Proteinele cromozomale specifice esutului testicular i rolul acestora n asigurarea structurii i functiei materialului genetic n spermatogeneza animalelor

LILIANA BURLIBAA, DANA UURELU Institutul de Genetic al Universitii din Bucureti Structura cromatinei rezult din interacia ADN cu proteinele cromozomale. Proteinele cromozomale sunt implicate n meninerea integritii structurale a cromozomului, protejarea ADN de aciunea dezoxiribonucleazelor i reglarea activitii genice. n timpul spermatogenezei, cromatina din celulele stem parcurge cteva tranziii dinamice care sunt adesea asociate cu schimbri importante n compoziia i structura sa, n cele mai multe cazuri, compoziia proteinelor cromozomale din stadiile finale ale spermatogenezei fiind total diferit de cea din stadiile iniiale. Aceste modificri compoziionale altereaz semnificativ structura cromatinei. Ca urmare, aceasta devine nalt compactat iar expresia genic este complet blocat n spermatozoizi.

1. Proteine cromozomale specifice tesutului testicular

Proteinele cromozomale din spermatozoizi prezint o imens variabilitate structural. n ultimii zece ani s-au realizat importante progrese n caracterizarea fizic i chimic a acestor proteine la o mare varietate de organisme. Rezultatele acestor studii arat c, n ciuda enormei variabiliti structurale, proteinele nucleare specifice spermatozoizilor pot fi grupate, n funcie de compoziia lor n trei categorii: - Tipul H (histone-type) const n proteine cu o compozitie n aminoacizi similar cu histonele din celulele somatice; - Tipul P (protamine-type) const n proteine cu mas molecular mic (4.000 - 10.000 daltoni), bogate n arginin (coninut de arginin mai mare de 60%). n cursul spermatogenezei aceste proteine nlocuiesc aproape total histonele din celulele stem; - Tipul PL (protamine-like) const n proteine cu o compoziie de aminoacizi intermediar ntre tipurile descrise anterior. Coninutul n arginin i lizin este cuprins ntre 35-50% i ocazional poate fi chiar mai mare. I.1 Histonele Histonele, din punct de vedere chimic, sunt proteine cu un puternic caracter bazic, deoarece 25% din aminoacizii constitueni sunt bazici, purttori de sarcini pozitive (arginin, lizin i histidin). Sunt complet lipsite de triptofan, fenilalanin i tirozin. Din cauza naturii bazice, ele pot fi extrase uor cu acid clorhidric diluat sau cu acid sulfuric. Histonele sunt alctuite dintr-o singur caten polipeptidic. Dup coninutul n arginin i lizin, histonele cromozomale sunt clasificate n cinci clase: H1 (bogate n lizin), H2A i H2B (moderat bogate n lizin), H3 i H4 relativ bogate
25

LILIANA BURLIBAA, DANA UURELU

n arginin); n cadrul fiecrei clase exist cteva subtipuri care difer prin 1-2 aminoacizi. Exist i histonele H5 i H6 prezente numai n nucleii eritrocitelor de psri (hematii circulante nucleate) unde nlocuiesc histona H1. Proprieti fizico-chimice ale histonelor Histona H1 este cea mai mare (GM=21.000 daltoni), conine circa 215 aminoacizi i se prezint sub form de monomer; lizina se gsete n cea mai mare proporie (27%). Prezint cea mai mare variabilitate de secven i este implicat n interaciunile cu componentele variabile ale cromatinei (non-histone, regiuni variabile ale altor histone). Fiind legat de ADN linker dintre doi nucleozomi, poate fi uor ndeprtat prin digestie enzimatic. Histona H2A este format din 129 de aminoacizi, are GM=14.000 daltoni i se prezint sub form de oligomeri. Conine 11% lizin, 9% arginin i leucin n cantitate mare. Histona H2B conine 125 de aminoacizi, are GM=13.775 daltoni i formeaz oligomeri. Conine 16% lizin, 6,5% arginin i un procent ridicat de serin i prolin. Histona H3 este format din 135 de aminoacizi, are GM=15.320 daltoni i conine 15% arginin, 12% lizin, fiind singura fracie n compoziia creia intr i cisteina. Histona H4 este format din 102 aminoacizi i are GM=11.280 daltoni. Este bogat n arginin (14%) i glicin (15%). H3 i H4 formeaz un tetramer (2 H3 - 2 H4), care mpreun cu oligomerii H2A i H2B construiesc cilindrul turtit, proteic al nucleozomului. H4, fiind cea mai mic histon, are descifrat complet secvena de aminoacizi: regiunea terminal NH2 cuprinde cei mai muli aminoacizi bazici, avnd i un caracter bazic foarte pronunat, pe cnd regiunea terminal COOH reprezint segmentul hidrofob i este numai uor bazic. Se consider c regiunea terminal NH2 este implicat n legarea la ADN, iar regiunea terminal COOH n legturi interhistonice sau cu alte componente ale cromatinei. Coninutul histonelor n aminoacizi bazici (arginin, lizin, histidin), purttori de sarcini pozitive, explic legarea lor la ADN. Aceasta se realizez prin formarea de puni ionice (electrostatice) ntre grupele fosfat ncrcate negativ ale ADN i grupele amino (NH2) ncrcate pozitiv ale catenelor laterale ale aminoacizilor bazici din catena polipeptidic a histonelor. Intensitatea legturii la ADN a diferitelor fracii de histone este diferit. Astfel, lizina se leag preferenial la perechile A-T, n timp ce arginina se leag preferenial la perechile G-C. Aceste legturi se realizeaz la nivelul adnciturii mari, n timp ce adncitura mic prezint situsuri de recunoatere pentru ARN-polimeraz. Componena bazic a histonelor protejeaz ADN de denaturarea termic. Acest rol l ndeplinesc cationii care reduc forele de repulsie ce apar ntre gruprile fosfat cu sarcini negative. Temperatura de denaturare termic a ADN este n funcie de concentraia cationic a moleculelor de histone, acestea fiind policationi. Histonele sufer anumite modificri chimice cum sunt: metilarea, acetilarea i fosforilarea diferiilor aminoacizi. Aceste modificri duc la schimbarea sarcinii moleculelor histonice i sunt corelate cu activitatea genelor, cu replicarea ADN i cu diferenierea celular. Modificrile histonelor, cu excepia metilrii, sunt asociate cu evenimente cromozomale distincte i sunt schimbri reversibile. Fosforilarea i acetilarea influeneaz interaciunea histonelor cu celelalte componente cromozomale. Modificarea steric a histonelor are loc datorit faptului c gruprile fosfat i acetil sunt voluminoase. Regiunile de prindere sunt regiuni foarte voluminoase, fiind de altfel, cele mai afectate de modificrile amintite. Deci, metilarea, fosforilarea i acetilarea afecteaz, n esen, interaciunea ADN histone i anume structura fibrei nucleozomale. Histonele sunt proteine de structur cu rol de stabilizator al fibrei de cromatin. ADN nativ este oarecum instabil deoarece apar fore de repulsie ntre gruprile fosfat ncrcate negativ, ceea ce duce la extensia moleculei i eventual, la separarea catenelor. ntre gruprile
26

Proteinele cromozomale specifice esutului testicular i rolul acestora n asigurarea structurii i functiei materialului genetic n spermatogeneza animalelor

fosfat ale catenelor de ADN i gruprile NH2 ale histonelor se formeaz legturi ionice, care dau stabilitate moleculei. n afara rolului structural, histonele ndeplinesc i funcia de represori generalizai n reglajul genetic. Asocierea histonelor cu ADN imprim starea condensat a cromatinei, deci mpiedic transcrierea ADN. Cromatina celulelor spermatice este supus unor rearanjamente structurale n timpul diferenierii spermatogoniei n spermatozoid matur. n timpul stadiului haploid din spermatogeneza mamiferelor, histonele sunt nlocuite treptat mai nti de proteine de tranziie i apoi de protamine. Fracia histonic din cromatina celulelor spermatice este compus din subtipuri specifice esutului testicular, asemntoare cu izoformele histonice care se gsesc n esuturile somatice. Pattern-urile subtipurilor pentru toate clasele histonice (cu excepia histonei H4) se modific n timpul spermatogenezei mamaliene ntr-o manier specific, depinznd de stadiul de dezvoltare al spermatocitelor. Aceasta implic existena mecanismelor de control care regleaz expresia genelor pentru subtipurile histonice n celulele specifice. Acest control poate fi exercitat la nivel transcripional (exemplificat prin studiul funcionalitii promotorului H1t). Reglarea poate avea loc de asemenea, i la nivel posttranslaional, prin poliadenilarea unei fracii de ARNm din celulele spermatice (Doehner, D. & Drabent, B., 1995). Pattern-urile proteinelor histonice au fost monitorizate n timpul spermatogenezei la un larg spectru de organisme eucariote inferioare i superioare (tabelul 1). Tabelul 1. Expresia genelor histonice n spermatogeneza mamiferelor. Prezena subtipurilor histonice n diferitele stadii de dezvoltare ale spermatocitelor, nainte de nlocuirea acestora de proteinele de tranziie i, n final, de protamine. Subtipul histonic H1a-e H10 H1t H2A H2A.X H2A.Z TH2A H2B TH2B H3 TH3 H3.3 H4 Stadiul celular n care este prezent; histona toate stadiile; sunt nlocuite n parte, de ctre H1t n spermatocitele aflate n pachiten spermatogonii (dup acest stadiu, concentraia acestora ncepe s descreasc) spermatocitele pachitenice toate stadiile, n parte nlocuite de TH2A Spermatogonii spermatogonii, se observ o uoar cretere n spermatocitele pachitenice Spermatocitele pachitenice, parial nlocuind H2A toate stadiile, n mare parte nlocuite de TH2B; exist un subtip specific n spermatide Spermatocitele pachitenice toate stadiile Spermatogonii; absent n stadiile trzii toate stadiile pn la spermatide; prezent n special n spermatogonii toate stadiile; n spermatocitele pachitenice gena pentru H4 este transcris mpreun cu gena pentru H1t
27

LILIANA BURLIBAA, DANA UURELU

Subtipurile histonice testiculare Familia de histone linker H1 cuprinde cteva variante izoforme. Cele mai detaliate analize ale complementului H1 au fost realizate pe cromatina uman i murin de la cteva tipuri de celule i esuturi. La om au fost descrise cinci tipuri genice pentru histona H1, n plus fa de genele ce codific H10, care este o histon ntlnit doar n tipurile celulare nalt specializate, i H1t care se exprim doar n celulele testiculare (este o gen nalt conservat). Prezena proteinei H1t este limitat la celulele liniei germinale mascule, ea nefiind o variant general meiotic. n spermatocitele pachitenice i n stadiile trzii, H1t se afl n cantitate foarte mare. Huh i colaboratorii a descris prezena unei perechi de gene cu exprimare testicular, constnd ntr-o gen H2A i o gen H2B. Aceste gene ar putea codifica pentru subtipurile TH2A i TH2B (proteine cu localizare testicular). n plus, au fost descrise dou subtipuri H2A cu replicare independent - H2A.Z i H2A.X. H2A.X este abundent n cromatina testicular, n timp ce H2A.Z este uniform rspndit n cele mai multe esuturi somatice. Un subtip testicular de histon H3 (TH3) a fost izolat din testiculul de obolan. Compoziia sa unic de aminoacizi (incluznd 3 reziduuri de cistein) indic diferene structurale, comparativ cu celelalte subtipuri H3 cunoscute, dar nc nu a fost identificat gena pentru TH3 n nici un genom mamalian. Subtipul H3.3 a fost gsit a fi exprimat n timpul spermatogenezei att n stadiul de spermatid ct i n stadiile timpurii ale spermatogenezei. Histona H4 este cea mai conservat dintre toate clasele de histone. Secvena sa de 102 aminoacizi a fost meninut la toate speciile de mamifere. n diferitele stadii ale spermatogenezei se modific pattern-ul histonic. Pattern-ul histonei n diferitele tipuri de celule somatice sau n celulele germinale nu este uniform, variind n compoziia subtipurilor H1. La numeroase specii de mamifere au fost descrise cinci subtipuri histonice H1 (H1a-e). n cazul subtipurilor histonei H1, s-a constatat c dei H1t este mai bogat n arginin (arginina este implicat n capacitatea de condensare a fibrei de cromatin) are o capacitate mai mic de condensare dect celelalte subtipuri H1. Mai degrab H1t poate avea un efect de activare n cromatina celulelor germinale n curs de difereniere, dect de represie a activitii nucleare (Doenecke, D. & Drabent, B., 1995). n timpul profazei meiotice au fost detectate schimbri majore i n compoziia clasei de histone H2A/H2B. Ambele subtipuri TH2A i TH2B sunt detectate mai nti n spermatocitele pachitenice de obolan i oarece. ntr-o banc de ADNc realizat pe baza ARN din spermatide, a fost observat o secven ADNc H2B similar cu o alt secven genic H2B de oarece, dar codificnd pentru 12 aminoacizi adiionali din care 7 hidrofobi. Analiza Northen blotting cu ARN din alte esuturi a demonstrat c acest transcript este specific esutului testicular. Similar, a fost detectat un ARNm H2A n spermatidele de oarece. Tranziia histonelor n protamine n cursul spermatogenezei umane nu const ntr-o nlocuire total a histonelor. Aproximativ 15% din ADN-ul din spermatozoizi pare a rmne asociat cu miezul histonic, n special cu H2A, H3.1, H3.3 i H4 care este nalt acetilat. n contrast cu acestea, nu a fost detectat histona H1 n cromatina spermatozoidului matur. Schimbarea gradat a histonelor linker i a celor din miezul nucleozomal pe parcursul dezvoltrii celulelor germinale mascule, modificarea morfologiei cromatinei i a activitii genice, atribuie un rol funcional important subtipurilor histonice.

28

Proteinele cromozomale specifice esutului testicular i rolul acestora n asigurarea structurii i functiei materialului genetic n spermatogeneza animalelor

Au fost observate modificri posttranslaionale ale histonelor din stadiul de spermatide. Cea mai impresionant modificare a histonelor n timpul spermatogenezei este hiperacetilarea acestora. Aceast modificare a structurii histonei H4 este corelat cu un spectru larg de procese celulare incluznd controlul transcripional i asamblarea cromatinei. Hiperacetilarea H4 are loc n spermatidele n curs de elongare. Acesta este stadiul n care are loc nlocuirea histonelor de ctre proteinele de tranziie. I. 2 PROTAMINELE n timpul maturrii spermatozoidului, histonele sunt nlocuite cu un grup de proteine nalt bazice, cu greutate molecular sczut (4.000-10.000 daltoni), bogate n arginin, denumite protamine. Deoarece primele studii pe aceste proteine specifice spermatozoidului sau fcut pe material izolat din specii diferite de peti au primit denumiri ce decurg din numele speciilor: Salmon - salmine, Salmo irideus - iridine. n contrast cu structura nalt conservat a histonelor pe parcursul evoluiei, proteinele bazice specifice spermatozoidului variaz enorm ntre specii. Protaminele de pete conin 3033 de aminoacizi, sunt foarte bogate n arginin (pn la 75% din aminoacizii lor), dar lipsite de lizin; cele de la Bufo sunt de asemenea, bogate n arginin. Protaminele de la mamifere sunt neobinuite deoarece conin i resturi de cistein. De exemplu, din sperma de taur s-a izolat o protamin bogat n arginin, de 6.200 daltoni, care conine 6 reziduuri de cistein. Acestea par s fie implicate n formarea punilor disulfhidrice pentru a produce o structur foarte compact n interiorul spermatozoidului. Protamina 1 de la oarece conine 50 aminoacizi din care 29 sunt reprezentai de arginin. Exist un singur tip de protamin n general, dar la om au fost identificate 2-3 tipuri codificate de gene diferite. Protaminele sunt sintetizate n citoplasma spermatidelor n curs de formare, dup care se deplaseaz n nucleu pentru a nlocui histonele. nlocuirea histonelor cu protamine nu se realizeaz direct, ci are loc o nlocuire gradat a acestora. Iniial, histonele bogate n lizin sunt nlocuite cu histone bogate n arginin (proteine de tranziie). Ulterior, histonele bogate n arginin sunt nlocuite cu protamine. n comparaie cu modelul nucleozomal de legare al histonelor, modelul de legare al protaminelor situate n anurile minore ale dublului helix de ADN, asigur o cptuire aproape complet a ADN, cu foarte puine zone libere. De aceea, fa de nucleii celulelor somatice, n nucleii spermatozoizilor se pierde structura nucleozomal i superhelicitatea negativ, ctigndu-se o alt organizare specific. I.3. PROTAMINE-LIKE Sunt proteine cu o compoziie de aminoacizi intermediar ntre tipurile descrise anterior. Coninutul n arginin i lizin este de 30-50% i ocazional, poate fi chiar mai mare (tabelul 2). n cele mai multe cazuri, aceste proteine pot fi structural nrudite cu histona H1. n stadiile finale ale spermatogenezei, proteinele PL (protemine-like) prezint un grad semnificativ de heterogenitate structural cu mase moleculare cuprinse ntre 5.000 i 30.000 daltoni. Astfel, acest tip de proteine sperm-specifice au fost clasificate n dou categorii PL-I (proteine cu masa moleculara mai mare de 15.000 Da) i PL-II sau PL (proteine cu masa molecular mai mic de 15.000 Da)
29

LILIANA BURLIBAA, DANA UURELU

Tabelul 2. Compoziia n aminoacizi (mol%) a protaminelor PL-I la diferite organisme (modificat dup Juan Ausio, 1995) (c.i = cantiti infime) Organism Metridium senile Spisula solidissima Chelysoma productum Mullus barbatus Histona H1 din timus de viel 26.8 1.8 2.5 5.6 5.6 9.2 7.2 24.3 5.4 1.5 4.5 0.9 0.9 Histona H5 din eritrocitele de pasre 23.6 1.9 12.4 1.7 3.2 11.9 4.7 5.3 16.3 4.2 0.4 3.2 4.7 1.2 0.6 -

Lys His Arg Asx Thr Ser Pro Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe Trp

11.0 0.5 25.4 2.8 4.3 11.2 2.5 8.6 11.6 7.6 2.3 3.6 1.4 1.8 -

24.8 23.1 0.6 4.3 21.7 2.4 3.0 14.2 2.3 0.4 0.5 1.7 0.3 0.3 0.3

17.3 1.8 20.8 5.0 2.1 6.8 1.9 18.7 6.7 2.9 0.5 3.4 5.8 1.6 1.2 -

24.2 22.1 5.1 4.5 9.2 6.8 5.4 11.9 4.9 c.i c.i 5.8 c.i c.i -

Proteinele PL-I au fost detectate n spermatozoizii maturi de la numeroase specii de molute. ns, prezena acestui tip de protamine nu este restrns la grupul molutelor. Proteinele PL-I au fost identificate la numeroase grupuri filogenetice inclusiv cordate i vertebrate. Domeniile non-globulare N i C terminale ale acestor molecule sunt extrem de variabile. Proteinele PL cu masa molecular mic (PL-II sau PL) au evoluat spre protamine bogate n arginin (figura 1). Acest tip de proteine este ntlnit la ramuri aparinnd deuterostomienilor i protostomienilor, aflate pe treptele mai nalte ale evoluiei. Prin procesul seleciei, arginina a fost preferat lizinei datorit potenialului su ridicat de a forma legturi de hidrogen. David Bloch (1969, a publicat primul catalog al proteinelor specifice spermatozoizilor) a anticipat importana filogenetic a acestui grup de proteine. El nota: " asemnrile dintre proteinele intermediare ale spermatozoizilor maturi la organisme aflate pe o treapt filogenetic inferioar i proteinele intermediare din spermatide la specii de Loligo i Salmo (care, ambele conin protamine n spermatozoizii maturi) sugereaz o relaie ntre ontogenie i filogenie." Dei relaia precis ntre proteinele intermediare din timpul dezvoltrii spermatozoizilor i proteinele protamine-like nu a fost nc bine stabilit, ipoteza lui Bloch se dovedete a fi un excelent model pentru clasificarea biochimic a spermatogenezei ntr-un context filogenetic.
30

Proteinele cromozomale specifice esutului testicular i rolul acestora n asigurarea structurii i functiei materialului genetic n spermatogeneza animalelor

A + ++

++

+++

++

++++ PL-I

+ ++

++

+++

++

++++ PL

PRECURSOR HISTONIC

HISTONA H1

PROTEINA PL-I

PROTEINE PL CU MASA MOLECULAR MIC (proteine spermatice de tranziie?) ? PROTAMINE

Figura 1. Un posibil model al evoluiei proteinelor nucleare sperm-specifice (B); unele din proteinele PL cu masa molecular mic ar fi putut apare ca urmare a procesrilor post-translaionale (clivare) a precursorilor PL-I (A).

2. Condensarea ADN n nucleii spermatozoizilor

Dup analiza variabilitii proteinelor sperm-specifice, urmtoarea ntrebare pertinent pe care am putea s ne-o punem este: aceasta variabilitate imens a proteinelor spermspecifice determin i variabilitatea structurii cromatinei pentru fiecare tip de protamin? S-a speculat existena a patru tipuri de organizare a cromatinei n timpul spermatogenezei (tipurile I-IV).

31

LILIANA BURLIBAA, DANA UURELU

IV III II

-----------------------------------------------------------------Figura 2. Tranzitiile proteinelor nucleare n cele patru tipuri de spermiogenez - tipul de proteina nuclear P; - tipul PL; - tipul H).

Dup cum se observ n figura 2, la nceputul spermatogenezei, n toate tipurile de organizare a cromatinei sunt prezente histonele ce confer cromatinei organizarea bine cunoscut, conform modelului nucleozomal. Ulterior, toate modificrile ce apar n compoziia proteinelor nucleare sperm-specifice din cele patru tipuri ipotetice de organizare a cromatinei, au un singur obiectiv: completa represie a activitii genice n spermatozoidul matur. Astfel, o posibil modalitate ar fi pierderea complet a organizrii cromatinei (inclusiv nucleozomi i alte proteine reglatoare ale cromatinei) tipul I de spermiogenez. O cale alternativ ar putea fi creterea raportului dintre histonele linker i histonele ce alctuiesc miezul nucleozomal, ce ar avea ca rezultat blocarea cromatinei ntr-o structur inert funcional. Acest model ar corespunde tipului II de spermiogenez. A treia posibilitate (Tipul III) ar putea fi reprezentat de nlocuirea proteinelor de tipul H (histone) cu proteine PL, sau n cazul tipul IV, n finalul spermatogenezei proteinele PL sunt nlocuite cu protamine (tipul P) nalt bazice. Modelul cel mai bine studiat este cel de la mamifere i va fi descris n cele ce urmeaz. nlocuirea histonelor cu protamine are loc n spermiogenez i este responsabil de mpachetarea ADN-ului spermatozoidului, ADN care este de 6 ori mai condensat dect n cromozomii metafazici. nlocuirea histonelor cu protamine are loc n dou etape: 1. Histonele bogate n lizin sunt nlocuite cu histone bogate n arginin 2. Histonele bogate n arginin sunt nlocuite cu protamine. Un alt aspect este acela c absena complet sau aproape complet a superspiralizrii ADN n nucleii spermatozoizilor corespunde cu inactivitatea cromatinei acestora. Nedesfurndu-se procesele de replicare i transcriere, nu este necesar superhelicitatea negativ conferit de histone. n comparaie cu modelul nucleosomal de legare al histonelor, modelul de legare al protaminelor situate n anurile minore ale dublului helix de ADN, asigur o cptuire aproape complet a ADN, cu foarte puine zone libere. n felul acesta, protaminele nu au efectul de poziionare pe care l au histonele. De aceea, fa de nucleii celulelor somatice, n nucleii spermatozoizilor se pierde structura nucleozomic i superhelicitatea negativ, ctigndu-se o alt organizare specific. Dup Ward (1993, 1994) citat de Crlan M. (1996), nivelele de organizare ADN n nucleii spermatozoizilor cuprind: dublul helix ADN, complexul ADN-protamine sub forma toroidal, echivalentul solenoidic i domeniile buclate.
32

Proteinele cromozomale specifice esutului testicular i rolul acestora n asigurarea structurii i functiei materialului genetic n spermatogeneza animalelor

Dublul helix ADN este aproape identic cu cel al ADN din celulele somatice, dar se remarc dou diferene: lungimea mai mare a secvenelor telomerice i extinderea hipermetilrii ADN. Complexul ADN-protamine este omolog cu fibra nucleozomal din nucleii celulelor somatice. Unitatea fundamental de mpachetare a ADN legat cu protamine nu este nucleozomul, ci un toroid cu diametrul de 90 nm coninnd aproximativ 60 Kb. Aceast structur care difer complet de orice structur cromatinic din nucleii celulelor somatice a fost descris de Hud i col. 1993.

Figura 3. Unitatea fundamental de mpachetare a ADN-ului cu protamine din nucleii spermatozoizilor (dup Crlan M, 1996). A

Figura 4. Comparaie ntre modelul de organizare nucleozomal din celulele somatice (A) i modelul toroidal de organizare a cromatinei n spermiogeneza (B) (H1 histona H1 linker, N nucleosom, PL-I proteine nucleare spermatice protamin-like tipul I (dup Juan Ausio, 1995).

Deoarece spermatidele i spermatozoizii nu i replic ADN dup cum nici nu i-l transcriu, nu este necesar ca ADN s fie suprarsucit. Presiunea de stivuire a proteinelor i
33

LILIANA BURLIBAA, DANA UURELU

forele Van der Waals condenseaz genomul spermatocitelor ntr-o stare de mpachetare care-l protejeaz n vederea transportului pentru fecundare. ADN se dispune n cercuri concentrice suprapuse ca un colac de srm sau torus. Pentru a explica modul n care protaminele faciliteaz o astfel de mpachetare s-a propus urmtorul model: prile centrale ale protaminelor bogate n Arg sunt localizate n adnciturile minore ale macromoleculei de ADN astfel nct, gruparea Arg neutralizeaz sarcinile electrice negative ale ADN i elimin repulsia electrostatic ntre segmentele vecine. Cozile protaminelor sunt localizate n adnciturile majore ale ADN adiacent, ceea ce permite legarea paralel a moleculelor de ADN.

Figura 5. n nucleii spermatozoizilor, dublul helix ADN este cptuit n lanurile minore cu protamine, complexul ADN-protamine constituind echivalentul fibrei nucleozomale din nucleii interfazici ai celulelor somatice (dup; Crlan M.,1996).

Echivalentul solenoidic nu a fost nc pe deplin clarificat. Actualul model admite c, deoarece ntr-o tur a solenoidului exist 13 supranfurri ale ADN, cte 2 pentru fiecare din cei 6 nucleozomi i una pentru solenoidul nsui, 11 din cele 12 ncolciri nucleozomale sunt transformate n ncolciri simple, rezultnd 2 cercuri n spiral pentru fiecare tur a solenoidului. Domeniile buclate reprezint urmtorul nivel de organizare ntlnit i la celulele somatice, dar n nucleii spermatozoizilor de la mamifere (om, hamster) buclele au o dimensiune mai redus. Domeniile buclate reprezint aproape jumtate (47 Kb) din dimensiunile buclelor din celulele somatice ale hamsterului (76 Kb). S-a constatat c domeniile buclate de hamster i om, dar i de la psri, sunt ataate de matricea nuclear prin secvene specifice. Matricea nuclear este un element structural propriu nucleului, fiind alctuit din mai puin de 10% din totalul proteinelor nucleare i pstreaz dimensiunea i forma original a nucleului cnd acesta este izolat. n nucleii spermatozoizilor nu exist structuri echivalente cromozomilor mitotici deoarece spermatozoizii nu sufer diviziuni. Totui ADN din spermatozoizi poate fi prematur condensat n cromozomi monocromatidici cu prezena aceluiai model de bandare G ca i la cromozomii mitotici din celulele somatice. n ceea ce privete teoria lui Rabl referitoare la localizarea n poziii fixe, specifice a diverilor cromozomi n interiorul nucleilor interfazici somatici, n nucleii spermatozoizilor cartarea secvenelor telomerice (TTAGGG)n a artat c poziia telomerelor variaz de la nucleu la nucleu. Acest lucru sugereaz c diferiii cromozomi nu ocup poziii precise n timpul spermiogenezei i c exist o anumit plasticitate a aranjrii spaiale a cromozomilor n interiorul nucleilor spermatozoizilor. Pe de alt parte s-a artat c secvenele repetate ale telomerelor sunt asociate strns cu matricea nuclear.
34

Proteinele cromozomale specifice esutului testicular i rolul acestora n asigurarea structurii i functiei materialului genetic n spermatogeneza animalelor

Dup fuziunea gameilor, nucleul spermatozoidului ajuns n citoplasma ovocitei se condenseaz transformndu-se n pronucleu mascul. n continuare, acest pronucleu rmne separat de pronucleul femel, propriu ovocitei, i sufer modificri structurale i biochimice, reactivndu-se genetic. Spermatozoizii maturai n epididim sunt capabili s se deplaseze, dar nu au capacitatea de a fertiliza ovulul. Aceast proprietate este dobndit n tractul reproductor femel. Totalitatea modificrilor fiziologice suferite de spermatozoid la trecerea prin tractul reproductor femel se numeste capacitare. n timpul capacitrii nucleii pierd ionii de zinc astfel nct, gruprile -SH rmn libere, sunt oxidate i dau natere punilor disulfhidrice. De asemenea, au loc modificri ale membranei plasmatice a spermatozoidului. Dup fuziunea celor dou membrane, spermatozoidul ptrunde n citoplasma oului. Regiunea posterioar a capului i coada spermatozoidului sunt nglobate pasiv datorit fuziunii membranelor iar regiunea anterioar a capului spermatozoidului este nglobat printrun proces fagocitic. Nucleul ptrunde n citoplasma oului, are loc dezorganizarea anvelopei nucleare, care, spre deosebire de celulele somatice nu prezint pori dect n regiunea posterioar. Decondensarea nucleului este determinat de ruperea legturilor disulfhidrice n protamine i nlocuirea acestora cu histone. Reducerea este realizat de ctre glutation care este foarte abundent n citoplasma oului. nlocuirea protaminelor cu histone are loc n 5 minute de la intrarea spermatozoidului n ou i se bazeaz pe competiia dintre nucleoplasmin i ADN pentru protamine. ADN-PROTAMINE (S-S) ADN-PROTAMINE (-SH) ADN-PROTAMINE (-SH) ADN + NUCLEOPLASMIN + GLUTATION

NUCLEOPLASMIN-PROTAMINE (-SH) HISTONE

ADN-HISTONE = NUCLEOSOMI DECONDENSARE Fuziunea nucleilor la mamifere dureaz aproximativ 12 ore. Cnd nucleul spermatozoidului se decondenseaz, nucleul ovulului sufer a doua diviziune meiotic. Dup aceste procese, pronucleii migreaz unul spre cellalt, timp n care i replic ADN-ul. Reconstituirea nucleozomilor are loc deci, naintea fazei S care precede prima diviziune mitotic a nucleului. In concluzie, modificrile n compoziia biochimic a cromatinei din timpul spermiogenezei au ca obiectiv principal rearanjamente de ordin arhitectural ce se soldeaz cu
35

LILIANA BURLIBAA, DANA UURELU

represia total a activitii genice n spermatozoizii maturi, acetia putnd fi considerai ca reprezentnd doar crui ai informaiei genetice n descenden.

Bibliografie:
1. Ausio J. Histone H1 the evolution of the Nuclear Sperm Specific Proteins; Advences in Spermatozooal Phylogeny and Taxonomy 166: 447-462, Paris 1995. 2. Ausio J. & Suau P.,- Structural heterogenity of reconstitued complexes of DNA with typical and intermediate protamine. Biophysical Chemistry, 18, 257-267, 1983. 3. Bloch D., - Histones of sperm. In R.C.King, Handbook of Genetics. New York, Plenum Press : 139-167, 1976. 4. Casas M.T., Ausio J. & Subirana J.A. Chromatin fibres with different protamine and histone composition. Experimental Cell Research, 204, 192-197, 1993. 5. Crlan M.- Elemente de genetic animal normal; Edit. Polirom, Iai, 1996. 6. Chiva M., Kasinski H., Mann M. & Subirana J.A.- On the diversity of sperm basic proteins in the vertebrates. J. of Experimental Zoology, 245:304-317, 1988. 7. Doenecke D., Drabent B.- Histone Gene Expression During Mammalian spermatogenesis: Structural and Functional Aspects; Advences in Spermatozooal Phylogeny and Taxonomy, 166: 525-535, Paris, 1995. 8. Garcia-Ramirez M., & Subirana J.A. Condensation of DNA by proteins does not depend on protein composition. Biopolymers, 34, 285-292, 1994. 9. Knoch R., Lambert C. Ultrastructure of Sperm, Spermiogenesis and Sperm-Egg Interaction in Selected Intervertebrates and Lower Vertebrates which Use External Fertilization; J. of Electron Microscopy Technique, 16: 115-154, 1990. 10. Kwoun A., Lee Y.H.-Comparative Spermatology of Annurans with Special References to Phylogeny; Advences in Spermatozooal Phylogeny and Taxonomy, 166: 321-333, Paris, 1995. 11. Macgregor H.C. An Introduction to Animal Cytogenetics; Chapman & Hall, 1993. 12. Sommerville J., Baird J., Turner B.M. Histone H4 acetilation and transcription in amphibian chromatin ; Journal of Cell Biology, 120(2):277-290, 1993.

36