Modele cinetice ale proceselor enzimatice

Procesele enzimatice sunt catalizate de o enzimă şi pot avea un activator

(A) şi un inhibitor (I) al activităţii acesteia;

Enzimele sunt proteine – macromolecule cu masă foarte mare – formate

din lanţuri de aminoacizi având o configuraţie spaţială complicată;

Enzimele au un situs (centru) activ responsabil de legătura cu substratul

de reacţie şi conversia sa în produşi;

Legăturile cu substratul sunt de tip Van der Waals, de hidrogen,

electrostatice;

in-vivo (în celula vie) ducând la modificări

Enzimele acţionează fiziologice (reglabile);
in-vitro (cu enzime imobilizate pe un
suport);

1
Enzimele acţionează cu o mare specificitate, de regulă pentru o singură
reacţie şi prin ”recunoaşterea” fiecărui substrat pe care îl leagă formând
un complex activat;

Reacția este foarte specifică: E S   ES    ES  *activat  P

Enzimă
Substrat (S) Produs (P)
(E)
Procesele cu enzime imobilizate ridică probleme suplimentare de
transfer/transport de masă (cu influenţă asupra cineticii aparente) deşi
enzima este mai stabilă;

Schema energetică a unei reacții SP în absența catalizei

sau în prezența biocatalizatorului enzimatic 2
Deoarece substratul şi enzima interacţionează prin intermediul legăturilor
cu raza scurtă de acţiune, care necesită un contact apropiat, substratul
trebuie sa aibă o matriţă corespunzătoare în enzimă.

Specificitatea foarte mare de i) substrat, ii) de reacţie şi iii) stereochimică

a acţiunii enzimelor este determinată de structura şi proprietăţile lor şi a
fost explicată prin mai multe teorii:
- mecanismul cheie-lacăt cu formarea complexului activat

- mecanismul geometriei induse

 fără inhibiţie;
= procesele enzimatice prin substrat (S);
cu inhibiţie prin produs (P);
printr-o substanţă străină (I);
complexă.

cu co-enzimă (co-reactant);
= procesele enzimatice cu promotor/activator;
fără co-enzimă;

temperatură;
= activitatea enzimei este foarte sensibilă la pH;
inhibitor;

= fiecare enzimă prezintă un domeniu optim de temperatură şi pH la

care activitatea sa este maximă.
4
 Avantajele şi dezavantajele utilizării catalizatorilor
enzimatici:

Avantaje Dezavantaje
Specificitate ridicată Complexitate moleculară
Activitate crescută în condiţii blânde de reacţie ridicată
Numărul de „turnover” mare (componentă a Costuri de producere,
vitezei maxime de reacție) purificare ți stabilizare mari
Biodegradabilitate Fragilitate intrinsecă (la agenți
În general produşi naturali, puțin alergenici fizici, chimici, biologici)
 Modele cinetice enzimatice
 Pentru a determina viteza de reacţie trebuie generată o curbă ce ilustrează
variaţia concentraţiei substratului sau a produsului în funcţie de timp.
 În cazul conversiei unui substrat S într-un produs P, forma generală a
curbei va fi dată de:
• descreşterea exponenţială de ordin I
a concentraţiei de substrat:
 
CS - CSmin  CS0 - CSmin e  kt

• sau de creşterea exponenţială de

ordin I a concentraţiei de produs:
 
CP - CP0  CPmax - CP0 1 - e -kt  Variaţia concentraţiilor
substratului şi produsului în timp

În care: CS0 = concentraţia iniţială a substratului (S);

Csmin = concentraţia minimă de substrat la timpul t → ;
CS = concentraţia de substrat la timpul t;
CP0 = concentraţia iniţială de produs la timpul t = 0;
Cpmax = concentraţia minimă de substrat la timpul t → ;
CP = concentraţia de produs la timpul t. 6
 Viteza reacţiei este dată de panta corespunzătoare curbei obţinute, şi anume:

dS dP
v -  k
dt dt

 Viteza de reacţie scade în timp datorită următoarelor cauze:

• enzima devine instabilă pe parcursul desfăşurării reacţiei;
• gradul de inhibiţie al enzimei descreşte cu descreşterea substratului;
• reacţia reversibilă devine determinantă pe măsură ce se acumulează
produsul;
• produsul reacţiei inhibă enzima;
• orice combinaţie a factorilor enumeraţi mai sus.

 Curba obţinută pentru reacţiile enzimatice nu poate fi comparată cu

modelele standard ale reacţiilor chimice omogene. Prin urmare a fost
necesară o altă abordare, a fost introdus ca termen de măsurare a vitezei
de reacţie viteza iniţială.

7
 La începutul unei reacţii enzimatice:

• gradul de conversie S  P este destul de mic şi astfel concentraţia

substratului poate fi considerată constantă şi egală cu cea iniţială:
CSt  CS0

• cantitatea de produs acumulată este foarte mică:

CPt  0

• se poate considera că reacția inversă este neglijabilă;

• posibilele efecte inhibitoare ale produsului sau cele determinate de
activitatea enzimatică sunt nesemnificative;

• se poate consideră că enzima rămâne stabilă în stadiile incipiente

ale reacției;

 Pentru a obține vitezele inițiale se trasează o tangentă la curba obținută

anterior care să fie cât mai aproape de origine (vezi figura următoare).
Panta acestei drepte trasate (adică viteza inițială) se obține prin regresie
liniară:
8
 Determinarea vitezei inițiale a unei reacții enzimatice
 De cele mai multe ori, forma curbei variază în funcție de: pH, temperatură,
tărie ionică, polaritate, tipul substratului, concentrațiile enzimei ți a
coenzimei, etc.
 Pentru a determina viteza unei reacții, cercetătorii se bazează de prea
multe ori pe măsurătorile obținute, măsurători care nu caracterizează
întotdeauna procesul pentru toate condițiile studiate. Din acest motiv,
pentru a obține o analiză cinetică corectă, este esențial ca vitezele de
reacție să fie determinate din regiunea inițială a curbei.
 În caz contrar există riscul ca, prin alegerea unui moment de timp nepotrivit
pentru derivare, să nu se obțină o relație liniară între viteză ți concentrația
enzimei (aceasta fiind o cerință necesară în analiza cinetică enzimatică).
9
 Pentru ca reacția să fie cinetic controlată de către enzimă, viteza reacției
trebuie să fie direct proporțională cu concentrația acesteia:

Dependența vitezei inițiale a reacției

de concentrația enzimei din amestecul
de reacție

 În concluzie, pentru a colecta date valide din punct de vedere cinetic,

trebuie să se țină cont de următoarele aspecte:
• enzima trebuie să fie stabilă pe durata măsurătorilor utilizate în
calculul vitezelor inițiale;
• vitezele inițiale sunt utilizate ca viteze de reacție;
• viteza de reacție trebuie să fie proporțională cu concentrația
enzimei.
10
 Cinetică enzimatică cu inhibiție de substrat
(modelul Michaelis-Menten)

 Cea mai simplă ți mai veche descriere cantitativă cinetică a procesului

enzimatic este modelul Michaelis-Menten (M-M):
k1 k2
S+E (ES) P+E
k-1

(S = substrat, E = enzima, P = produs, ES = complex activat)

 Pentru a deduce expresia cinetică M-M a reacției enzimatice se aplică teoria

stării staţionare care consideră că, în orice moment, vitezele de formare şi
de scindare ale complexului ES sunt egale, astfel încât:
• pentru o perioadă scurtă de timp, concentraţia complexului poate fi
d(ES)
considerată ca fiind constantă:  0;
dt 11
• pentru perioade mai mari de timp, concentraţia complexului ES se
modifică deoarece reacţia progresează şi concentraţia substratului
scade, dar viteza modificării concentrației ES va fi întotdeauna mult mai
mică decât viteza reacţiei enzimatice;

• în acest fel, postulându-se că specia ES se află la cvasi-staționaritate,

d(ES)
,0 ți obținerea produsului (P) este etapa determinantă de viteză
dt
se obține: E0  Et  E  ( ES )

dS
  k1  S  E  k 1  ( ES ) So
dt
P
d(ES)
 0  k1  S  E  ( k 1  k 2 )  ( ES )
dt

 (ES)
k S E Eo
(ES)  1
k 1  k 2
S  S0 0 Timp
t 0
( ES )0  0 12
 dS
  k1  S  E  k 1  ( ES )
dt
k1  S  E E0  k 1  E0  k 2  k1  S  E
E  E0  ( ES )  E0  
k 1  k 2 k 1  k 2

E  k 1  E  k 2  E0  k 1  E0  k2  k1  S  E


k 1  k 2
E  E0
k 1  k 2  k1  S
dS
Substituind în ipoteza de cvasi-staționaritate rezultă:
dt
dS
  k1  S  E  k 1  ( ES )  k 2 ( ES )
dt
dS k  k  E  S k1  k 2  S k 1  k 2
  k 2 ( ES )  1 2   E0 
dt k 1  k 2 k 1  k 2 k 1  k 2  k1  S
dS k1  k 2  S  E0 k 2  S  E0
 
dt ( k 1  k 2 )  k1  S k 1  k 2
S
k1 13
 dS V maxS
rS   
dt K M  S

Vmax  k 2  E0 ; (k2 = turnover-number, specific fiecărei enzime)

unde: k 1  k 2
KM  ; (KM = constanta Michaelis-Menten,1913)
k1

Alte forme ale ecuației Michaelis-Menten

k1  k 2
 rS  rp   S  E0
k 1
k1  k 2
 rS  rp   S  E0
k 1  k 2

k2
 rS  rp   S  E0
k 1
S
k1
14
 Cazurile limită ale ecuației M-M:
Vmax  S
S  K M rS 
KM

S  K M rS  Vmax  constant

0.1 K M  S  10 K M rS  ecuația M-M cu abatere de maxim 10%

15
Semnificația fizică a KM:

k1 ( ES )
 K eq  (echilibru prima reacție)
k 1 SE
1 k1 ( ES )
 
K M k 1  k 2 S  E

k 2  k 1 (echilibru rapid)

( ES ) S enzimă legată
 
E K M enzimă liberă

Dacă: KM  S ½ E este legată ți ½ E este liberă

Dacă: K M  S toată enzima este legată

Dacă: K M  toată enzima este liberă

16
 Mecanismele inhibiției enzimatice

Reacție fără inhibiție Reacție cu inhibitor competitiv

Reacție cu inhibitor incompetitiv Reacție cu inhibitor necompetitiv

17
 Modele cinetice enzimatice cu inhibiție

 Inhibiție competitivă
k1 k2
S+E (ES) P+E
k-1
I+E (EI)
Ki
1 k
 i
K i k 1

I = I0 (concentrație inhibitor)
k 1  k 2
KS 
k1
Vmax  S
rP  ; V max  k 2  E 0 ;
 I 
K S  1    S
 K I  E 0  E  ES  EI

dP
rP   k 2 ( ES )
dt
18
  Inhibiție ne-competitivă (non-competitive)
k1 k2
E+S (ES) E+P
k-1
k3 k-3 + I k4 k-4 + I
k5
EI (ESI)
k-5
• are loc la concentrații foarte mici ale S ;
• inhibitorul se leagă la un situs distinct de
cel al substratului, numit situs de legare;
• Vmax nu este atins niciodată, nici chiar la
concentrații foarte mari ale substratului;
V max  k P  E 0
Vmax  S
rP 
 I 
 1     K S  S 
 KI 
• inhibitorul reduce rp prin blocarea
centrilor activi; 19
 Vmax  S1  S2
• cinetica M-M cu dublu substrat:  rS  rP 
( K M1  S1 )  ( K M2  S2 )

 Inhibiție incompetitivă (un-competitive)

k1 k2
E+S (ES) P+E
k-1
ki k-i + I

(ESI)

Vmax  S
rP 
 I 
K S  S   1  
 KI 

• are loc la concentrații foarte mari ale

substratului (S);
• asemănătoare catalizei chimice (A* + B*)
cu reacție pe suprafață.
20
  Inhibiție alosterică

k1 kcat
nS + E (ESn) nP + E
k-1

Vmax  S n
 rS  rP 
K Sn  S n

V max  k cat  E 0

Inhibiție alosterică

Activare alosterică 21
  Exemple

• KCN este un inhibitor ireversibil al enzimei Citocrom C oxidaza,

care ia parte la procesul de respirație al unei celule. Dacă enzima
este inhibată, atunci nu este produs ATP din lipsa oxigenului. Prin
urmare celulele vor respira anaerob, ceea ce va duce la
acumularea acidului lactic în organism.

• Succinat dehidrogenaza, o
enzimă care intervine în ciclul
acidului citric ți care poate
converti succinatul la fumarat,
este inhibată competitiv de
malonat (compus omolog cu
succinatul, dar care nu poate fi
dehidrogenatâ).
• Există inhibitori care se leagă ireversibil de enzimă ți sunt utilizați
ca medicamente. Spre exemplu penicilina acționează prin legarea
covalentă de transpeptidază, ceea ce împiedică sinteza pereților
celulari ai bacteriei, iar aceasta moare.

• Inhibarea proteazei HIV

face enzima incapabilă
de a procesa precursorul
poliproteic gag- pol,
ceea ce duce la
producerea de particule
HIV cu morfologie
imatură, care nu sunt
capabile de a iniţia noi
cicluri de infecţie.
• Etanolul este folosit în contracararea otrăvirii cu metanol.
Metanolul insusi este un compus cu toxicitate medie. Enzima
alcool dehidrogenază convertețte metanolul la formaldehidă
(cantități mici pot provoca orbirea sau uneori chiar moartea).
Etanolul este în competiție cu metanolul pentru legarea la situsul
catalitic al alcool dehidrogenazei din ficat determinând astfel
diminuarea producerii de formaldehidă din metanol. Odată cu
administrarea etanolului o mare parte a metanolului este eliminată
din organism înaintea conversiei la aldehidă.