1.Definitie 2.Elemente biologice 3.Metode de imobilizare a elementului biologic 4.Traductori 5.

Aplicatii

CE ESTE UN BIOSENZOR?
Un biosenzor este un dispozitiv format dintr-un element biologic (enzim, biomolecul, anticorp, celule microbiane, esut, etc) ce este imobilizat n vecintatea unui traductor (electrochimic, optic, termic, etc) ce transform un semnalul chimic rezultat n urma interaciei analitului cu elementul biologic ntr-un rspuns msurabil, de obicei ntr-un rspuns electronic.

Analiti Analit / bioreceptor / traductor / procesor microorganisme anthrax, tularemia, E. coli, Candida molecule mici glucoza, alcool, CO, CO2, agenti paralizanti, uree, pesticide, aspirina, paracetamol, penicilina, TNT, colesterol, aminoacizi biomacromolecule DNA, RNA, enzime, proteine, hormoni, virus

1) ENZIME
- cele

mai utilizate in constructia biosenzorilor - catalizatori ai unor reactii- se poate utiliza o enzima sau se pot cupla doua saumai multe reactii enzimatice cu producerea unui compus cepoate fi determinat prin diverse metode Elemente biologice Enzime utilizate in biosenzori - cele mai multe sunt enzime REDOX (reductaze, oxidaze) producatoare /consumatoare de electroni: detectie amperometrica sau colorimetrica - enzimele hidrolitice (proteaze, lipaze, esteraze) producatoare /consumatoare de electroni: detectie potentiometrica sau conductometrica- sisteme enzimatice cuplate, cum ar fi peroxidaza cuplata cu luciferazace duce la obtinerea unui produs colorat sau la emisia de fotoni: detectie optica 2) ANTICORPI / ANTIGENI Anticorpii- proteine ce pot recunoste in mod specific o substanta specifica (antigen) ca mijloc natural de aparare- caracterizati de interactii extrem de selective si puternice cu antigenii specifici- pot fi obtinuti anticorpi pentru aproape orice antigen

Anticorpii in biosenzori
Avantaje: - selectivitate foarte inalta; realizare de legaturi puternice Legarea Dezavantaje: Lant de - nu prezinta efect catalitic, fiind necesara retea determinarea lor indirecta prin marcarea lor cu diversi agenti de marcare. Agenti de marcare: Lant durabil radio-izotopi, enzime, fluorofori, compusi chemiluminiescenti Observatie. In cazul traductorilor Piezoelectrici se poate face o determinare directa datorita modificarilor in frecventa de vibratie a cristalului in urma legarii antigenului

antigen

3) PROTEINE RECEPTOR - proteinele receptor se afla de obicei la suprafata celulei sau in membrana celulara. - pot fi utilizate in special la determinarea neurotransmitatorilor, hormonilor, medicamentelor neuroactive,anestezicelor, etc. - extrem de selective, dar adesea greu se izolat, putandu-se utiliza si biomembrane intacte sau celule intregi. 4) ACIZI NUCLEICI - ADN-ul si ARN-ul pot fi utilizati pentru realizarea unor senzori in format chip - biosenzorii bazati pe ADN si ARN se utilizeaza pentru detectia mutatiilor genetice si pentru determinarea nivelurilor de expresie a proteinelor. 5) CELULE / TESUTURI - biosenzorii bazati pe celule sau tesuturi sunt mai putin selectivi - utilizati in special pentru determinari semicantitative; pentru determinarea indicilor de toxicitate

Metode de imobilizare a componentei biologice

Absorbie

FIZIC

Reinere fizic n spatele unei membrane pentru molecule mici

IMOBILIZARE

nglobarea n reeaua unui polimer

Legare covalent

CHIMIC
Legare ncruciat

Imobilizare eficient Orientare corect a elementului biologic Accesibilitatea analitului la elementul biologic Reinerea activitii biologice Difuziune uoar a analitului ctre ele,entul biologic Stabilitate operaional i durata de via

In cazul imobilizrii chimice este necesara prezena unor grupri funcionale la nivelul elementului biologic sau funcionalizarea acestuia. In cazul imobilizrii proteinelor pot fi exploatate urmtoarele grupri funcionale ale aminoacizilor
Lizina(NH2) Cisteina (SH) Serina(OH) Acid Aspatic(COOH)

IMOBILIZAREA FIZIC + Nu este afectat structura elementului biologic + Limiteaz contaminarea cu prteine prezente n prob + Limiteaz biodegradarea elementului biologic - Difuzia analitului ctre elementul biologic poate fi ncetinit - Reinerea unor molecule nedorite (interferente) n spatele membranei sau n reteaua polimerului - Pierderea elementului biologic IMOBILIZAREA CHIMIC + Stabilitate mrit + Un bun control asupra orientrii elemntului biologic n cazul imobilizrii covalente + n cazul utilizrii unui electrod ca traductor, la imobilizare se poate utiliza un agent de legare conductor de electroni ducnd la o efiecien mai mare a semnalului electronic - Afectarea structurii elementului biologic i pierderea selectiviii/activitii catalitice n timpul reaciilor chimice de imobilizare (n special n cazul legrii ncruciate) - Rezistena mecanic a sistemului paote fi slab

IMOBILIZAREA BAZAT PE AFINITATE BILOGIC

Elemnet biologic Biotina Biotina Traductor Element biologic Antigen Anticorp Traductor Avidina (proteina tetrameric)

1. Sistemul

avidina-biotin

2. Sistemul antigen-anticorp

Imobilizarea celulelor bazate pe afinitatea biologic

Celule cu integrine de suprafa Matrice extra-celular (EMC)
Fibronection tri-peptida RGD (arg-Gly-Asp) in EMC

Repdite RGD

Integrine (factori de ataare)

Traductor

Timp de via
Absorbie nglobarea n polimer Legare ncruciat Imobilizare covalent Afinitate biologic 1 zi 1 sptmn 3-4 sptmni 4-14 luni sptmni-luni (variabil)

Funcionalizarea suprafeei traductorului

1. Monostraturi auto-asamblare (Self-assembled Monolayers - SAMa) Se formeaz prin absorbia pe suprafee de aur a unor derivai alcantiolici X(CH2)n Sunt caracterizate printr-o orientare foarte precis
Grup funcional: OH, NH2, COOH
Alcan Tiol dizolvat n etanol SH

Suprafa de aur imersat n soluie Monostrat auto-asamblat

2. Silanizarea oxizilor metalici

Grup funcional Alcan Si
C2 H5 O C2 H5 O C2 H5 O

+ H2O +

Hidroliza Condensare

Sticla (SiO2) sau alt oxid metalic

Ageni pentru prevenirea adsorbiei non - specifice

PEG (poli-etilenglicol)

Fosfocolina

- Component a membranelor biologice

Albumina seric - proteina seric neadeziv

Heparina - Zahar c previne coagularea sngelui

TRADUCTORI
1. Traductori electrochimici
a) Poteniometrici:
- Se msoar potenialul celulei electrochimice la curentul zero. Potenialul celulei este proporional cu concentraia ionilor. - n construcia biosenzorilor poteniometrici intr de obicei enzime ce determin schimbri semnificative ale pH-ului: penicilina, ureaza, estereza.

Electrod de lucru Proba

Electrod de referin

Punte de sare

Enzima imobilizat la suprafaa electrodului

b) Amperometrici
Se aplic un potenial ntre un electrod de lucru i un electrod de referin, msurndu-se n mod continuu curentul din celul; Cele mai utilizate enzime sunt oxidoreductazele: glucozoxidaza, colesterol oxidaza, aminoacid oxidaza, etc. c) Conductometrici Se msoar conductaa/rezistena unei soluii Se pot utiliza cnd n timpul conversiilor enzimatice sunt sunt generate sarcini electrice (amidaze, esterase, kinaze).

Exemplu: determinarea ureei (n urin) utiliznd ureaza:

ureaza

Urea + 2H2O + + +

2NH4 + HCO3

(Dez)avantaje ale biosenzorilor electrochimici

Uurin n operare Interfa direct cu sistemul electronic Posibilitate de miniaturizare Selectivitate limitat, fiind necesar utilizarea mediatorilor pentru mbuntirea acesteia Poate fi aplicat numai sistemelor la care particip specii electrochimic active

Traductori optici
Tehnici optice ce pot fi utilizate n domeniul biosenzorilor Absorbia n UV/Vizibil, Emisie de fluoriscen (fosforosiscen), Bio-luminiscen, Chemi-luminiscen, Spectroscopie de Reflexie Intern (IRS), Metode bazate pe dispersia luminii.

Dispozitive necesare: tuburi fotomultiplicatoare, spectrofotometre, fluorimetre, fibre optice, ghiduri de und

FLUORISCENA
Proprietatea unor molecule (fluorofori) de a absorbi lumin la o anumit lungime de und (de obicei n UV) urmat de emisia de lumin la o alt lungime de und (n vizibil). Aplicaii: chip-uri ADN, imunoanaliza

Fluoriscena de transfer a energie de rezonan (FRET)

FRET const intr-o interacie, dependent de distana, dintre doi fluorofori, n care energia de excitaie a unuia (donor) este transferat la celalalt (acceptor) fr emisie de fotoni. Eficiena FRET este dependent de distana intermolecular i sete util la distane comparabile cu dimensiunea macromoleculelor biologice.

(Dez)avantajele traductorilor optici Usurin n operare Pot rspunde simultan la analii diferii Precizie inalt Posibilitatea utilizrii fibrelor optice pentru un transport al fotonilor mai eficieni + Extrem de sensibili (n special n cazul celor bazai pe fluoriscen i luminescen) + + + + - Depind de disponibilitatea compusului cu proprieti optice - Domeniu dianmic de aproximativ 100 (n cazul n care se aplic legea Lambert-Beer) - Dificulti n miniaturizare - Timpul de rspuns poate fi mare - Interferena altor compui prezeni la matrici complexe - Interferena luminii exterioare n cazul traductorilor luminesceni.

Traductori termici
- formarea/ruperea legturilor chimice n reaciile enzimatice duc la modificri de entalpie, -Pot fi detectate modificri ale temperaturii soluiilor de aproximativ 1000 K, - pentru o detectare mai bun reaciile de interes pot fi cuplate cu alte sisteme enzimatice ce produc mai mult cldur (de exemplu, glucozoxidaza poate fi cuplat cu cataliza) +pot fi utilizate pentru majoritatea reaciilor - selectivitate sczuta - dificulti in miniaturizare

Traductori piezoelectrici
Frecvena (f) oscilaiilor cristalului depinde de masa cristalului (m) i de cea a oricrui material adsorbit pe suprafa sa (A). Frecvena oscilaiilor descrete cu masa adsorbit. Materiale pieyoelectrice: Cuar, materiale ceramice, polimeri organici
+extrem de sensibili (determinarea antigenului n domeniul picogramelor) + posibilitatea de determinare a antigenului att n faz gzoas, ct i lichid +portabilitate +timp scurt de rspuns +nu necesit marcare - adsorbia nespecific a proteinelor poate duce la rezultate false

Membrane conductoare (polipirol)

Biosenzori amperometrici bazai pe imobilizarea componentei biologice/n membrane obinute prin electropolimerizare direct la suprafaa electrodului de lucru

Membrane ne+conductoare (politriamin)

BIOSENZORI BAZAI PE ELECTROZI SERIGRAFIAI

RE

WE

CE

1 cm

Producie de serie
Pre de cost cszut Uor de locuit Necesit volume mici de prob Potrivii pentru determinri pe teren

Factorii de mediu biointeraciunea i performanele biosenzorilor

Prezena moleculelor de interferen (adic, inhibitori ai enzemei) Ageni de denaturare (solveni organici i detergeni) Suprafee hidofobe rezisten ionic, pH nefavorabil Concentraie analitic (Saturaie; adic, toate tipurile de anticorpi ) Aceti factori pot afecta n mod semnificativ selectivitaea, specificitatea i etanietatea. Prin urmare, soluii ale analitului de obicei trebuie s fie pregtite nainte de a analiza (pH neutru, fr detergeni, i aumite concentraii).

DOMENIILE DE APLICARE
medicin glucoza, alcool, ADN, RNA, proteine, hormoni, aspirina, paracetamol, penicilina

bio-procese industriale aminoacizi, drogdie de bere, acid lactic, etanol, etc. mediu nconjurtor pesticide, ngrminte, esterogen mimiks, CO, CO2
sisteme

de protectie/criminalistic antrax, variola, ageni nervoi, cocain

Test de sarcin

Antrax

Glucoza