PARAZITOLOGIE MEDICALA

AN UNIVERSITAR 2017-2018

1 LP 5
 CARACTERELE GENERALE ALE
FUNGILOR (DEFINITIE, MORFOLOGIE,
CLASIFICARE).

LEVURI DE INTERES MEDICAL

(CANDIDA, CRYPTOCOCCUS).

2
CARACTERELE GENERALE ALE FUNGILOR

Definitie:

Fungii sunt :
bioentitati microscopice,
eucariote,
uni- sau pluricelulare,
heterotrofe,
contin chitina in peretele celular.

3
MORFOLOGIE

Se bazeaza pe:
aspectul si

structura partii asimilatoare a fungului- talul,

permite descrierea a 3 tipuri principale de fungi:

Levuriformi

Filamentosi

Dimorfici

4
1. Fungi levuriformi:

microorganisme unicelulare,
de forma rotunda sau alungita,

se multiplica in principal prin burjeonare;

burjeonul- denumit blastospor sau blastoconidie,

fie se poate desprinde de celula-mama printr-

un proces de fisiune,
fie ramane atasat la aceasta si genereaza
succesiv noi indivizi, sub forma unor agregate
liniare pseudohife.

5
2. Fungi filamentosi:

microorganisme pluricelulare,

cu talul alcatuit din filamente tubulare, septate sau

nu, denumite hife;

hifele sunt de obicei ramificate si aglomerate

formand miceliul.

6
3. Fungi dimorfici:

microorganisme care apar

sub forma de levuri in tesuturile

organismelor parazitate sau la 370C in vitro

si

sub forma filamentoasa cand sunt cultivate

la temperatura camerei sau la 300C, pe
medii uzuale. 7
LEVURI DE INTERES MEDICAL
GENERALITATI
Levurile sunt fungi unicelulari care se multiplica
vegetativ (asexuat)
fie prin burjeonare,

fie prin fisiune.

Habitatul lor natural este extrem de diversificat.

Levurile sunt intalnite la:

plante,
insecte,

animale si om (pe piele, mucoase si in tractul digestiv),

in sol,

apa (dulce si sarata),

8
aer.
 Au caracter ubicuitar.

Levurile de interes clinic sunt

microorganisme aerobe sau facultativ anaerobe,

mezofile si

acidofile.

Temperatura optima de cultivare variaza

pentru marea majoritate a levurilor intre 25 C si
0

300C, insa
cele patogene tolereaza si temperaturi de 37 C.
0

9
IDENTIFICAREA LEVURILOR

Algoritmul de identificare a unei tulpini levurice

se bazeaza pe o combinatie de:
caractere microscopice

caractere de cultur

caractere biochimice

caractere genetice

10
IDENTIFICAREA LEVURILOR

1. Examenul microscopic direct al produselor

patologice:

preparat extemporaneu intre lama si lamela cu

solutie 20% KOH (scuame, fragmente unghiale,
secretii linguale, vaginale);

preparat extemporaneu cu sol 20% KOH +

substanta fluorescenta sau frotiu colorat cu
aceeasi substanta fluorescenta (Calcofluor);
necesita microscopie in lumina ultraviolet;

11
 preparat extemporaneu cu tus de India (pune in
evidenta levurile capsulate din genul Cryptococcus, in
sedimentul LCR, urinar);

frotiu colorat Gram (pune cu usurinta in evidenta

filamentele, pseudohifele;

frotiu colorat May Grunwald-Giemsa (este

coloratia de rutina pentru depistarea levurilor
intracelulare de tip Histoplasma);

12
In cursul examenului microscopic se urmaresc:

prezenta,

forma,

dimensiunile formatiunilor caracteristice levurilor:

blastospori,
pseudohife,
filamente (hife).
13
2. Cultivarea pe medii de izolare

In general, insamantarea prelevatelor se face pe

Agar Sabouraud aditivat cu cloramfenicol;

acest mediu
permite o buna dezvoltare a levurilor si

suprim multiplicarea eventualelor bacterii

contaminante.

14
 Levurile de interes medical se dezvolta in 24-72 h de
incubare.

pentru prelevatele provenind din situsuri in care

in mod normal temperatura este identica cu cea a
organismului se va alege temperatura de 370C
pentru incubare;

in cazul prelevatelor provenind de la nivelul

tegumentelor sau unghiilor, incubarea se va face
atat la 370C cat si la 300C deoarece, unele levuri
cultivabile la 300C dar necultivabile la 370C, pot
avea semnificatie clinica, fiind cauza unor micoze
superficiale. 15
 Coloniile pot imbraca diverse aspecte in functie de
genul si specia in cauza.

In general,
au forma rotunda,
sunt bombate si
nu prezinta pigment.

Suprafata poate fi
neteda,
uneori neregulata,
cu margini fin franjurate si
au aspect umed sau uscat.

Consistenta este
pastoasa,
mucoida sau
cerata.
16
Teste de identificare
a)obtinerea si examinarea preparatelor
extemporanee cu tus de India

pe o lama de sticla curata si degresata se etaleaza o

picatura de tus in care se suspensioneaza apoi cu
ajutorul unei anse microbiologice un mic fragment din
colonia levurii de identificat;

se acopera cu o lamela si se examineaza la microscop

cu obiectiv X20 (X40);

observarea unor levuri rotunde sau ovoidale,

inconjurate de un halou necolorat, clar, pe fond brun 17
negru, indica prezenta capsulei.
b)testul de filamentare (testul de blasteza sau
germ-tube test)
ca medii pentru blasteza se utilizeaza serul sanguin
de cal, serul sanguin uman;

Tehnica:
se prepara suspensia levurica in solutie salina
fiziologica, densitatea acesteia ajustandu-se la 0,5 Mc
Farland (cca.105-106 celule /ml) ;

in fiole cu capacitatea de 2 ml se pun in contact 0,5 ml

suspensie levurica si 0,5 ml ser sanguin de cal;

fiolele se mentin apoi in baia de termostatare la 360C

timp de 2h. 18
 Dupa expirarea celor 2h, fiolele se agita si din
fiecare amestec se preleveaza un volum de 25L
care se etaleaza apoi intre lama si lamela.

preparatul extemporaneu astfel obtinut se

examineaza la microscop in vederea decelarii
tubilor germinativi caracteristici tulpinilor de
Candida albicans si Candida dubliniensis-filamente
scurte care emerg din blastospori fara strangulare;

19
 ca martor al filamentarii, se utilizeaza de fiecare
data o tulpina tip de Candida albicans;

si alte levuri pot produce formatiuni similare de

tipul pseudofilamentelor, insa ele se diferentiaza de
adevaratii tubi germinativi prin existenta unei
strangulari la locul de emergenta din blastospor.

20
3.TESTE BIOCHIMICE

a)fermentarea zaharurilor
utilizarea metabolica a zaharurilor este utila in
diferentierea diverselor specii apartinand genului
Candida;

b)capacitatea de asimilare a surselor de

carbon
abilitatea levurilor de a creste pe diverse medii in
prezenta anumitor substante chimice adaugate
ca unica sursa de carbon, poarta numele de
auxanograma;
21
c)capacitatea de asimilare a surselor de azot
important pentru diferentierea levurilor apartinand
genurilor Cryptococcus si Rhodotorula;

d)producerea de ureaza
pune in evidenta capacitatea levurilor de a produce
enzima numita ureaza (ex. Cryptococcus);

22
e)rezistenta la cicloheximida
testul se refera la abilitatea levurilor de a se dezvolta
pe medii de cultura continand doua concentratii de
cicloheximida- 0,01 %, repectiv 0,1%;

f)producerea de fenol-oxidaza
permite identificarea speciei de Cryptococcus
neoformans pe baza unei reactii de culoare ce
determina o brunificare a mediului in aproximativ
24h de incubare la 30 0C;

23
g)producerea altor enzime
este evidentiabila prin cultivarea levurilor pe medii
cromogene;

h)teste rapide de identificare a unor specii de

levuri:
latex-aglutinare (exemplu: pentru C.dubliniensis-
BICHRO-DUBLI, Fumouze)
asimilarea trehalozei.

24
4.TEHNICI MOLECULARE

se bazeaza in principal pe amplificarea si

secventializarea unor regiuni unanim prezente in
genomul levurilor;

regiunile tinta sunt amplificate prin PCR cu

ajutorul a doua secvente nucleotidice cunoscute,
denumite amorse.

25
 GENUL CANDIDA

26
 Cuprinde peste 160 de specii, de ex.:
C.albicans,

C.parapsilosis,

C.glabrata,

C.kefir,

C.krusei,

C.tropicalis s.a.

27
 C. albicans este comensal a cavitilor naturale
(n special gur, intestin, vagin).

Alte specii se ntlnesc att pe mucoase, ct i la

nivelul pielii sntoase.

Sunt levuri oportuniste; produc infecii cnd apar

deficiene ale mecanismelor de aprare (nespecific
i specific) ale gazdei.

Determin candidoze cu localizare superficial sau

profund.
28
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

Produsul patologic recoltat: variaz n funcie de

localizarea leziunilor.

recoltarea scuamelor din leziunile cutanate se face cu

pensa;

din leziunile mucoasei, cu ajutorul tamponului steril;

prelevarea prin raclarea unghiilor la limita dintre

zona sntoas i cea infectat.

recoltarea sputei, l.c.r., urin se face n recipiente 29

sterile.
 Transportul produsului patologic:

trebuie efectuat rapid (max 1h), datorit

multiplicrii rapide a levurii.

30
Examen direct, microscopic, se practic:
n stare proaspt, lam-lamel (materii fecale, urin);

dup clarificare cu solutie de hidroxid de potasiu 20%

sau cu solutie cloral-lactofenol (scuame, unghii);
dup colorare (frotiu, preparate histologice).

Se pot observa:
Levuri circulare sau rotunde, cu diametrul de

2-6 m, nmugurite.
Pseudofilamente (excepie C. torulopsis, care nu

filamenteaz).

31
 Cultivare

Cultiv sub form de levuri pe mediul Sabouraud (cu

antibiotice), formnd colonii albicioase, dup 24-48
ore.

Temperatura de cultivare este de 26C sau 37C dup

localizarea superficial sau profund a infeciei.

32
 Identificare

-se face pe baza caracterelor morfologice

macro- si microscopice,
biochimice si
genetice.

Testul de filamentare este pozitiv pentru Candida

albicans si Candida dubliniensis.

33
 Antifungigrama permite stabilirea sensibilitii
la antifungice:

Fluconazol,
Itraconazol,
Amfotericina B,
Nistatina,
Flucitozina,
Ketoconazol,
Miconazol,
Econazol.
34
 GENUL CRYPTOCOCCUS

35
 Cuprinde levuri capsulate al caror habitat natural
este reprezentat de mediul ambiant.

A fost izolat din excrementele psrilor domestice

(n special porumbei) i slbatice, precum i din solul
ngrat cu acestea.

Contaminarea este predominant aerogena.

36
 Specia cea mai importanta din punct de vedere a
implicarii in aparitia infectiilor criptococice este
C. neoformans; celelalte specii sunt mai rar
semnalate.

C. neoformans intereseaz, n special, persoanele

imunodeficiente (HIV pozitive sau cu hemopatii
maligne), la care produce cel mai frecvent
meningite.

37
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
Produse patologice: l.c.r., urin, puroi, biopsie.

Examen microscopic: levuri; se evidentiaza capsula.

Levuri sferice, nmugurite, cu diametrul de 3-8m,
nconjurat de o capsul groas.
Nu formeaz filamente sau pseudofilamente.

38
 Cultivare:

Cultiv pe mediul Sabouraud,

incubat la 37C,

n timp de 3-5 zile.

Coloniile de C. neoformans sunt foarte mucoase, de

culoare bej.

39
 Identificarea se face pe baza caracterelor
morfologice
macro- si microscopice,

biochimice si

genetice.

Cryptococcus spp. produc ureaz.

Antifungigrama permite stabilirea sensibilitii la

antifungice.

40