Explorarea fibrinolizei și a

trombozei
Lucrare practică
Cuprins
I. Explorarea inhibitorilor procesului de coagulare
• Antitrombina
• Proteina C
• Proteina S
• Rezistența la proteina C activată și mutația factorului V Leiden
II. Explorarea fibrinolizei
• Plasminogenul
• Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1
• Antiplasmina
• D-dimeri și produși de degradare ai fibrinei
• Timpul de liză a cheagului de euglobuline
Exemple practice
• Panelul de hipercoagulare
• Panelul CID
Activatorii și inhibitorii coagulării
I. Inhibitorii procesului de coagulare
- Antitrombina
- Proteina C
- Proteina S
- Inhibitorul căii factorului tisular (TFPI)

Acționează prin mecanisme diferite

Scăderea nivelelor plasmatice ale inhibitorilor

procesului de coagulareși existența unor structuri
disfuncționale ale acestora determină apariția
stărilor de hipercoagulabilitate
I. Inhibitorii procesului de coagulare
1. Antitrombina
• Este un anticoagulant natural ce inhibă factorii coagulării FII, FXa și
mai puțin FXIa și FIXa, formând complexe cu aceștia
• Viteza cu care se formează aceste complexe este crescută sub efectul
heparinei și al moleculelor cu acțiune heparin-like de pe suprafața
celulelor endoteliale
I. Inhibitorii procesului de coagulare
1. Antitrombina

• Prin capacitatea de a crește activitatea antitrombinei, heparina

funcționează ca un anticoagulant puternic

• Deficiența de antitrombină conduce la un status hipercoagulant și risc

crescut de boală tromboembolică

• Deficiența dobândită este mult mai frecvent întâlnită comparativ cu

deficiența ereditară de antitrombină
I. Inhibitorii procesului de coagulare
1. Antitrombina
Testele pentru dozarea antitrombinei plasmatice pot fi:

1. funcționale (calitative) – principiul se bazează pe inhibarea FIIa sau FXa

de către antitrombină în prezența heparinei
- măsurarea efectului anti-FIIa sau anti-FXa al antitrombinei se realizaeză în
general utilizând teste cromogene
- plasma este incubată cu un exces de FIIa sau FXa și cu heparină, formând
complexul antitrombină-trombină-heparină
- FIIa sau FXa rezidual se măsoară folosind un substrat cromogenic prin
spectrofotometrie
- activitatea FIIa sau FXa rezidual este invers proporțională cu activitatea
antitrombinei

2. imunologice (cantitative) – folosesc anticorpi împotriva antitrombinei

ANTITROMBINA

DEFICIT DE ANTITROMBINA

Test funcțional

+ - Alte cauze

Test imunologic

Deficit cantitativ Deficit caliativ

(tip I)
(tip II)
I. Inhibitorii procesului de coagulare
1. Antitrombina

Scăderea activității antitrombinei poate fi întâlnită în:

- deficit genetic – prevalența acestei deficiențe în populația generală
este foarte mică, fiind mai mare la pacienții cu istoric de tromboze
venoase (1-4%)
- scăderea sintezei hepatice – ex boli hepatice grave
- consumul crescut de AT – ex tromboză venoasă, CID

Creșterea activității antitrombinei poate fi întâlnită în:

- consumul unor medicamente – ex anticoagulante
I. Inhibitorii procesului de coagulare
2. Proteina C

Proteina C
- este o glicoproteină sintetizată în ficat printr-un
mecanism dependent de vitamina K,
- circulă în plasmă și are rol anticoagulant.

Proteina C este transformată în enzimă activă de către trombină,

după fixarea trombinei la nivelul unei proteine endoteliale
(trombomodulină).

Proteina C activată inactivează consecutiv factorii plasmatici V și

VIII.

Funcția inhibitoare a proteinei C este amplificată de proteina S.

I. Inhibitorii procesului de coagulare
2. Proteina C

• Deficiența de proteina C conduce la un status hipercoagulant și risc

de tromboză venoasă

• Deficiența dobândită este mult mai frecventă comparativ cu

deficiența ereditară de antitrombină și creste riscul de tromboză de 7
ori

• Nivelele Proteinei C sunt scăzute de catre WARFARINA (Coumadin)

 I. Inhibitorii procesului de coagulare
2. Proteina C

Dozarea proteinei C plasmatice se face utilizând teste:

I. Funcționale
- nu există o metodă care să investigheze toate aspectele funcţionale ale
moleculei de proteină C
- metodele funcţionale disponibile sunt reprezentate de metode cronometrice şi
metode cromogenice
- metoda cronometrică măsoară capacitatea anticoagulantă a proteinei C activate asupra
factorului Va şi factorului VIIIa
- metoda cromogenică evaluzează activitatea proteinei C cu ajutorul unui substrat specific
și poate să nu detecteze deficitul calitativ al PC (tip II)
- este necesară corelarea rezultatelor obţinute prin cele două metode
 I. Inhibitorii procesului de coagulare
2. Proteina C

I. Teste funcționale

• în cazul în care ambele metode funcționale evidenţiază concentraţii scăzute ale PC,
înseamnă că există un defect de eliberare a peptidei de activare sau o anomalie a situsului
activ, care nu poate cliva nici factorul Va, nici factorul VIIIa, nici peptide sintetice
• dacă numai metoda cronometrică evidentiază concentraţii scăzute, înseamnă că există
un defect de interacţiune cu fosfolipidele, ionii de calciu şi PS

II. Teste imunologice

• detectează deficitul cantitativ de PC

 I. Inhibitorii procesului de coagulare
2. Proteina C

Activitatea scăzută a PC poate fi întâlnită în:

- Deficitul congenital – heterozigoții au nivelele PC de aprox 35-65% din valoarea normală

și un risc relativ de tromboză de 7; homozigoții au risc crescut de deces la scurt timp după
naștere prin CID sau purpura fulminans
- Scăderea sintezei hepatice – PC este una dintre primele proteine care scad în insuficiența
hepatică, are T1/2=6-8h
- Consum crescut – CID, tromboza
- Deficit de vitamină K sau tratament cu warfarină
- Distrugere imunologică - prezența de autoanticorpi
I. Inhibitorii procesului de coagulare
3. Proteina S
Proteina S este o glicoproteină dependentă de
vitamina K, sintetizată în ficat, celulele
endoteliale și megakariocite.

PS este un cofactor necesar pentru activitatea

anticoagulantă a PC.

Proteina C cu proteina S ca și cofactor

degradează parțial factorii V și VIII.

Doar 40% din cantitatea de PS este liberă,

având rolurile menționate, restul de 60% se află
legată de C4b-binding protein.
I. Inhibitorii procesului de coagulare
3. Proteina S
• Metoda funcțională:
• măsoară capacitatea proteinei S de a servi drept cofactor al proteinei C, de a
degrada factorii V și VIII și de a prelungi APTT/PT
• se realizează de prima intenție

• Metoda imunologică:
• ELISA
• Două tehnici:
• Proteina S totală
• Proteina S liberă
I. Inhibitorii procesului de coagulare
3. Proteina S
Situații care se pot asocia cu scăderea activității PS:
- Alterarea funcției de sinteză a ficatului
- Deficit de vitamină K sau tratament cu warfarină
- Consum – ex în CID
- Creșterea procentului de PS legată în reacțiile da fază acută, datorită
creșterii C4b-binding protein, ramânând astfel o cantitate mai redusă
de PS liberă, activă
- Pierdere de PS – ex în sdr nefrotic
I. Inhibitorii procesului de coagulare
3. Proteina S
Deficitele ereditare de proteina S:
• 0,7% în populația generală
• Heterozigoți:
• Activitate a proteinei S de 20-60%
• Tromboze cu debut între 10 și 50 ani
• Homozigoți:
• În perioada neonatală – purpura fulminans sau CID
I. Inhibitorii procesului de coagulare
4. Rezistența la proteina C activată și mutația factorului V Leiden
• Activitatea anticoagulantă a proteinei C implică degradarea
proteolitică a factorilor V și VIII la nivelul unor reziduuri specifice arg,
cu inactivarea acestora

• Factorul V Leiden este o mutație punctiformă G1691A (Arg506Glu)

• Apare la 5% din populația caucaziană

• Mai există alte două mutații activatoare ale factorului V, cauzatoare

de rezistență la proteina C
I. Inhibitorii procesului de coagulare
4. Rezistența la proteina C activată și mutația factorului V Leiden
• Metoda funcțională:
• Proba e diluată 1:5 cu plasma deficientă în factor V
• Se efectuează APTT pe proba diluată înainte și după adăugarea de PCA
• PCA prelungește APTT de două ori la indivizii normali și < 2 la pacienții cu
Factor V Leiden
• Specificitate 100%, sensibilitate 100%

• Metoda PCR:
• Se extrage ADN-ul din proba nediluată, necentrifugată
• Se determină prezența mutației prin tehnici ca PCR-RFLP, TaqMan, etc.
• Singura care poate determina homo- sau heterozigoția
Echilibrul hemostază-fibrinoliză
Fibrinoliza
• Fibrinoliza fiziologică este procesul de dezagregare și dizolvare a
cheagurilor sanguine, ce permite reluarea circulației sanguine după
repararea leziunii vasculare, sub acțiunea enzimei plasmină sau
fibrinolizină.
• Activitatea sistemului fibrinolitic este reglată de factori activatori și de
factori inhibitori.
• Cei mai importanți activatori ai sistemului fibrinolitic sunt: tPA (activatorul
tisular al plasminogenului), FXIIa, UK (urokinaza, activatorul urinar al
plasminogenului, uPA).
• Alți activatori sunt: activatorul sanguin al
plasminogenului, streptokinaza, fibrina, trombina.
Fibrinoliza
• tPA este eliberat din celulele endoteliale şi transformă plasminogenul
(fixat pe suprafaţa cheagului de fibrină) în plasmină.
• Plasmina degradează polimerul de fibrină în fragmente cu greutate
moleculară mică (produşi de degradare a fibrinei).
• Produşii de degradare a fibrinei (PDF) sunt îndepărtaţi din circulaţie
de sistemul monocito-macrofagic.
• Plasmina circulantă este inactivată de alfa 2 inhibitorul plasminic.
• Celulele endoteliale eliberează un inhibitor al
activatorului tisular al plasminogenului.
Fibrinoliza

Fibrinoliza fiziologică
- este un proces declanşat de coagularea fiziologică
- strict localizat la nivelul dopului fibrino-plachetar
- are ca scop repermeabilizarea vaselor de sânge după repararea peretelui
vascular
Fibrinoliza patologică
- este declanşată în condiţiile creşterii nivelului de activatori ai fibrinolizei
sau scăderii nivelului de inhibitori ai fibrinolizei
- se caracterizează prin prezenţa plasminei libere circulante
- determină apariţia unui sindrom proteolitic complex, explicat prin acţiunea
plasminei libere asupra unor structuri diverse, diferite de trombii fibrinoşi
II. Explorarea fibrinolizei
1. Plasminogenul
• Precursorul plasminei ce distruge trombii de fibrină
• Plasminogenul e activat de tPA sau uPA
• Plasmina degradează fibrinogenul și fibrina
• Plasmina inactivează factorii Va și VIIIa
• Deficiența ereditară este rară predispunând la tromboză
• Valori normale:
• 75 – 130 %;
• 6 – 14 g/dl.
II. Explorarea fibrinolizei
1. Plasminogenul
• Metodologie:
• Metoda funcțională:
• Se adauga streptokinaza + substrat cromogenic;

• Metoda imunologică:
• Radial imunodiffusion assay
• Determină cantitatea de plasminogen.
II. Explorarea fibrinolizei
1. Plasminogenul
• Deficiența dobândită:
• Terapie trombolitică
• Disfuncție hepatică
• Consum (CID)
• Deficiența ereditară:
• Rară
• Deficitul sever e asociat cu conjunctivitis lignosa:
• conjunctivită pseudomembranoasă caracterizată prin depozite
masive de fibrină
• depozitele de fibrină se datorează absenței sau scăderii
clearence-ului fibrinei de către plasminogen
II. Explorarea fibrinolizei
2. Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1 (PAI – 1)

• PAI-1 inhibă activatorul tisular al plasminogenului, t-PA

• Nivele crescute de PAI-1 sunt asociate cu tromboza arterială datorată

inhibării fibrinolizei

• Deficitul de PAI-1 se asociază cu sindromul hemoragipar datorită fibrinolizei

excesive

• Valori normale:
• 4 – 40 ng/ml (metada imunologică)
• 0 – 12 unitati/ml (metoda funcțională)
PAI-1 prezintă ritm circadian.
II. Explorarea fibrinolizei
2. Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1 (PAI – 1)
• Metoda funcțională:
• Plasma este adaugată unei cantități cunoscute de urokinază
• PAI-1 din plasma pacientului leaga urokinaza
• restul de urokinază este inactivat prin adaugare de plasminogen, care va fi
transformat în plasmină
• plasmina clivează un substrat cromogenic – spectrofotometrie.

• Metoda imunologică:
• Anticorpi specifici
II. Explorarea fibrinolizei
2. Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1 (PAI – 1)

• Este un reactant de fază acută

• Sinteza lui e stimulată de nivelele de insulină sau glucoză

• Crește dupa evenimente trombotice și în sarcină

• Nu este un test de rutină în clinica medicală

 II. Explorarea fibrinolizei
3. Antiplasmina
• Plasmina mediază fibrinoliza și antiplasmina inhibă plasmina
• Factorul XIII activat leagă antiplasmnia la fibrină, protejând-o de
fibrinoliză
• Antiplasmina se leagă și de plasminogen și îl poate împiedica să se
lege la fibrină
• Determinarea antiplasminei nu se face de rutină
• Valori normale:
• 48 – 80 mg/dl (metada imunologică);
• 80 – 130% (metoda funcțională).
II. Explorarea fibrinolizei
3. Antiplasmina
Metoda funcțională:
• plasmina în exces este adaugată peste plasmă
• excesul clivează un substrat cromogenic, eliberându-l și
putând fi detectat prin spectrofotometrie

Metoda imunologică:
Folosește anticorpi specifici anti-antiplasmină
 II. Explorarea fibrinolizei
3. Antiplasmina
• Deficit dobândit de antiplasmină:
• Disfuncție hepatică
• Terapie trombolitică
• Consum (CID)

• Deficit ereditar de antiplasmină:

• Cantitativ – tip I
• Calitativ – tip II
II. Explorarea fibrinolizei
4. D-dimeri și produși de degradare ai fibrinei
• Fibrinoliza este mediată de plasmină

• Plasmina degradează :
• Trombii de fibrină la D-dimeri și produși de degradare ai fibrinei (PDF)
• Fibrinogenul intact generând produși de degradare ai fibrinogenului (PDF)

• Prezența D-dimerilor indică faptul că fibrina s-a format și a fost degradată

• Prezența PDF indică faptul că fibrina/fibrinogenul sunt degradate

• Valori normale:
• D-dimeri < 0,5 micrograme/ml
• PDF < 5 micrograme/ml
II. Explorarea fibrinolizei
4. D-dimeri și produși de degradare ai fibrinei
II. Explorarea fibrinolizei
4. D-dimeri și produși de degradare ai fibrinei

• Metodologie:
• Latex aglutinare – semicantitativă și cantitativă
• ELISA - cantitativă
• SimpliRed (sange integral) - semicantitativă

• Nu se folosește de rutină pentru monitorizarea terapiei trombolitice

II. Explorarea fibrinolizei
4. D-dimeri și produși de degradare ai fibrinei

Exemple de situații în care D-dimerii și PDF pot fi pozitive:

• CID
• Tromboza venoasă
• Infarct miocardic
• Disfuncție hepatică (scade clearence-ul hepatic)
• Postoperator
• Sângerare semnificativă
• Cancer (grad scazut de CID cronic)
II. Explorarea fibrinolizei
5. Timpul de liză a cheagului de euglobuline (TLCE)
• TLCE este cea mai rapidă metodă de investigare a fibrinolizei

• are avantajul că poate fi efectuată şi pe sânge heparinizat

• este un test global, care măsoară acţiunea activatorilor plasminogenului

şi plasminei

• Valori normale ale TLCE: liza cheagului euglobulinic se realizează în

aproximativ 3 ore

• Valori scăzute ale TLCE apar în hiperfibrinoliză (când cantitatea de tPA

circulant este crescută)
II. Explorarea fibrinolizei
5. Timpul de liză a cheagului de euglobuline (TLCE)
Metoda :
• euglobulinele sunt proteine insolubile în apa pură dar care devin solubile în
apă în prezenţa electroliţilor

• pentru obţinerea precipitatului de euglobuline, este necesară diluţia şi apoi

acidifierea plasmei cu acid acetic

• precipitatul de euglobuline rezultat conţine numai factori de coagulare (V, VII,

VIII, IX), plasminogen, fibrinogen, tPA şi uPA

• inhibitorii activatorilor plasminei rămân în soluţia supernatantă, care se

îndepărtează, asigurâd în felul acesta o specificitate mult mai mare testului
Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
• Rezistența la proteina C activată și mutația factorului V Leiden
• Antitrombina
• Antiplasmina
• Proteina C
• Proteina S
• Plasminogen
• Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1
• Teste de agregare plachetară
• Timp de trombină
• Timp de reptilază
• Anticorpi antifosfolipidici
• Mutatia G20210A a protrombinei
 Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Exemple de cauze ereditare de hipercoagulabiliate
Boala Prevalența în populația Prevalența în populația
generala cu TV

Deficienta de 0,17 1-5

antitrombina
Deficienta de proteina C 0,14 – 0,5 3-9
Deficienta de proteina S 0,7 2-8
Protrombina G20210A 2 6

Hiperhomocisteinemie 5-10 10-25

(inhibă anticoagularea,
stimulează activarea și
agreagarea plachetară,
toxicitate directă asupra
celulelor endoteliale)
Factor V Leiden 5 (Caucazieni) 20-50
Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Cauze dobândite de hipercoagulabilitate – anticorpii antifosfolipidici

• Sindromul antifosfolipidic – afecțiune autoimună caracterizată prin

prezența anticorpilor antifosfolipidici, trombozelor arteriale și/sau venoase
și a pierderilor de sarcină repetate

• Anticorpii antifosfolipidici au semnificație clinică numai în prezența sdr

fosfolipidic (sindrom primar sau asociat altor boli autoimune)

• Anticorpii antifosfolipidici cuprind: anticoagulantul lupic, anticorpii

anticardiolipidici și anticorpii cardiolipidici care recunosc molecule țintă
specifice (beta 2 glicoproteina I, protrombina, proteina C, proteina S, etc)
Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Cauze dobândite de hipercoagulabilitate – anticorpii antifosfolipidici
Mecanismul exact prin care aceşti anticorpi determină apariţia
trombozei nu este cunoscut; câteva ipoteze sunt propuse –
activarea plachetelor, activarea celulelor endoteliale şi interacţiunea
cu beta2 glicoproteina I ( proteina serică ce leagă fosfolipidele
anionice de la suprafaţa celulelor endoteliale şi are efect
anticoagulant).

Anticorpi anti-cardiolipină:
- se determină prin metoda ELISA
- reacționează încrucișat cu antigenele din sifilis
Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Cauze dobândite de hipercoagulabilitate – anticorpii antifosfolipidici
Lupusul anticoagulant:

- pare să se lege de fosfolipide, împiedicând acțiunea acestora de

cofactor în cascada coagulării
- două teste screening + test mixing (daca e +) + teste de
confirmare (cu exces de fosfolipide)
- dacă LA este prezent testele de coagulare ramân prelungite
dupa efectuarea mixingului
 Anticorpi antifosfolipidici

TESTE SCREENING

alungit normal

STUDII DE MIXING

Identificarea deficitului de
nemodificat scurtare
factor de coagulare

TESTE DE CONFIRMARE (cu

fosfolipide in exces)

Scurtarea timpului de
coagulare
Exemple practice
Panelul CID
• Timpul de tromboplastină parțial activată (APTT)
• Timpul de protrombină (PT)
• Hemograma completă
• D-dimeri
• Produși de degradare ai fibrinei/fibrinogenului (PDF)
• Fibrinogen
Exemple practice
Panelul CID
• CID acut:
• Creșterea D-dimeri, PDF
• Prelungirea APTT (50% din cazuri) și PT (70% din cazuri)
• Scăderea fibrinogenului (50% din cazuri)
• Scăderea numărului de plachete

• CID cronic:
• Creșterea fibrinogenului și plachetelor
• Scurtarea PT și APTT
• Creșterea D-dimeri, PDF
Exemple practice
Panelul CID
• CID este o situaţie patologică de etiologie multifactorială, secundară altei
afecţiuni (sepsis, complicaţii obstetricale, traumatisme, arsuri, intevenţii
chirurgicale, incompatibilitate de grup sangvin, boli hepatice, neopasme etc.)

• se produce o activare intravasculară accelerată, difuză şi neadecvată a

coagulării

• consumul excesiv de factori de coagulare şi trombocite, concomitent cu o

generare masivă intravasculară de fibrină, vor conduce la apariţia simultană
atât de tromboze, cât şi de hemoragii (clinic se constată hemoragii cu
cheaguri).
Exemple practice
Panelul CID
• cauza CID o reprezintă afectarea severă a microvascularizaţiei (apariţia unei
electro-negativităţi la suprafaţa endoteliului în teritorii vasculare întinse), care
poate conduce la disfuncţie multiplă de organ
• lezarea endotelială sau tisulară determină activarea masivă a factorilor de
coagulare şi consumul excesiv al acestora, astfel încât, se ajunge la un deficit
de factori
• în timpul acestui proces, trombina şi plasmina (enzime proteolitice) sunt
activate
• trombina amplifică procesul de coagulare şi poate induce tromboze, iniţial la
nivelul vaselor mici şi ulterior şi în vasele mari
• mecanismul reglator al cascadei coagulării reprezentat de TFPI (Tissue Factor
Pathway Inhibitor), AT-III şi PCA (proteină C activată) fiind deficitar, se
formează cantităţi mari de fibrină, cu apariţia obstrucţiilor vasculare
Bibliografie

• Hoffman M, Monroe DM. Coagulation 2006: a modern view of

hemostasis. Hematol Oncol Clin North Am 2007;21:1-11.
• O'ShaughneSNVS D, Makris M, Lillicrap D. Practical hemostasis and
thrombosis. Blackwell Publishing 2006.
• Porth CM. Essentials of pathophysiology (ed 5). Lippincott Williams &
Wilkins 2011
• Daniela Filipescu. Hemostaza normală și patologică. SRATI 2010
• http://practicalhaemostasis.com/Data%20Interpretation/Data%20Qu
estions/data_interpretation_screening_tests.html