Sunteți pe pagina 1din 43

Master Biologie Medical

2011-2012

PATOLOGIE CELULAR I MOLECULAR


Conf.dr. Marina Nechifor

Bibliografie
S.R. Goodman (2008) Medical Cell Biology, ed.III, Academic Press. V. Kumar, A.K. Abbas, N. Fausto (2005) Robins & Cotran Pathologic Basis of Disease, ed.VII, Elsevier. T.Finkel, J.S. Gutkind (2003) Signal Transduction and Human Disease, ed.I, John Wiley & Sons Publications. D.W. Ross (2002) Introduction to Molecular Medicine, ed.III, Springer. B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge (1999) Free Radicals in Biology and Medicine, ed.III, Oxford University Press.

Rspunsul celular la factori de stres


1915 - Walter Cannon menioneaz pentru prima oar termenul stres, cu sensul de mecanism de adaptare al organismului fa de schimbrile mediului extern. Fondatorul conceptului de stres sau al sindromului de adaptare este considerat endocrinologul i biochimistul austro-ungar Hans Hugo Bruno Selye (1952). 1956 The Stress of Life 1977 nfiinarea Institutului Naional al Stresului n cadrul Universitii din Montreal.

Selye a pus bazele teoretice i practice pentru argumentarea sindromului general de adaptare (General Adaptation Syndrome GAS) i a introdus n circulaia internaional conceptul de stres. Cuvntul a fost preluat ulterior ca atare n toate limbile (n franceza Le stress, n german Derr Stress, n romn Stres).
Selye consider c stresul evolueaz la nivelul organismului n trei stadii: reacia de alarm, prin care sunt activate funciile vitale n vederea neutralizrii efectului nociv al agentului stresant, stadiul de rezisten sau adaptare, n care sunt mobilizate toate mijloacele de aprare pentru a stabili un echilibru fa de noile condiii, i stadiul de epuizare, determinat de un agent stresant puternic i cu aciune de durat, stadiu final n care organismul cedeaz.

Definirea termenului STRES


n Dicionarul de psihologie social (1981, Mihai Golu), stresul este definit drept: o stare de tensiune, ncordare i disconfort, determinat de ageni afectogeni cu semnificaie negativ, de frustrarea unor stri de motivaie (trebuine, dorine, aspiraii), de dificultatea sau imposibilitatea rezolvrii unor probleme. Prin termenul de stres sunt definite att situaia, stimulul provocator, ct i starea de tensiune n care ajunge organismul i pentru depirea creia acesta trebuie s i mobilizeze toate resursele.

Stresul la nivelul organismului


Stimulii provocatori - factori fizici, chimici, biologici, psihici, sociali - pot genera diferite forme de stres: stres fizic, stres psihologic, stres de suprasolicitare, stres de subsolicitare. Afeciuni asociate stresului: expunerea repetat la situaii de stres pe o perioad prelungit este asociat cu apariia tulburrilor de ritm cardiac i a infarctului, probleme circulatorii, tulburri neurologice, scderea imunitii, obezitate, diabet, disfuncii sexuale. Asociaia American de Psihologie susine c peste 45% dintre aduli se confrunt cu probleme de sntate cauzate de stres.

Stresul la nivel celular

La nivel celular, stresul este definit ca o modificare acut sau cronic a parametrilor normali ai mediului celular. Stresul declaneaz la nivel celular mecanisme adaptative, de supravieuire, dar n condiiile n care care este depit toleran celulei factorul de stres va induce moartea celular.

Cell Stress Society International


The Society is open to any qualified researcher investigating stress responses using molecular and cellular approaches, or bridging from the molecular and cellular level to organismal biology including studies of natural populations and to clinical and environmental applications. The society promotes collaboration among the various fields of stress research, international scientific cooperation, and public awareness.

Factori de stres la nivel celular


Dintre factorii intra- i extracelulari capabili s induc stresul celular pot fi menionai: ocul termic, speciile reactive de oxigen (ROS) n stresul oxidativ, hipoxia, radiaiile ultraviolet i ionizante, variaiile compoziiei sngelui n stresul chimic, variaiile presiunii/forelor de forfecare exercitate de debitul sanguin n stresul mecanic, variaiile cmpului geomagnetic, leziunile ADN-ului n ocul genotoxic, ocul osmotic, suprancrcarea cu proteine a reticulului endoplasmic (cauzat de plierea eronat a proteinelor).

Rspunsul celular
Fa de aciunea factorilor de stres celula are numai dou opiuni: adaptarea sau moartea. Adaptarea presupune diferite reacii celulare care activeaz mecanismele de rezisten i de reparare ce permit integrarea proceselor determinate de stres n funcionarea normal. Moartea. n condiiile n care durata i sau intensitatea factorului de stres depesc capacitatea celulelor de a elabora mecanisme adaptative sunt activate ci de moarte celular programat (apoptoza, paraptoza, autofagia) i celula se sinucide. Consecinele stresului depind de natura, intensitatea i durata aciunii factorului de stres, dar i de tipul celular i stadiul de difereniere al celulei.

Activarea cilor de rspuns la factori de stres


A. n condiii normale, n absena unui factor de stres, TF (factorul transcripional) este inactiv fiind degradat sau sechestrat prin interaciunea cu senzorul la stres. Sub aciunea factorului de stres sunt activate ci de traducere ce conduc la modificarea covalent a senzorului i/sau aTF. TF eliberat (activat) moduleaz expresia unor gene int ce permit celulei s elaboreze un rspuns adaptativ sau s activeze programul morii (apoptoza).

B.

C.

ocul termic
Proteinele de oc termic (hsp heat shock proteins) au fost descoperite de ctre Ferrucio Ritossa n mod accidental, n cadrul unor experimente de genetic ce urmreau sinteza acizilor nucleici la nivelul cromozomilor politeni din glandele salivare de Drosophila melanogaster pe parcursul dezvoltrii larvare (Ritossa, 1962). Proteinele codificate de aceste gene au fost identificate ulterior, fiind adoptat termenul de protein de oc termic (Tissieres i colab., 1974).

Cromozomi politeni din glandele salivare de Drosophila melanogaster

Proteinele de oc termic (HSP)


Proteinele de oc termic reprezint un set de proteine cu mase moleculare cuprinse ntre 10 i 110 kDa, a cror expresie este indus rapid i masiv ca rspuns la expunerea celulelor sau organismelor la temperaturi ridicate. Numeroi ali factori de stres (ioni ai metalelor grele, radiaii UV, anoxie, etanol, infecii virale) induc sinteza acestor proteine. Expresia hsp sub aciunea moderat a unor factori de stres e nsoit, n general, de dobndirea tranzitorie a toleranei fa de stresuri mai severe .

Celulele i-au dezvoltat mecanisme care s asigure extrem de rapid sinteza proteinelor de stres termic dup expunerea la factorii de stres. Rspunsul rapid este dirijat de aciunea combinat a mai multor mecanisme reglatorii ce acioneaz la nivel transcripional, la nivelul procesrii RNA, al tunoverului RNA i la nivel translaional. Reglarea expresiei genelor hsp este controlat de factori nucleari ce poart denumirea de HSF (heat shock factors), de proteinele HSP nsele, precum i de polipeptidele depliate, non-native, ce sunt generate n condiii de stres. O particularitate a acestor mecanisme de reglare o constituie implicarea HSP, n special a HSP70 n propria cale de sintez.

Mecanismul de aciune al HSP


Factorii de stres care determin deplierea catenelor polipeptidice, plierea eronat sau formarea de agregate proteice, activeaz rspunsul la stres ce const n activarea transcripiei genelor ce codific proteine capabile s stabilizeze, s replieze sau s degradeze proteolitic proteinele modificate. n acest mod se restabilete echilibrul dintre sinteza proteic, plierea n conformaie biologic activ i degradare.

Reglarea transcripiei genelor de oc termic de ctre factorul de oc termic (HSF). n urma expunerii la factori de stres se formeaz un flux de proteine non-native (denaturate), conducnd la eliberarea HSF, fosforilarea i trimerizarea HSF. Trimerii se fixeaz de regiunile promotor ale genelor de oc termic i activeaz transcrierea genelor hsp. Activitatea trimerilor HSF este reglat negativ de proteinele HSP (de exemplu, HSP70) i de proteina HSBP1 (heat shock binding protein 1).

Mecanismul de reglare al expresei genelor hsp este controlat de HSF-1, de proteinele HSP nsele i de proteinele denaturate (depliate sau pliate incorect)

Funciile proteinelor de oc termic


HSP moduleaz plierea i deplierea proteinelor, faciliteaz asamblarea proteinelor cu structuri complexe, cuaternare (formate din subuniti) i promoveaz degradarea proteinelor pliate eronat i a proteinelor denaturate. ntruct elementul cheie n funcionarea HSP const n prevenirea asocierii eronate i a exprimrii unor activiti improprii, aceste proteine pot fi considerate membrii ai clasei de proteine chaperone. De asemenea, unele HSP pot funciona ca enzime, participnd la ci metabolice afectate de expunerea la stres.

Clasificarea proteinelor de oc termic


Denumire
Ubiquitina Hsp10 Hsp27 Hem oxigenaza-1 Hsp47 Hsp56 Hsp60 Hsp72 Hsp73 Hsp75 Grp78 (Bip) Hsp90 Hsp110

Greutate molecular (kDa, valoare aprox.)


8 10 27 32 47 56 60 70 70 70 90 90 110

Localizare celular
citosol/nucleu mitocondrie citosol/nucleu citosol reticul endoplasmic citosol mitocondrie citosol/nucleu citosol/nucleu mitocondrie reticul endoplasmic citosol/nucleu citosol/nucleu

Particulariti funcionale
degradarea proteinelor cofactor al hsp60 reglarea creterii i diferenierii UVA-inductibil; protecie fa de leziunile oxidative chaperone pentru colagen component a receptorului pentru steroizi chaperone molecular chaperone molecular nalt inductibil la stres chaperone molecular cu expresie constitutiv chaperone molecular cu expresie constitutiv chaperone molecular cu expresie constitutiv component a receptorului pentru steroizi chaperone molecular necesar pentru supravieuirea la stresuri severe

Familiile majore de HSP


Cu funcie de chaperone:

Hem-oxigenaza 1 (32 kDa)

Cu funcie enzimatic:

Hem-oxigenaza 1 (32 kDa)

Cu rol n reglarea proteolizei:

Ubiquitina (8 kDa)

Familia Hsp70
Reprezint una dintre cele mai importante i numeroase familii de proteine de oc termic, prezente n majoritatea organismelor. Genomul Escherichiei coli codific un singur tip de Hsp70, numit DnaK. Celulele eucariote codific mai multe tipuri de proteine aparinnd familiei Hsp70, fiecare dintre acestea prezentnd o identitate de cel puin 50% cu proteina de la E.coli. Multitudinea Hsp70 de la eucariote este corelat cu prezena lor n compartimentele majore ale celulei: citoplasm, nucleu, reticul endoplasmic, mitocondrii, iar la plante n cloroplaste. La organismele multicelulare exist i Hsp specifice de esut.

Rolul Hsp70
Proteinele Hsp70 asist proteinele int n adoptarea unei anumite conformaii: particip la procese de pliere, depliere, asamblare, dezasamblare, procese care necesit energia de hidroliz a ATP. Modelul care explic rolul Hsp70 presupune legarea lor la suprafeele hidrofobe, prevenind asocierile ntmpltoare i stabiliznd proteinele int ntr-o conformaie total sau parial nepliat. La temperaturi ridicate, pe msur ce proteina se depliaz, Hsp70 se leag de secvenele care n mod normal sunt ascunse n miezul hidrofob al proteinei, prevenind agregarea i facilitnd readoptarea structurii native, atunci cnd temperatura revine la valori normale.

Sistemul Hsp70/Hsp40/BAG-1 (DnaK/DnaJ/GrpE - omologul de la bacterii)

Organizarea structural a Hsp70


Proteinele Hsp70 prezint dou domenii structurale: un domeniu NH2-terminal responsabil de funcia ATP-azic i un domeniu COOH-terminal implicat n legarea substratului peptidic. Structura secundar i cea teriar a domeniului ATP-azic sunt aproape identice cu cele ale actinei. Domeniul de legare a substratului peptidic are o conformaie extins, fiind mrginit de un subdomeniu cu structur -pliat i un subdomeniu cu structur -helicoidal. Acest domeniu fixeaz o secven de 7 resturi de aminoacizi din structura substratului peptidic care rmne sechestrat la nivelul Hsp70 n urma plierii subdomeniului -helicoidal peste subdomeniul -pliat. Capetele substratului peptidic ies n afara domeniului de legare.

Domeniul de legare a substratului peptidic

Familia Hsp60 (Chaperonine)


La eucariote, proteinele Hsp60 se gsesc n mitocondrii i cloroplaste. n condiii de stres, Hsp60 au o nalt afinitate pentru proteinele complet denaturate. n condiii fiziologice, Hsp60 asigur transportul i plierea proteinelor mitocondriale nou-sintetizate importate din citosol (asist plierea catenelor polipeptidice i asamblarea subunitile individuale ale unor proteine cu structur oligomer). GroEL (omologul bacterian al Hsp60) este una dintre cele mai abundente proteine de la bacterii, ce se exprim constitutiv chiar n condiii de temperaturi normale.

Organizarea structural a Hsp60/GroEL


(Proteinele Hsp60 i Hsp10 de la EK sunt aproape identice din punct de vedere structural i funcional cu GroEL, respectiv GroES de la bacterii) (a) vedere de sus; (b) vedere lateral. Proteina Hsp10 (GroES) se fixeaz prin intermediul unor bucle mobile de domeniile de fixare a substratului din structura Hsp 60 (GroEL).

Reprezentarea schematic a unei subuniti din structura GroEL: domeniul apical, intermediar i ecuatorial i regiunile flexibile (balama)

Structura complexului GroEL-GroES la E.coli:


(a) vedere de sus; (b) vedere lateral.; (c) seciune longitudinal ce prezint cavitatea intern.

Mecanismul de aciune al complexului GroEL/GroES

Modificarea conformaional indus de legarea ATP

Complexele Hsp60/Hsp10 i TriC/CCT implicate n plierea ATP-dependent a proteinelor.


Tric TCP-1 ring complex CCT chaperonin containing TCP-1

Hsp de dimensiuni mici ( 34 kDa)


Familia small HSP cuprinde proteinele care sunt cel mai puin conservate din punct de vedere filogenetic dintre toate tipurile de Hsp. Caracteristica structural este dat de existena unei structuri secundare -pliate caracteristice i de omologia de secven cu proteinele cristalinului. Small HSP se fixeaz de proteinele nepliate i mpiedic agregarea lor ireversibil la temperaturi ridicate. Small Hsp coopereaz cu sistemul Hsp70 pentru replierea corect a proteinelor expuse la temperaturi ridicate. sHsp din celulele umane cuprinde11 membri i sunt grupate i sub denumirea de familia Hsp27. Expresia Hsp27 este corelat cu creterea i diferenierea celular. n diferite esuturi ale organismului uman (uter, vagin, oviduct, piele) a fost identificat un nivel crescut al Hsp27. Aceast expresie constitutiv a Hsp27 reprezint un factor determinant al rezistenei celulare la stres.

Organizarea structural a sHSP


Formeaz structuri de mari dimensiuni alctuite din numeroase subuniti (12-24 de monomeri) Dinamica structurilor oligomere este controlat prin fosforilare.
Triticum aestivum -12 monomeri
Methanococcus jannaschii (archaebacterie termofil) -24 monomeri

Cooperarea dintre diferitele tipuri de Hsp


(ex. cooperarea dintre mtHsp70 i Hsp60/Hsp10 n matricea mitocondrial)

Prefoldina chaperone molecular cu structur


heterohexameric (2 subuniti i 4 subuniti ) prezent la archaebacterii i eucariote (inclusiv organismul uman).
Prefoldina acioneaz ca chaperone molecular, n combinaie cu alte proteine, pentru a promova plierea corect a catenelor polipeptidice, fr consum de ATP. Prefoldina preia catena polipeptidic ce urmeaz s fie pliat corect de la Hsp70.

Diferitele tipuri de Hsp i cofactorii asociai acioneaz sub forma unor complexe i coopereaz pentru a realiza plierea corect a numeroase proteine celulare.

Rolul proteinelor de oc termic n procesele patologice


Infecia viral induce expresia Hsp. Hsp sunt implicate n bolile autoimune. Hsp influeneaz evoluia procesul inflamator. Hsp determin rezistena celulelor canceroase la terapia cu ageni antineoplazici cu activitate antiagiogenic prin activarea mecanismelor de rspuns la stres. Stresul emoional, stresul mecanic i stresul oxidativ induc expresia Hsp. Procesul de mbtrnire este nsoit de declinul capacitii de sintez a Hsp.

Familiile majore de HSP


Cu funcie de chaperone:

Hem-oxigenaza 1 (32 kDa)

Cu funcie enzimatic:

Hem oxigenaza-1 (32 kDa)

Cu rol n reglarea proteolizei:

Ubiquitina (8 kDa)

Hem oxigenaza (HSP32)


(hem, hidrogen-donor: oxigen oxidoreductaza, EC 1.14.99.3), este o protein de oc termic cu funcie enzimatic.
Hem oxigenaza catalizeaz reacia de transformare a hemului n biliverdin, fier i CO.

Hem oxigenaza confer protecie fa de stresul oxidativ prin produsul de reacie, biliveridina, care genereaz bilirubina ce are proprieti antioxidante.

Ubiquitina -

este o protein de oc termic de dimensiuni reduse (8,5 KDa) cu rol n reglarea proteolizei, prezent n toate celulele eucariote.

Hem oxigenaza (HSP32)


(hem, hidrogen-donor: oxigen oxidoreductaza, EC 1.14.99.3), este o protein de oc termic cu funcie enzimatic.
Hem oxigenaza catalizeaz reacia de transformare a hemului n biliverdin, fier i CO.

Hem oxigenaza confer protecie fa de stresul oxidativ prin produsul de reacie, biliveridina, care genereaz bilirubina ce are proprieti antioxidante.

CONCLUZII
Proteinele de oc termic sunt molecule extrem de versatile i rezistente, a cror importan pentru procesele biologice este scoas n eviden de gradul nalt de conservare, de ordin filogenetic, al structurii i funciilor lor native.

O bun nelegere a funciilor lor i posibilitatea de a controla aceste funcii ar putea conduce la folosirea lor ca ageni terapeutici, ceea ce ar putea revoluiona practica medical.