Curs 3.

Virusologie generala
Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Medicina Dentara Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Virusologie
Definiie: Virusologia (inframicrobiologia) tiina care studiaz virusurile (inframicrobii) i afeciunile provocate de acetia.
Virion = virus = corpuscul elementar = corpuscul viral unitatea viral, morfofuncional, complet, intact, infecioas, cu diametrul cuprins ntre 18-400 nm, capabil s infecteze bacterii, plante, animale, omul Se gsesc extracelular: nainte de a infecta celula gazd dup ce s-au asamblat i au fost eliberai din celula n care s-au multiplicat

VIRUS VEGETATIV particula viral aflat n celul, deficitar n unele aspecte ale replicrii,lipsit de capsid. PROVIRUS genom viral integrat n cromozomul celulei gazd, multiplicndu-se sincron cu acesta

Caracteristici generale ale virusurilor pe scurt

Marimea 25 nm (picornavirus) pana la 250-350 nm (smallpox virus). Comparativ, puterea de rezolutie a microrcopului fotonic este de: 300 nm, iar bacteriile au dimensiuni de ordinul a 5005000 nm. Genomul este format din ADN sau ARN putand sa fie dublucatenar sau monocatenar. Structura Virusurile sunt complexe de proteine codificate dee genele virale si acizi nucleici cateva au si elemente codificate de celulel gazda ca membrane si tARN Reproducerea are loc numai in celule vii. Virusurile pastreaza informatia necesara in acizii nucleici informatiile privind acizii nucleici si a sintezei proteice inclusiv a unor enzime.

Structura generala a virusului

Structura generala
Tipuri de virusuri dupa structura -Virusuri cu simetrie rotationala (cubica sunt icosaedre adica poliedre cu 20 de fete in forma de triunghiuri echilaterale). Cu un numar definit de capsomere. Simetrie-elicoidala elicoidala este prezenta atunci cnd o ax a capsidei este mai lunga dect celelalte.Acidul nucleic si proteinele capsidei sunt strns legate, n care proteina este strns infasurata n jurul genomului. Acest complex ARN-proteine este cunoscut sub numele de nucleocapsida. Simetrie complexa. Modele structurale complexe se gsesc la bacteriofagi i virusul variolei. Bacteriofagi T, de exemplu, au un cap icosahedric care conine ADN-ul i o coad tubulara prin care ADNul este injectat n celula gazd.

Materialul genetic viral

Acidul nucleic al tuturor virusurilor ADN, cu excepia parvovirusurilor, este dublucatenar (hepadnavirusurile au ADN parial dublucatenar cnd nu sunt in timpul replicrii). Acidul nucleic al tuturor virusurilor ARN, cu excepia reovirusurilor, este monocatenar. n cazul virusurilor ARN, genomul conine acid nucleic care poate fi cu polaritate pozitiva (+), caz n care poate aciona direct ca ARNm (mesager) n interiorul celulei infectate, sau poate fi cu polaritate (-), caz n care trebuie transcris de o enzima asociat virusului, ARN-transcriptaza, ntr-un ARN cu polaritate (+) = imaginea in oglinda. Conine ntreaga informaie genetic necesar replicrii Asigur infectivitatea viral Este capabil de autoreplicare n absena celorlali constitueni virali Excepie ARN viral izolat, m.c., sens negativ (virusuri cu genom divizat orthomyxovirus

Mrimea genomului viral se coreleaz cu mrimea capsidei sau anvelopei. Astfelvirusurile mari au un genom de dimensiuni mari care conine cteva sute de gene i codific un numr relativ mare de proteine (poxvirusurile, herpesvirusurile, etc) virusurile mici au un genom de dimensiuni reduse care conine doar 3 sau 4 gene i codific un numr mic de proteine

Capsida
Capsida este un invelis al virusului format din proteine structurale codificate de acesta care acoper acidul nucleic i este mai mult sau mai puin strns asociat cu aceasta.Combinaia a acestor dou componente este numita de cele mai multe ori nucleocapsida, mai ales dac acestea sunt strns asociate ca i n myxoviruses. Capsida este alctuit din subuniti, capsomere, al cror numr variaz, dar este specific i constant pentru fiecare dintre speciile virale. Acestea sunt structuri sferice sau cilindrice compuse din mai multe polipeptide. Capsida protejeaz acidul nucleic de degradare. n toate, cu excepia virusurilor ncapsulate, este responsabila pentru fixarea virusilor de celula gazda, i determin antigenitatea specifica virala.

Aspect of capsomere architecture of helical virus

Aici este prezentata structura elicoidala rigida a virusului mozaicului tutunului. 17400-Da subuniti distincte de proteine (protomere), constituie un helix, cu o structura repetata de 6,9 nm (49 subunitati pe trei ture). Fiecare rndul su, conine o serie de subuniti (16-1/3), care produc o grosime de 2,3 nm.

Invelisul sau anvelopa

Invelisul, ce inconjoara capsida la cateva familli de virusuri, este totdeauna dependenta de membranele celulare ale gazdei (nucleara, plasmatica, si uneori a reticuluilui endoplasmatic). Virusurile cu invelis nu se adsorb la celula cu capsida cu cu anvelopa. Indepartarea acesteia cu solventi organici si detergenti (sensibilitate la eter). Pe suprafaa acestei membrane se gsesc formaiuni specifice virale, codificate de virus: 1. spiculi (peplomere) de natur glicoproteic. Au funcia de adsorbie i penetrare n celula gazd. Exemple: *hemaglutinina (HA) = rol n ataarea virusurilor la celula gazd ; confer virusurilor proprietatea de a liza hematiile diverselor specii animale *neuraminidaza (N) = faciliteaz parunderea virusurilor n celul 2. factori de fuziune. Se gasesc sub forma inactiv (FO) iar sub aciunea proteazelor celulei gazd se scindeaz genernd forme active (F1,F2). Au funcia de iniiere a infeciei. 3. proteina M (matrix) cptuete faa intern a anvelopei (frecvent la virusurile ARN cu polaritate negativ).

Alte componente
Enzime diferite. Viruii necesit o serie de enzime diferite pentru funcionarea genomului i realizarea infeciei. n mai multe specii de virus enzimele sunt o component a particulei virale, neuraminidaza necesara pentru invazie si eliberarea de myxovirusuri. polimerazele acizilor nucleici cum ar fi polimerazele ARNdependente de ARN antisens n virusi, ADN-polimeraze n virusul variolei si ARN-polimerazei dependente de ADN ("revers transcriptaza"), in hepatita B, virusuri i retrovirusurilor Hemaglutinin. Unii virui (myxovirusii unii paramixovirusuri) sunt capabile de aglutinare a eritrocitelor umane si a diferitelor animale. Acesti virui poart o proteina de suprafata numita hemaglutinina, in envelopa lor care le permite s fac acest lucru. Fenomenul de hemaglutinare poate fi utilizat la studiile cantitative pentru testarea prezentei virusurilor sau prin testul de inhibare a hemglutininei pentru identificarea virusului si a anticorpilor. n termeni biologici, hemaglutinina joac un rol decisiv n adsorbie i in penetrarea virusului n celula gazd.

Taxonomia virusurilor
Comitetul Internaional pentru Taxonomie de virusi (ICTV) recunoatecirca 1.550 specii de virus (20), dar aproximativ 30.000 de tulpini de virus si izolates sunt urmrite de virusologi n diferite domenii ale biologiei i a dezvoltat o baz de date de virusi inca din 1991. Unii oameni de stiinta cred ca trebuie infiintat un nou regn nou, denumit Vira, asta nseamn c lumea vie va avea 7 reguri (Archaea, Eubacteria, Protista, Animalia, Mycota, Plantae i Vira). Aceasta este o idee bun, s se gseasc o poziie taxonomic clara pentru virusuri, care sunt att de diferite de toate celelalte organisme vii din lume.

Criterii de clasificare a virusurilor

Van Regenmortel enumer urmtoarele caractere pentru discriminri ntre specii de virus: Corelarea cu secventa genomului spectrul de gazde naturale tropismul pentru celule i esuturi patogenitate i citopatologie modul de transmitere proprietile fizico-chimice ale virionilor proprieti antigenice ale proteinelor virale

Taxonomia virusurilor
Viruii sunt clasificati deci si in functie de natura genomului lor virusuri cu ARN monocatenar de polaritate pozitiva si negativa virusuri ARN dublu-catenar virusuri ADN monocatenar i dublu-catenar; virui ce utilizeaza revers transcriptaza pentru replicare (ARN: ADN-ul i Retroviridae: Hepadnaviridae).

Denumirea cuprinde deci dup cum urmeaz: (---- viridae familie virus), subfamilia virinae (----) (---- de tip virus). Denumirea virala respecta normele internationale (n limba englez i n caractere cursive, de exemplu: Un enterovirus uman sau virusul polio, iar in paranteze drepte abrevierea oficiala de exemplu, [HEV-A] sau [PV].

Virus forms and taxonomy

Forme i dimensiuni ale virusurilor din familii care includ virusuri ale diferitelor animale, zoonotici, precum i ageni patogeni umani. Dimensiunea virionilor este respectata la scara dar structura lor este reprezentata schematic unele, fiind prezentate in sectiune. Aici nu sunt figurati bacteriofagii

Taxonomia virusurilor
Iata o clasificare a virursurilor conform cu continutul lor in ADN, ARN forma si alte caracteristici ce sunt prezentate sintetic in schema

Caracteristici virusuri
Caracteristici de baz structurale, cum ar fi tipul genomului, forma virus i site-ul de replicare, n general, mprtesc aceleai caracteristici, printre speciile de virus n cadrul aceleiai familii. n prezent, exist 20 de familii de virusuri care infecteaz oamenii. Exist dou virusuri suplimentare (Hepatita D i hepatita de tip E), care nu au fost nc atribuite unei familii, dar sunt n mod clar distincte de alte familii care infecteaza oamenii. Exist ase familii de virusuri ADN: trei sunt non anvelopate (adenoviruses, parvovirusul i poliomavirus) i trei sunt anvelopate (Hepadnavirus, Herpesvirus i Poxvirus). Toate familiile care nu au invelis au nucleocapsida icosahedrica Exist apte unice familii de virusuri ARN cu polaritate pozitiva : trei non anvelopate (Astrovirus, calicivirusul i Picornavirus) i patru anvelopate (Coronovirus, Flavivirus, Retrovirus i Togavirus). Toate familiile care nu au invelis au nucleocapsida icosahedrica.

Taxonomia virusurilor
Exist ase familii de virusuri ARN cu polaritate negativa: Arenavidae, Bunyaviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Paramixoviridae i Rhabdoviridae. Toate cele anvelopate au cu nucleocapsida elicoidala. Exist o familie cu un ARN dublu catenar -Reoviridae. Printre familiile ce infecteaza omul exist o serie de caracteristici care ar putea ajuta medicii i microbiologii clinici / virusologi. Ca o regul virusurile cu ADN, n cadrul replicarii are loc in nucleul celular in timp ce virusurile cu ARN se replica n citoplasma. Excepiile sunt cunoscute de la aceast regul: poxvirusurile (virusuri ADN) se replica n citoplasma i orthomyxovirule i virusul hepatitei D (virusuri ARN) se replica interiorul nucleului. Patru familii au genomul segmentat : Bunyaviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae i Reoviridae . Toate sunt virusuri ARN. Trei familii sunt transmise prin artropode: Bunyaviridae, Flaviviridae i Togaviridae. Toate sunt virusuri ARN.

Diferite tipuri de virusuri

i. virusuri helicale neanvelopate : au capsomere asezate helicoidal in jurul acizilor nucelici Exemplu: Tobacco Mosaic Virus Iii. Virusuri cu simetrie helicoidala dar cu anvelopa Exemple: Paramyxovirus

Diferite tipuri de virusi

ii. Virusi polyhedrale neanvelopate ( sau icosaedrice): capsidele formeaza forme geometrice cu laturi plate (i.e., faces) si colturi. Example: Reovirus, Adenovirus (in image), si Picornavirus Iv. Virusi anvelopati poliedrici : se observa anvelopa care inconjura capsida de morfologie poliedrica exemple Herpesvirus (in image) si Togavirus

 Virusuri cu morfologie complexa reprezinta o combinatie de structuri . Exemplu: bacteriofagii.

Ciclul vital al virusurilor

Replicarea virusurilor parcurge urmatoarele secvene: 1. recunoasterea celulei gazd 2. adsorbia (ataarea ) virusului de celula gazd 3. penetrarea (ptrunderea) virusului n celula gazd 4. decapsidarea virusului 5. sinteza macromolecular a) biosinteza ARNm precoce i a proteinelor precoce = proteine-enzime b) replicarea genomului viral c) biosinteza ARNm tardiv i a proteinelor tardive = proteine structurale 6. eliberarea virionilor progeni din celula gazd

Ciclul vital al virusurilor

Influenta factorilor de mediu asupra virusurilor

Factori fizici Temperatura: actiunea acesteia depinde de tipul de virus, prezena substanelor protectoare 18-25C -sensibile: v.rujeolos, v.gripal etc., moderat sensibile: v.Ebola, v.Marburg, v.EpsteinBarr etc.rezistente: v.coxsackie, v.variolic etc -56-100C in 30 minute inactivarea majoritii virusurilor Temperatura si umiditatea: -fierberea (100C) cteva minute VHA, v.rabic 30 minute VHB -autoclavarea:121C, 1 atm, 30 minute toate virusurile Temperatura scazuta conserv virusurile -4C (refrigerare) cteva sptmni enterovirusuri doi ani v.rabic n fragmente de nevrax -20C (congelare) insuficient pt pstrarea v.gripale, v.respirator siciial 70C (congelare) / pstrare n azot lichid la -190C prezervarea infectivitii pt ani de zile Radiatii ionizante -aciune direct: pe acizi nucleici i proteine virale si indirect: ionizarea mediului nconjurtor producere de compui toxici -radiaii electromagnetice (X, gamma),radiaii corpusculare ( i ),inactiveaz virusurile Ultrasunete vibraii peste 20 kHz/sec folosite pt:eliberarea virusurilor din celule obinerea unor substructuri virale omogenizarea suspensiilor virale etc.

Influenta factorilor de mediu asupra virusurior

Factori chimici pH sub 5 and peste 9 deterioreaz infectivitatea, stabile la pH extrem acid 3 enterovirusuri, alcalin 9 v.gripal B ageni chimici -oxidani 1%, oxidri n proteinele virale peroxid de hidrogen (H2O2) 3-6%, inactivare virus, agent antiseptizant Ozon dezinfecia apei, f.scump, puin utilizat, permanganat de potasiu 1% -halogeni/compui halogenai -Clorul tratarea apei potabile hipoclorit de calciu / hipoclorit de sodiu 10%, deterioreaz acizii nucleici virali, dezinfectani antivirali universali Cloramina 2-5%, 20%detergeni -detergenti Sintetici afecteaz virusuri cu peplos (dezoxicolat de Na, dodecilsulfat de Na, Tween 80 Cationici aciune virulicid + aciune spumant (sruri de amoniu cuaternar 20%, clorura de benzolcarmin pt. tegumente mucturi de animale 1% inactivare v.rabic) Factori biologici
Lizozim efect virulicid v.gripal n secreiile nazale, lacrimale, salivare suc gastric aciune virulicid prin pH-ul acid enzime proteolitice: tripsin, pepsin Bil inactiveaz virusurile cu pelos

Metode de diagnostic in laborator

Tipuri de diagnostic
1. Diagnosticul indirect: serologie virala Pentru diagnosticul unei infectii curente este important s se analizeze dou prelevate consecutive cel putin la un inteval de 10-15 zile pentru a observa o schimbare semnificativ a concentratiei anticorpilor. - Prezenta IgM cel mai adesea este un semn de infecie recenta; IgG -persist pe termen lung. Atunci cnd o persoan este gasita serologic pozitiva pentru prima dat pentru HIV i VHC, este obligatorie a face verificari printr-o a doua serie de analize (serologie i Western Blot). prelevatele: in principal se preleveaza ser care este apoi trimis la laborator. Alte fluide biologice: lichid cefalorahidian (LCR), lichid amniotic, lichidul pleural, lavaj bronhoalveolar, lichid alveolar (LBA). Probele de snge se preleveaza in n tub uscat i tub cu geloza pentru serologie: sngele este centrifugat i alicote din acest centrifugat este utilizat pentru realizarea testelor serologice prescrise.

1.2. Tehnici utilizate :

Metoda ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) cel mai des folosita Alte reactii serologice mai traditionale , ca reactia de fixare a complementului Teste rapide (dar cu sensibilitate variabila)
Teste de confirmare HIV (western blot) si HVC (immunoblot) : diferite proteine ale virusului sunt prezente separat pe membrana ce servesc ca suport de reactie. Aceste teste permit precizarea contra caror proteine virale sunt produsi anticorpii

Metode de detectie
1.3. Principiul Reactiei ELISA

Se formeaza o reactie antigen anticorp serul se presupune a contine anticorpii cautati ce reactioneaza la reactivii antigeni comerciali adsorbiti pe un suport de plastic (placi cu 96 de godeuri)
Detectarea complexului anticorp antigen prin fixarea unui anticorp anti imunoglobulina umana marcata obtinuta comercial - de ctre o enzim (Immunoassay enzime) sau molecula marcata fluorescent (imunofluorescenta)

Metode de laborator
Sistem ELISA cu distributie automata si citirea placilor si o placa Elisa 96 de godeuri

Teste serologice rapide

Test serologic HIV-1 si 2 rapid : acest tip de test este util in cazul unui accident de expunere la sangele contaminat daca serul pacientului este pozitiv tratamentul anti retro viral se incepe imediat

Western blot
Indicatie: punerea in evidenta a unui contact mai recent la o persoana infectata cu virus mai recent sau chiar mai putin recent . Avantaje: posibilitatea automatizarii Obtinerea de rezultate in maxim 4 ore sau in ziua urmatoare sensibilitate ridicat, specificitate excelenta (ELISA) cel mai sensibil la unii pacieni: copii i immunodeprimati . Interpretarea delicata uneori. Exemplu: pentru toate Herpesviridae (HHV, CMV, EBV S), IgM pot fi prezente sau nu nu la reactivare.

Benzile de western blot la sfarsitul reactiei : o banda colorata apare daca srul testat contine anticorpii ce recunosc antigenul adsorbit in locul respectiv.

2. Diagnostic direct
2.1. Probe din prelevate Calitatea eantionului determin rezultatul. Exist trei situaii Probele nu au nevoie de mediul de transport pentru a aduce proba la laborator n-un tub steril uscat fecale, urin, LCR lichide de eantionare diferite n-un tub care conine EDTA probe de sange pentru separarea celulelor mononucleare din sngele respectiv (pentru determinarea CMV, EBV, HIV). Probele prelevate cu un tampon steril scufundate n mediul de transport de pilda exudat din gat, vezicule, conjunctive iar livrarea trebuie facuta in decurs de 4 ore la laborator (pentru a pstra antigenitatea, infeciozitatea si calitatea de acizi nucleici) pn la 4C prin incadrarea eprubetei in punga de gheata (pentru a preveni dezvoltarea bacteriilor) Probe de snge total la temperatura camerei - pentru examene de Biologie molecular: se adauga EDTA la tub + + + (fr heparin, care este un inhibitor al PCR) Dispozitiv Smear (tamponul este dispus pe lama de sticl de ctre laborant): si lasat sa se usuce la temperatura camerei Exemple de probe: lichid cefalorahidian, lavaj bronhoalveolar, scaun, un tampon steril de transport i de mediu lichid

2.2. Metode rapide de diagnostic direct

Aceste metode permit obtinerea unui rezultat in numai cateva ore. Tehnici: Imunoaglutinarea specifica a virusurilor pe o lamela de sticla de un (cu un anticorp contra antigen=proteine virale) dintr-o proba de tesut sau de celule sanguine mononucleate isolate in laborator . Alte metode : aglutinare pe particule latex sensibile Metod: ELISA pentru tipul de antigeni cu detectie automatizata utilizand kituri de enzim de detection si imunodozarea antigenica rapida. Indicaii: Permite identificarea rapida specifica si ajuta la inceperea tratametnului cat mai repede : se foloseste in detectia (HHV), a infeciilor respiratorii (gripa, virusul sinciial respirator, parainfluenza virus, adenovirus) a diareei infantile (rotavirus, Adenovirus) si cercetarea cazurilor subclinice in cazul CMV la pacienii immunodeprimati .

Test de aglutinare pentru Rotavirus in proba de scaun

Probele de scaun , suspendate in solutie tampon sunt puse in prezenta unor particule de latex sensibile la antigenul viral . Aici rezultatul este negativ. In caz contrar, masurile de igiena impuse permit limitarea extensiei epidemiei de gastroenterita printre bebelusii din spital

Metode imunologice
Imunofluorescenta specifica a HHV pe un frotiu vaginal : celulele infectate prezinta o fluorescenta galben verzuie drept care se va face o nastere prin cezariana pentru a evita infectarea noului nascut.

Metode imunologice
Antigenemia pp65 a CMV positiva : leucocitele marcate prin anticorpi fluorescenti (fluorescenta galbenverzui) contin o fosfoproteina de 65kD a CMV. Pacientul cu grefa renala va beneficia de un tratsment contra CMV, chiar fara semne clinice (tratament preventiv).

Avantajele metodelor immunologice: se obtine rapid un rezultat : 20 minute la 4 ore Limite : lipsa de sensibilitate . Un rezultat negativ nu exclude diagnosticul Imunofluorescenta : citirea la microscop depinde de experienta observatorului

3.3. Metode de diagnostic direct pe cultura

Virusurile sunt parazite obligatorii in celule ele sunt cultivate pe celule eucariote intretinute in laborator sub forma de linii celulare continue sau semicontinue Diferitele etape de diagnostic prin cultura virala sunt: 1.nsmnarea unei linii de celule cu proba patologica. 2. Examinarea direct zilnic: detectarea efectului citopatic (CPE), la microscopul optic inversat. 3. Dac exista ECP: se coloreaza celulele se face frotiu pentru detectarea incluziuni virale i alterarile citoplasmatice i nucleare la microscopul optic. 4. marcarea imunologica specifica a virusului si citirea pe lame microscopice a rezultatului cu microscopie optica sau fluorescenta

Culturi de celule
Prin comparatie, efectul citopatic caracteristic al unei culturi celulare infestata cu enterovirus se observa incluziunile citoplasmatice si nucleul dens impins la periferia celulei

indicatii: Izolarea unui virus intr-o proba biologica Pentru a dovedi infeciozitatea virusului. Caracterizarea fenotipul unei tulpini (rezistena la anti-virale, de exemplu). Beneficii: Buna sensibilitate. Cultura rmne de referin n raport cu care toate metodele noi sunt comparate. Este esenial s se asigure susele initiale, folosite de exemplu n dezvoltarea de vaccinuri (de exemplu, vaccinul antigripal se fabrica in fiecare an). Costul acestei metode este rezonabil Limitri: timp de a obine rezultatul obinuit: 48 de ore la 10 zile. Subiectivitatea citirilor : depinde de experiena de observator . Cultura este practicat n putine laboratoare in ora. Unele virusuri nu sunt cultivate in afara de laboratoare de cercetare foarte specializate.

Cultivarea pe oua embrionate de gaina

Virusurile se pot izola si pe oua embrionate de gaina desi acum se renunta la aceasta emtoda in favoarea cultivarii pe culturi de celule

2.4.Metode de diagnostic molecular

Pentru simplitate, trei metode principale domina de analizele de rutin: hibridizarea molecular i variantele sale (hibridizare cu amplificarea semnalului i bDNA, hibridizare pentru detectia mutaiilor n genomul viral), amplificarea unei genei, sau PCR, i secvenierea nucleotidelor. Aplicaiile cantitative devin de asemenea curente

Metode de diagnostic molecular

Hibridizare: detectarea direct a ADN sau ARN pe diferite suporturi (tuburi, plci, membrane) Principiul de hibridizare molecular: 1 - Formarea unui hibrid de acid nucleic viral (ADN sau ARN) / cu sonda specifica pentru genomului viral cutat, pe diverse suporturi : membrana, microplaca, tub 2 Detectare immunoenzimatica a moleculelor hibride prin anticorpii de anti-acid nucleic dublu catenar, sau marcajul sondei i apoi detectarea colorimetrica, fluorescenta sau chimioluminiscenta

3.4.1. Hibridizare cu amplificare de semnal

- Principiul ADNului ramificat: esantioanele de acid nucleic viral sunt adsorbite pe un suport cu sonde ADN ramificat la care hibridizeaza sonde de relevare. Molecule luminescente sunt asociate sondelor moleculare de relevatie semnalul fluorescent fiind proportional cu numarul de molecule de acid nucleic viral adsorbit Utilizarea simultan a mai multe sonde ramificate complementare la diferite regiuni ale genomului viral int, permite detectarea virusurilor foarte variabil dpdv genetic (HIV, HCV). Numrul mare de molecule luminescente implicate permite o scadere a limitei de detecie, fr risc de contaminare (fara amplificare a acizilor nucleici, n contrast cu tehnica PCR).

Hibridizare pe membrana si pe chipuri

Principiul diferitelor metode: 1) sonde de hibridizare moleculara fixate pe un suport specific pentru a detecta un virus mutant 2) dtectia imuno-enzimatica. Sondele sunt prezente pe benzi iar antigenele sunt fizate pe aceste benzi de imunoblot ex : gnotiparea HVC, mutatii ale HVB). Microcipurile permit detectarea nmutatiilor virusurilor. Un mare numar de sonde asezate ordonat in forma de sir pe suporturi de siliciu sticla etc reprezinta o combinare de tehnic informatice si moleculare. O aplicatie este detectia mutaiilor la HIV asociata cu resistenta la medicatia retrovirala.

Genotiparea HVC prin hibridizare pe membran dup PCR, benzile sunt interpretate cu ajutorul unui model furnizat de productor. n acest caz, pacientul are o VHC genotip 1, subtipul B, mult mai uor rezistente la anti-VHC.

3.4.3. Amplificare genica

Acizii nuleici extrasi dintro proba prin absorbie lor pe particule de siliciu incarcate pozitiv si elutie urmata de amplificare genica saiu PCR permite recopierea unei portiuni limitate de genom viral pentru amplificarea genica se detecteaza acizii nucleici amplificati pe gel de agaroza sau hibridizare moleculara post PCR

.4.4. Secventiere nucleotidica

Metoda Sanger este folosita pentru secvenierea de rutin. Aceasta este un PCR, n care vom aduga dideoxynucleotides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), etichetate cu un fluorocrom la amestecul de reacie, ca de obicei. Polimeraza ADN-ul sintetizeaz folosindu-se, n mod aleatoriu, fie deoxynucleotide sau dideoxynucleotide. Fiecare dat cnd un dideoxynucleotid este ncorporat n lanul de ADN, alungirea lanul se oprete, deoarece aceste molecule nu permit legtura fosfodiester urmtoare. Secvena de reacie, astfel, duce la producerea de fragmente de ADN de toate dimensiunile disponibile (de exemplu, un fragment de ADN de 200 de nucleotide copiate 1 la 200). Aparatul permite detectarea automat a fluorocromilor din aceste fragmente de ADN separate prin electroforeza capilara pe gel de acrilamid vertical sau n capilare umplute cu polimer de siliciu

3.4.5. Cuantificare (estimare cantitativa)

Diferite truse de PCR comercializate se bazeaza pe acest principiu . Un etalon este introdus in prelevatele de analizat, inaintea extractiei acizilor nucleici (etalon intern). Acest etalon este un acid nucleic a carui extremitati sunt identice cu secventa virusului salbatic Acest lucru permite s foloseasc aceeai pereche de primeri. Prin contra, ntre capetele la care hibridizeaz grunduri, secvena de nucleotide difer de cea de-slbatic de tip virus, care se pot distinge dou produse PCR sau prin electroforez (diferite dimensiuni) sau prin hibridizare dup PCR (sonde specifice diferite) ,

 PCR in timp real

Metoda PCR in timp real masoara cantitatea de molecule de ADN produse in timpul debutului fazei exponentiale a reactiei In mod schematic ADN ul produs in timpul PCR este cuantificat prin incorporarea unei molecule fluorescente sau a hibridizarii cu doua sonde specifice moleculare ce emit o fliuorescenta speciala Aparatele sunt echipate pentru lectura continua in timp real a fluorescentei emise

Curbe de cantificare a EBV in sangele total prin PCR in timp real : curbele de mai sus ilustreaza amplificarea ADN de la martorii pozitivi la diferite concentratii (curba etalon externa).

Metode de diagnostic molecular

Indicatiii asupra metodelor de diagnostic molecular : Tehnici calitative : pentru demostrarea prezentei unui virus in particular unui virus in special cand nu este cultivabil (HVC), sau care lichidul biologic nu este adecvat pentru cultura (LCR). Tehnici cantitative : pentru pacientii sub tratament antiviral (HIV, HVC, CMV, HVB). Secventiere : detectarea mutatiilor nucleotidice - asociere cu rezistenta la antivirale (HIV, HVB), - caracteristici ale genotipurilor de virus (HVC, HVB). Interesante pentru ca :sunt sensibile si pot sa fie automatizate Limite : exista riscuri de contaminare pentru tehnica PCR. nu se poate stabili caracterul infectios al virusului detectat. Caracterizarea fenoticipa a tulpinii nu este posibila. Costurile sunt inca destul de mari.

Referinte
Allain Philippon, Paris Universite V, site microbes-edu.org http://basic.shsmu.edu.cn/kejian/microbiologie/www.microbeedu.org/etudiant/etudiants.html Kaiser Color Atlas of medical Microbiology Thieme, 2005