INTRODUCERE N HISTOCHIMIE I IMUNOHISTOCHIMIE Partea I

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE CRAIOVA

PLANUL PREZENTRII

Prelucrarea i fixarea esutului

Secionarea i arhivarea Principii de imunohistochimie

PLANUL PREZENTRII

Prelucrarea i fixarea esutului

Secionarea i arhivarea Principii de imunohistochimie

Rolul fixrii
Previne autoliza i atacul bacterian
Modificrile anoxice, leziunile mitocondriale apar n 10 minute de la moartea esutului Enzimele ciclului fosforilrii oxidative dispar n prima or

Menine structura esuturillor aproape de statusul in vivo

Prin aciunile lor mascheaz situsurile antigenice recunoscute de anticorpi
Exist anticorpi sintetizai pentru epitopii fixai, dar au utilizare limitat

Tipuri de fixativi (n funcie de aciune):

Denaturani (coagulani)
metanol, etanol, acid acetic

Cu funcie aditiv
aldehide, carbodiamide

Cu funcie mixt
cloruri mercurice

Tipuri de fixativi (n funcie de structur):

Aldehide: formaldehid, paraformaldehid,
glutaraldehid

Ageni oxidani:ioni metalici, tetraoxid osmic Ageni coagulani:acid acetic, metanol, etanol Ali ageni aditivi: carbodiamide Factori fizici: cldur, microunde

Alte structuri: cloruri mercurice

Mecanismul fixrii
Unul din cei mai cunoscui fixatori, formalina, fixeaz prin formarea de puni metilenice ntre reziduurile peptidice

Metoda fixrii n formalin

Recoltarea piesei Fixarea propriu zis (formalina fixeaz 0,5 cm/h) Deshidratarea esutului (alcool 50%, 70%, 90%, 100%) Clarificarea n xilen sau cloroform (maxim o or, esutul devine friabil) Includerea n blocul de parafin * Greelile de fixare i clarificare sunt ireversibile, deshidratarea se poate reface retrograd pornind de la blocul de parafin

PLANUL PREZENTRII

Prelucrarea i fixarea esutului

Secionarea i arhivarea Principii de imunohistochimie

Secionarea cu ajutorul microtomului

1. Secionarea propriu-zis Se obine o band continu de seciuni unite.

2. Seciunile se ntind pe o baie de ap cald i se pescuiesc pe lam.

3. Se las s se usuce peste noapte.

Prezervarea i secionarea esutului

Clasic, biopsiile sunt fixate n formalin neutr tamponat, apoi fixativul este ndeprtat i esutul deshidratat, splat ntr-un mediu puternic polar (xilen sau cloroform), dup care este inclus n parafin. Secionarea se face cu ajutorul microtomului, la grosimi variabile, de cel puin 1 m. Tehnica este ideal pentru procedeele clasice de microscopie n care secionarea subire duce la o bun vizualizare cu obiective mari esutul se poate post-fixa n glutaraldehid pentru microscopie electronic (0.1 m).

Secionarea cu ajutorul microtomului

Secionarea cu ajutorul microtomului

PLANUL PREZENTRII

Prelucrarea i fixarea esutului

Secionarea i arhivarea Principii de imunohistochimie

PRINCIPII DE IMUNOHISTOCHIMIE (IHC)

Introducere n IHC Antigene, anticorpi Ce este recuperarea antigenic? Particulariti ale procesrii esutului pentru IHC Secvena tipic a IHC

Vizualizarea semnalului n IHC

INTRODUCERE N IMUNOHISTOCHIMIE (IHC)

Histochimia combin tehnicile de biochimie i histologie n studiul compoziiei chimice a esuturilor i celulelor.
Imunologia se ocup de sistemul imun, de aspectele umorale i celulare ale imunitii, de rspunsul imun. Imunohistochimia (IHC) integreaz cele dou discipline de mai sus.

INTRODUCERE N IMUNOHISTOCHIMIE (IHC)

IHC folosete o tehnologie bazat pe anticorpi pentru a detecta i localiza antigene specifice tisulare. Principiul de baz al IHC este faptul c un anticorp se leag specific de un antigen prin formarea unui complex antigen anticorp unic. Aceast legtur (detecie) este folosit pentru vizualizarea aspectelor normale i patologice ale esuturilor, aspecte ce nu pot fi puse n eviden prin tehnici normale de histochimie.

Antigene
Un antigen este un element strin self-ului fiecrui organism, avnd proprietatea de a stimula formarea de anticorpi, i apoi de a se lega la acei anticorpi. De obicei, antigenele sunt proteine sau glicoproteine cu mas molecular mare. Un antigen ce determin un rspuns imun puternic se numete puternic imunogen.

Antigene
Epitopul reprezint un situs de pe suprafaa antigenului fa de care un anticorp complementar poate prezenta o reactivitate specific.

Anticorpi
Anticorpul este o imunoglobulin capabil de o reactivitate specific fa de antigenul care a declanat sinteza sa. Anticorpii sunt produi de limfocitele B ca rspuns la invazia elementelor strine n organism (bacterii, virusuri, etc.) Specia de limfocite B responsabile de producerea anticorpilor se numesc plasmocite, iar fiecare plasmocit produce un anticorp cu o specificitate unic.

Anticorpi
Fiecare anticorp tipic este alctuit din patru polipeptide unite ntr-o molecul n form de Y:
Dou lanuri grele Dou lanuri uoare

Structura anticorpilor
Funcional, anticorpul tipic n form de Y este compus din 2 regiuni variabile de legare a antigenului (Fab) i poriunea de activare a complementului (Fc). Poriunea din fragmentul Fab direct implicat n legarea epitopului se numete paratop.

Structura anticorpilor
Pe baza structurii fragmentului Fc, se deosebesc 5 clase majore de anticorpi: IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Lanurile grele ale imunoglobulinelor sunt de mai multe tipuri: (gama), (miu), (alfa), (delta) i (epsilon). Lanurile uoare pot fi clasificate ca lanuri (kapa) sau

(lambda).

Datorit prezenei sale majoritare n ser i a perioadei crescute de njumtire, n IHC, IgG este cea mai frecvent folosit clas de imunoglobuline.

Reacia antigen-anticorp
Anticorpii leag antigenele prin intermediul regiunilor variabile. Aceste legturi sunt asigurate de cele 4 fore non-covalente (hidrofobice, ionice, Van der Waals sau puni de hidrogen). Afinitatea este un indice al forei de legtur dintre un anticorp monovalent i un epitop. Aviditatea este cea care descrie afinitatea funcional, i este de fapt o msur a afinitii totale de legare dintre un anticorp i un antigen.

Producerea anticorpilor
n mod clasic, anticorpii sunt produi prin imunizarea unor animale (iepure, oarece) fa de antigenul purificat. Animalele rspund prin producerea de anticorpi ce recunosc specific aceste antigene.
Anticorpii pot fi policlonali sau monoclonali.

Producerea anticorpilor policlonali

Anticorpii policlonali se prezint ca diferite tipuri de Ig produse de ctre mai multe clone de plasmocite i recunosc epitopi variai ai antigenului. Deoarece recunosc o clas de epitopi, au o toleran crescut la variaii mici de structur a antigenului.
Iepurele este cel mai folosit animale pentru producerea serurilor imune.

Producerea anticorpilor policlonali

antigen

Iepurele este injectat intradermic sau subcutanat cu antigenul purificat.

Producerea anticorpilor policlonali

anticorpi

Y Y Y

Sistemul imun al iepurelui produce anticorpi specifici antigenului injectat.

Producerea anticorpilor policlonali

Cnd se nregistraz producerea maximal de Ig, sngele este recoltat de la nivelul urechii.

Producerea anticorpilor policlonali

Y Y Y

Y Y Y

Hematiile i fibrinogenul sunt eliminate, antiserul se purific.

Producerea anticorpilor monoclonali

Anticorpii monoclonali sunt derivai dintr-o singur clon de limfocite B i sunt produi sub forma unei singure clase de imunoglobuline. Limfocitele B specifice sunt fuzionate cu celule imortalizate (mielom) i formeaz un hibridom. Celulele hibride se multiplic indefinit i produc n mod continuu anticorpul monoclonal specific. Anticorpii monoclonali recioneaz cu un anumit epitop al antigenului (fond redus).

Acest fapt i face ns vulnerabili la prelucrarea chimic a esutului (fixare).

Producerea anticorpilor monoclonali

antigen

oarecele este injectat intradermic sau subcutanat cu antigenul purificat.

Producerea anticorpilor monoclonali

anticorpi

Y Y Y

Sistemul su imun produce anticorpi specifici antigenului injectat.

Producerea anticorpilor monoclonali

splin

Limfocite B

Limfocite B productoare de anticorpi sunt recoltate din splin.

Producerea anticorpilor monoclonali

Celule mielomatoase

Limfocite B

Limfocite B sunt fuzionate in vitro cu celulele mielomatoase rezultnd celule hibride imortalizate sau hibridoame.

Producerea anticorpilor monoclonali

Hibridoamele produc la infinit copii identice ale unui anticorp.

Producerea anticorpilor monoclonali

A. Hibridoamele sunt transplantate n cavitatea peritoneal a unor oareci singeni, iar anticorpii produi sunt recoltai ca lichid de ascit.

Producerea anticorpilor monoclonali

B. Hibridoamele sunt cultivate pe medii de cultur, iar anticorpii produi sunt preluai sub form de supernatant.

ANTICORPII PRIMARI
Sunt anticorpii folosii la detecia antigenelor de interes. Sunt disponibili n form concentrat sau prediluat. Fia tehnic a anticorpului detaliaz de obicei diluiile recomandate pentru diferite procedee. De multe ori ns este necesar optimizarea n fiecare laborator. Titrul anticorpului este cea mai mare diluie ce duce la o marcare specific a structurilor de interes cu o marcare de fond minim.

Demascarea antigenic
Este procesul de recuperare a structurii situsurilor antigenice blocate n timpul fixrii Metode de demascare antigenic:
Fierbere n soluii tampon (citrat pH6, EDTA pH9) Alternativ, se poate face o incubare la 80C peste noapte n aceleai soluii tampon ca mai sus Digestie enzimatic (proteinaz K, tripsin) Digestie chimic (acid formic)

Particulariti ale procesrii esutului pentru IHC

Recuperarea antigenicitii este o metod dur de tratare a esuturilot. Frecvent duce la desprinderea acestora de pe lam.
Pentru a preveni acest lucru se folosesc lame electrostatic + (siliconi ncrcai pozitiv sau cu lizin): Super Frost / Poly Lysine

Pentru un acces mai bun al anticorpilor la antigene, se utilizeaz seciuni subiri (2-3m).

Secvena tipic a IHC

Secionare a blocului de parafin Clarificare (solveni organici)

Hidratare (alcool n concentraie descresctoare) Recuperarea antigenica

Splare n ap Blocarea enzimelor endogene Splare n sol. salin Blocarea situsurilor antigenice nespecifice Blocarea biotinei endogene

Incubare cu primul anticorp

Splare n sol. salin Incubare cu anticorpul secundar i sistemul de detecie Detecia semnalului Deshidratarea, clarificarea i acoperirea cu lamela

Secvena tipic a IHC

esutul cu antigenele de interes, Ex. endoteliul vascular prezint molecula CD34 Soluia salin (PBS) = 0,9g% NaCl pH ~ 7,4 Se pot aduga detergeni (Tween, Triton) pentru seciunile mai groase.

Secvena tipic a IHC

Anticorpul primar, Ex. oarece anti-CD34 (uman) Anticorpul se dilueaz n sol. salin mbogit cu albumin (un mediu asemntor plasmei sanguine) Incubarea se poate face: - 1 h la 37C - peste noapte la 4C

Secvena tipic a IHC

Anticorpul senundar, cu sistemul de vizualizare, Ex. iepure anti-oarece

Secvena tipic a IHC

Reacia se poate amplifica (tipuri de amplificare n LP-ul urmtor).

Secvena tipic a IHC

Enzima cu care este etichetat anticorpul convertete un substrat incolor ntr-un precipitat colorat (DAB, diamino benzidina).

Secvena tipic a IHC

Rezultatul precipitrii DAB 40x 20x

Colorare cu DAB

Secvena tipic a IHC

40x

20x

Colorare cu DAB