatea separarii.

Utilizari

Separarea unor compusi anorganici,

Recuperarea si purificarii unor metale din
deseurile radioactive si din apele reziduale
Tehnica de preconcentrare si separare in chimia
analitica.
Separarea compusilor organici, in special a celor
obtinuti prin biosinteza (acizi carboxilici,
aminoacizi, antibiotice), datorita avantajelor
oferite comparativ cu tehnicile clasice de
separare

Clasificarea procedeelor de
extractie lichid-lichid

extractia reactiva presupune utilizarea unor agenti de extractie

(extractanti, agenti purtatori) solubili fie in solvent, fie in faza
apoasa, insa este esential ca produsul format in urma reactiei cu
solutul sa fie puternic hidrofob.
Extractie
fizica
Solutia
supusa
separarii

Extractie
reactiva

Solvent

Solvent +
Extractant

Extractan
t

Clasificarea sistemelor de extractie reactiva

a. natura compusilor care se extrag:
solut nemodificat chimic (extractie fizica);

chelati;
compusi obtinuti prin solvatare;
complecsi acizi, sau bazici;
saruri;
perechi de ioni;
b. natura extractantului utilizat:
extractanti de chelatizare - utilizati pentru extractia reactiva a metalelor;
extractanti de tipul acizilor organofosforici - utilizati pentru extractia reactiva a metalelor, a
acizilor carboxilici, a aminoacizilor, a antibioticelor;
extractanti de solvatare utilizati la extractia reactiva a metalelor, a acizilor minerali, a
aminoacizilor, a derivatilor fenolici, a acizilor carboxilici :
- derivati organofosforici neutri
- alcooli, cetone, eteri, esteri, sulfoxizi ;
amine cu masa moleculara mare si derivati ai acestora utilizate pentru extractia reactiva a
metalelor, a acizilor minerali, a acizilor carboxilici, a aminoacizilor, a antibioticelor;
extractanti cu structura macrociclica caracterizati printr-o selectivitate ridicata, utilizati la
extractia reactiva a metalelor si a unor compusi organici (aminoacizi):
- eteri-coroana
- calixarene
alti derivati.
Agentii de extractie prezentati pot fi utilizati individual in procesele de separare sau in amestec
cu extractanti din categorii similare sau diferite (randamente superioare sumei
randamentelor obtinute prin folosirea extractantilor individuali) = sisteme de extractie
reactiva sinergetica.
-

Mecanismul general al extractiei reactive

Mecanismul general prezentat presupune faptul ca solubilitatea
componentilor sistemului in cealalta faza este nula, separarea
realizandu-se prin parcurgerea urmatoarelor etape:
difuzia extractantului la interfata de separare dintre cele doua faze
difuzia solutului la interfata de separare dintre cele doua faze
reactia interfaciala dintre solut si extractant
difuzia compusului rezultat in urma reactiei interfaciale in faza extract
f. organica

A(o)

S.A(o
)

interfata

f. apoasa

A(i)

S(i)
S(aq
)

S.A(i)

S - solut
A - agent de extractie

Extractia reactiva cu derivati organofosforici

Clasificarea agentilor de extractie organofosforici - dupa str.chim.
C2H5

acizi organofosforici:
- acidul di-(2-etilhexil) fosforic
(D2EHPA)
esteri neutri ai acidului
fosforic:
- tri-n-butilfosfatul (TBP)
- tri-n-octilfosfatul (TOP)
fosfinoxizi:
- tri-n-hexilfosfinoxid (THPO)
- tri-n-octilfosfinoxid (TOPO)

alti derivati.

CH2 CH (CH2)3 CH3

CH2 CH (CH2)3 CH3

P
HO

C 2H5

O C4H9
P
O C4H9
O C4H9

C8H17
C 8 H17
C 8 H17

O C8H17
O C8H17
O C 8H17

C6H13
O P C H
6 13
C6H13

Antibioticele -lactamice
(penicilinele, cefalosporinele)

constituie cea mai importanta clasa a antibioticelor de biosinteza,

datorita spectrului larg de actiune antibacteriana.
La nivel industrial, separarea penicilinelor din lichidele de
fermentatie, filtrate sau nu in prealabil, se realizeaza prin extractie
fizica cu acetat de butil. Extractia penicilinelor in acest solvent
decurge cu randamente maxime numai in conditiile in care aceste
antibiotice se vor gasi in solutia apoasa supusa extractiei in forma
nedisociata, deoarece solventii nepolari sau cu polaritate redusa
(categorie in care intra si acetatul de butil) pot solubiliza numai
compusii nepolari.
Extractia fizica eficienta a penicilinelor cu acetat de butil este
posibila numai la un pH al fazei apoase mai mic decit 2, conditii in
care viteza de inactivare chimica a acestor antibiotice este extrem
de ridicata.

Unul dintre cei mai utilizati agenti de extractie ai

penicilinelor G si V este tri-alchil-metil-laurilamina, denumit
comercial Amberlite LA-2, o amina secundara cu structura
generala:
C12H25-NH-CR1R2R3 nr. atomi carbon R1 + R2 + R3 = 11 13
Mecanismul general al reactiei chimice interfaciale a
penicilinelor cu acesti extractanti este redat prin echilibrul
urmator:
P-COO-(aq) + H+(aq) + A(o)
P-COOH.A(O)
Datorita structurii voluminoase a penicilinelor, respectiv a
agentilor de extractie, la interfata se vor forma complecsi
(saruri) numai in raport molecular antibiotic: extractant de
1 : 1.

Principalii factori care influenteaza procesul:

valoarea pH-ului fazei apoase initiale

concentratia agentului de extractie in

solvent
timpul de contactare a fazelor
raportul volumic al fazelor
concentratia antibioticului in solutia
apoasa initiala.

Influenta valorii pH-ului fazei apoase asupra randamentului extractiei

fizice si reactive a penicilinelor G si V.

Studiindu-se influenta pH-ului fazei apoase initiale, s-a constatat

ca in cazul extractiei reactive a penicilinelor G si V cu Amberlite
LA-2, eficienta separarii ramine la valoarea maxima constanta
(97-98%) pina la pH = 5,
5, scazind apoi, astfel incit la pH = 7,5
gradul de extractie este de circa 20% Faptul ca extractia reactiva
a penicilinelor G si V decurge cu randamente maxime chiar la
valori ale pH-ului de 5 reprezinta principalul avantaj al acestei
tehnici de separare. La aceasta valoare a pH-ului, de exemplu,
timpul de semiinactivare al penicilinei G este de 92 ore , in acest
mod fiind inlaturat pericolul degradarii chimice a produselor utile
biosintetizate.
Practic, la valori mici ale pH-ului solutiei apoase initiale, extractia
fizica decurge in paralel cu extractia reactiva. Odata cu cresterea
valorii pH-ului, extractia reactiva devine predominanta,

100

Grad de extrac]ie, %

3
2

80

60
1

40

20

0
2

pH

1 - extractia fizica a penicilinelor G si V

2 - extractia reactiva a penicilinei G
3 - extractia reactiva a penicilinei V

Reextractia
Daca extractia s-a realizat cu amine, reextractia se va face cu o solutie de
carbonat, sau fosfat de sodiu, sau potasiu, conform reactiei de echilibru:
2P-COOH.A(o) + Na2CO3 (aq)
2 P-COO-Na+(aq) + A(o) + CO2 + H2O
Reextractia este controlata de difuzia componentilor catre si dinspre interfata de
contact dintre faze.
In cazul reextractiei cu o solutie de fosfat, s-a observat ca, odata cu cresterea
concentratiei aminei in solvent, viteza procesului scade. Insa, cu cresterea
pH-ului solutiei de fosfat, influenta concentratiei extractantului se
diminueaza, astfel incit la pH = 9 aceasta nu mai afecteaza procesul.
In general, reextractia s-a realizat cu randamente mari si fara degradarea
antibioticelor, la valori ale pH-ului de 7,2 - 7,5, pierderile totale de penicilina G,
de exemplu, atit in etapa de extractie, cit si in cea de reextractie, fiind sub
0,3%.
Daca se utilizeaza extractia reactiva cu o clorura de alchilamoniu, atunci
reextractia se face cu o solutie de acid clorhidric:
P-COOA(o) + HCl(aq)
P-COO-(aq) + H+(aq) + ACl(o)