Sunteți pe pagina 1din 13

7.

Aplicaii terapeutice ale produselor biotehnologice probiotice Introducere Probioticele n produse alimentare i farmaceutice au aprut pe pia n cursul ultimilor 20 de ani. Sunt definite ca nite culturi individuale sau mixte de microorganisme vii sau nepatogene, susceptibile s influeneze favorabil sntatea fiinei umane sau animalului care le ingereaz. La om probioticele i manifest efectele n cavitatea bucal sau n tubul digestiv (sub form de alimente sau capsule), n cile respiratorii (ca aerosoli) sau n cele genito urinare (prin aplicaii locale).[1] Pentru utilizarea de ctre om, probioticele trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: 1. s fie de origine uman;

2. s reziste procedeelor de fabricaie a produselor, aciditii gastrice, secreiei biliare i pancreatice; 3. s se fixeze pe celulele epiteliale ale intestinului pentru a rezista peristaltismului i s colonizeze, cel puin temporar, intestinul; 4. s produc substane antimicrobiene eficace fa de bacteriile cariogene i patogene.

n plus ele trebuie s fi fost supuse unor teste clinice recunoscute care au dovedit propietile lor favorabile pentru sntate. Flora intestinal a omului, relativ simpl la sugari unde predomin sua Bifidobacterium infantis, este foarte complex la adult avnd circa 1014 (100 de mld.) germeni, compui din 400 pn la 500 de specii, n majoritate anaerobe. O serie de funcii sunt atribuite microflorei intestinale: a. obstacol la dezvoltarea i translocarea bacteriilor patogene prin blocarea celulelor epiteliale de fixare a lor i prin producia de metabolii cu activitate antibiotic; b. stimularea sistemului imunitar; c. sinteza de vitamine B1, B2, B12, K, folai; d. producia de acizi grai inferiori, printre care acidul butiric cu funcii biologice n intestin; e. reacii de hidroliz, oxidoreducere, dezacidifiere; f. producia de gaze (CO2, H2, CH4, NH3, SH2);

g. mpiedicarea formrii de compui toxici, mutageni i cancerigeni (reducerea nitrailor la nitrii i nitrozamine). Pentru a elimina efectele nefaste ale microflorei i a favoriza pe cele pozitive s-a propus modificarea compoziiei i activitii catalitice a florei microbiene intestinale prin diverse msuri. Una dintre acestea const ntr-un aport de probiotice pe cale alimentar; tranzitnd n stare vie de-a lungul tubului digestiv ele l colonizeaz temporar i accentueaz funciile de protecie. Ca urmare probioticele trebuie ingerate periodic, de preferat zilnic. 7.1. Impactul antibioterapiei asupra florei intestinale Printre efectele secundare ale antibioterapiei, cele mai frecvente sunt accidentele digestive, de tipul diareelor de intensiti i graviti variabile, de cele mai multe ori benigne. Cele mai severe forme sunt mai frecvente la pacienii spitalizai i sunt cunoscute sub denumirea de colite pseudomembranoase, asociate cu bacteria patogen Clostridium difficile. Se pot ntlni de asemenea i la pacienii ambulatorii [2]. Diareele cauzate de antibiotice se nscriu ntr-o abordare de perspectiv mai larg, n sensul c efectele directe sau indirecte ale antibioticelor asupra omului i mediului su nconjurtor determin studierea aa numitului impact ecologic al antibioterapiei. Presiunea selectiv a antibioticelor se exercit asupra microflorei digestive care din punct de vedere fiziologic formeaz un ecosistem bazat pe un echilibru armonios al florei intestinale i pe interaciunile mucoasei digestive cu aceast flor. Acest echilibru rezult din mecanisme complexe, n care flora exercit o aciune fiziologic marcant i care const n sinteza de vitamine, degradarea glucidelor, lipidelor i proteinelor alimentare, influena asupra mririi vilozitilor intestinale i n tranzitul intestinal. Pe de alt parte civa factori locali, printre care, mecanismele imunologice (secreia IgA), peristaltismul intestinal, tipul de alimentaie i alii influeneaz i controleaz acest echilibru microbian. n acest sistem interactiv, flora bacterian normal (format din 1014 bacterii) exercit un fect de bariersau (rezisten la colonizare), care se opune implantrii de bacterii necomensale i n care flora strict anaerob, care este cea mai numeroas i dominant, joac un rol major [3]. Practic toate grupele de antibiotice (cu excepia vancomicinei i aminozidelor) sunt susceptibile de a provoca diaree frecvent variabil, cu toate c speciile anaerobe din flora dominant fac parte din spectrul lor de aciune i concentraiile lor intestinale sunt ridicate. Manifestrile diareice sunt n mod particular frecvente i grave la pacienii din serviciile de reanimare, unde n absena agenilor patogeni specifici, infeciile intestinale survin ca anomalii profunde ale microflorei digestive cauzate de stress, de imunodepresie sau de antibioterapie adesea masiv. n acest context o patologie sever asociat cu administrare de antibiotice este colita pseudomembranoas, n cursul creia multiplicarea lui Clostridium difficile, este nsoit de producerea simultan a dou toxine, o enterotoxin (toxina A) i o citotoxin (toxina B), care produc leziuni la nivelul mucoasei colonului i semne clinice severe. De aceea a fost propus o terapeutic specific, destinat a eradica eventualii ageni patogeni i de a corecta tulburrile hidroelectrolitice i care const n administrare de microorganisme nepatogene pentru restabilirea unui nou echilibru ecologic intestinal. Pentru a avea o eficacitate ridicat, aceste microorganisme trebuie s fie viabile, pentru a rezista n

tubul digestiv, ntr-un numr mare pentru a avea efect de barier de substituie i s fie insensibile la principalele antibiotice utilizate n mod curent la antibioterapie[4]. Pentru realizarea acestor obiective au fost efectuate numeroase studii asupra sensibilitii la antibiotice a principalelor preparate probiotice disponibile, formate din microorganisme de substituie, pentru a se realiza un procedeu de control ecologic al dezordinii digestive indus de antibioterapie. ntr-un studiu efectuat n Frana n anul 1995, s-au utilizat 2 tulpini de drojdii, Saccharomyces boulardii i Saccharomyces cerevisiae, precum i 4 tulpini bacteriene, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bifidus, Bacillus cereus i Lactobacillus casei varietatea rhamnosus. Antibioticele folosite n vitroau cuprins, monociclin, doxycilin, cefuroxim, ceftriaxon, asociaia trimetroprim sulfometoxazol i norfloxacin. S-a determinat concentraia minim inhibitorie (CMI) i concentraia minim bactericid (CMB) a acestor antibiotice fa de microorganismele studiate. Concentraiile finale ale soluiilor de antibiotice, au fost cuprinse ntre 0,03 i 128 mg/l. Pentru determinarea CMI s-a utilizat o tehnic de microdiluie n mediu lichid cu un inocul de 1010 UFC, n prealabil etalonat. Studiul CMB s-a realizat innd cont de exigenele particulare ale microorganismelor studiate, mediile de cultur utilizate fiind mediu MRS pentru Lactobacillus acidophilus i Lactobacillus casei, mediu MRS special pentru Lactobacillus bifidus, mediu Mueller Hinton pentru Bacillus cereus. Saccharomyces boulardii i Saccharomyces cerevisiae au fost obinute n suspensie n mediu YNB, completat cu 5% glucoz, plecnd de la mediul Sobouraud nclinat. Cele dou tulpini de drojdii nu au fost testate pentru CMB, tiindu-se rezistena lor la antibioticele testate [5] . Determinarea CMI pentru cele 6 microorganisme studiate a dus la mprirea acestora n 2 categorii. Cele dou levuri studiate, Saccharomyces boulardii i Saccharomyces cerevisiae au rezisten total la tetraciclin (CMI = 32 mg/l pentru monociclin i doxicilin), la peniciline (MCI > 128 mg/l pentru amoxicilin i penicilin V), la cefalosporine (CMI > 128 mg/l pentru cefodoxil, cefaclor de prima generaie (C1G), cefuroxin de a doua generaie (C2G), cefoperazon, ceftriaxon de a treia generaie (C3G)), la quinolone (CMI > 128 mg/l pentru norfloxacin) i la trimetroprim sulfametoxazol (CMI > 128 mg/l). Cele 4 bacterii studiate sunt reprezentate de 2 tulpini de Lactobacillus, o tulpin de Bacillus cereus i o tulpin etichetat ca Bacillus bifidus care n realitate este un Bifidumbacterium bifidum i reprezint constituentul predominant al florei intestinale a noilor nscui. Dintre peniciline, amoxicilina inhib lactobacilii la concentraii cuprinse ntre 0,03 i 0,125 mg/l i este mai puin activ asupra lui Bacillus bifidus (CMI = 1 mg/l). Oracilina are o activitate mediocr asupra celor 4 bacterii, toate fiind inhibate la CMI = 16 mg/l. Cefalosporinele de a treia generaie, sunt foarte active asupra lui Lactobacillus acidophilus i Bacillus bifidus, CMI este de 0,125 mg/l pentru cefuroxim i 4 mg/l pentru cefadroxil i ceftriaxon. Norfloxacina este foarte activ asupra lui Bacillus cereus i Lactobacillus casei (CMI = 0,03 0,125 mg/l), iar trimetroprim sulfometoxazol este mediocru activ asupra celor 4 bacterii cu un CMI cuprins ntre 2 8 mg/l. 7.2. Cercetri experimentale cu Saccharomyces boulardii 7.2.1. Modele animale experimentale

Efectul antagonic exercitat de Saccharomyces boulardii asupra drojdiei Candida albicans a fost demonstrat pe oarecii gnatoxenici, legat de efectul protector fa de Candida albicans, prin administrarea simultan a 5 109 celule de Saccharomyces boulardii. Eliminarea tulpinii Candida albicans n urma administrrii de Saccharomyces boulardii este cuprins ntre 50 100%. Acest efect antagonist se exercit i asupra altor specii de Candida (Candida crusei i Candida pseudotropicalis), dar nu i asupra drojdiei Candida tropicalis. ntr-un model de colit cauzat de Clostridium difficilela oarecii gnotobiotici, crora li s-a aplicat un tratament preventiv, oral, cu Saccharomyces boulardii n suspensie (1010 celule/ml), a permis reducerea semnificativ a mortalitii cauzate de infecia experimental cu Clostridium difficile (108 UFC/ml). n acest experiment 56% din oareci au fost protejai prin administrarea continu de Saccharomyces boulardii cu 4 zile nainte de inocularea cu Clostridium difficile n timp ce n lotul martor au fost 0% supravieuitori [6] . La oarecii axenici, de asemenea s-a studiat un protocol analog, n care loturile de animale infectate cu o su toxinogen de Clostridium difficile au fost tratate cu Saccharomyces boulardii, fa de unele loturi martor netratate. Examenul la microscopul electronic cu baleaj a artat leziuni specifice la nivelul mucoasei intestinale, caracteristice colitei produs de Clostridium difficile la loturile martor, i absena sau puine leziuni la animalele tratate. La acestea din urm numrarea celulelor de Clostridium difficile nu a artat o reducere semnificativ a numrului de bacterii, ns cantitatea de toxine A i B a fost semnificativ redus prin administrarea de Saccharomyces boulardii.[ [7], [8]] La hamsteri, administrarea de Saccharomyces boulardii animalelor care au primit clindamicin a redus semnificativ mortalitatea cauzat de Clostridium difficile n proporie de peste 50%, n raport cu lotul martor netratat cu clindamicin. ntr-un alt studiu efectuat hamsterii care au primit o doz letal de clindamicin (10 mg/kg), s-a artat c dup tratamentul cu vancomicin, animalele supravieuiesc, dar sigur s-a putut observa dezvoltarea de > 106 UFC de Clostridium difficile. ntr-un lot tratat, la sfritul a 10 zile de vancomicin, cu o suspensie de 5 108 UFC/ml de Saccharomyces boulardii, s-a constatat o diminuare semnificativ a numrului de colonii de Clostridium difficile, o scdere a nivelului de toxin B i o valoare negativ a testului latex (LAT) pentru aceast toxin (3% din animale sunt pozitive la acest test dintr-un lot de animale tratate cu Saccharomyces boulardii, fa de 33% din animale din lotul martor). 7.2.2. Studii cu Saccharomyces boufardii n terapia uman ntr-un studiu controlat fa de placebo, raportul dintre numrul de zile cu diaree i numrul de zile de observaie (22,7 zile) a fost de 1,5% la pacienii care au fost tratai cu titlu preventiv prin administrarea de Saccharomyces boulardii, fa de 9,1% din lotul martor. Foarte recent n colitele pseudomembranoase asociate cu Clostridium dificile, administrarea de Saccharomyces boulardii, ntr-o terapeutic standard bazat pe vancomicin, a redus semnificativ procentul de recidive, cu un rspuns favorabil la 85% dintre pacieni i a eradicat bacteria i toxinele sale. [9] n studiile efectuate pe pacieni spitalizai, s-a artat c incidentele cu diaree sunt de 22% la grupa placebo, fa de 9,5% la grupa de pacieni tratai cu Saccharomyces boulardii. 7.2.3. Persistena celulelor de Saccharomyces boulardii n tubul digestiv

Aceast persisten, cu sau fr prezen simultan a antibioticelor n lumenul intestinal, ntr-o anumit perioad considerat de risc, trebuie pus n eviden. Un studiu recent demonstreaz la obolani, persistena celulelor viabile de Saccharomyces boulardii n prezena antibioticelor, neomicin, ampicilin i clindamicin, administrate nainte de absorbia unei doze unice de Saccharomyces boulardii (4109 UFC/kg). S-a determinat nivelul de celule de drojdie dup 72 i 96 ore de la administrare, gsindu-se c acesta este de 2 pn la 7 ori mai ridicat, n prezena antibioticelor. Aceste rezultate demonstreaz nsensibilitatea drojdiei Saccharomyces boulardii la aceste antibiotice, ceea ce constituie o caracteristic indispensabil a eficacitii preparatelor comerciale de pe pia, Ultra Levure, enterol. Persistena drojdiei Saccharomyces boulardii i farmacocinetica sa intestinal a fost n mod egal studiat pe obolani i pe voluntari, obinndu-se rezultate comparabile [10] . 7.2.4. Translocaia microbian Un alt efect al perturbrilor microbiene legat de antibiotice este fenomenul de translocaie microbian, care const n complicaii infecioase la distan de sfera digestiv, cum sunt pneumopatiile [41]. Implantarea digestiv de titruri ridicate de bacterii multirezistente, ca ageni infecioi nosocomiali (Pseudomona aeruginosa, Enterobacter cloacae, Klebsiella sp.) la pacienii din reanimare i producerea de ctre aceti ageni a lactamazei cu spectru larg, poate duce la trecerea acestor bacterii din tractul intestinal, prin ganglionii mezenterici, la alte organe, producnd infecii extradigestive. Translocaia este mai frecvent n traumatismele intestinale, iradiere, stri de oc, chimioterapie sau sub aciunea altor factori susceptibili de a modifica permeabilitatea epiteliului intestinal. Nivelul inoculului bacterian este de asemenea un factor favorizant (> 1012 UFC). Prevenirea translocaiei se bazeaz pe decontaminarea selectiv a tubului digestiv (SDD), utiliznd doze forte de antibiotice asociate, administrate oral i cu absorbie ncetinit, la nivelul cilor digestive, ca polimixine, colistin sau acid nalidixic, asociate cu aminozide i amfotericin B, iar cteodat i vancomicin. Acest procedeu este uneori controversat, fiind adesea utilizat pentru reducerea semnificativ a mortalitii pacienilor din reanimare. Translocaia drojdiei Candida albicans poate de asemenea s produc i s determine o candidoz sistemic la pacienii imunodeprimai [11] . n experimentele pe oareci liberi de patogeni specifici (SPF), dup decontaminarea digestiv timp de 4 zile cu streptomicin i penicilina G i ingestia de Candida albicans (109 celule/ml) i de Saccharomyces cerevisiae (5108 UFC/ml) s-a redus semnificativ, incidentele de translocaie, dar nu i numrul de celule de Candida albicans. Din contr, la oarecii imunosupresivi, care au primit prednisolan, s-a ntlnit un numr semnificativ mrit de translocaii. n prezena drojdiei Saccharomyces boulardii au fost semnificativ reduse, incidena translocaiilor, numrul de celule de Candida albicans n alte organe i siturile infecioase secundare dup translocaie. Aceste rezultate sugereaz un potenial avantaj pentru utilizarea drojdiei Saccharomyces boulardii la pacienii cu risc, ns aceste studii trebuie continuate. 7.2.5. Infecia cu Clostridium difficile la copii La copii infecia cu Clostridium difficile se exprim n mod excepional printr-o colit pseudomembranoas i rspunde favorabil la administrarea de Saccharomyces boulardii. n mod paradoxal s-a constatat c, colitele pseudomembranoase asociate cu Clostridium difficile sunt foarte rare naintea vrstei de 2 ani, atunci cnd 60% din nou nscui excret asimptomatic Clostridium difficile n scaune. Acest fenomen se explic prin imaturitatea sau

absena receptorilor specifici toxinei A, sau prin efectul de neutralizare, de ctre anticorpii materni. Toate formele fulminante i mortale de colite pseudomembranoase care au fost descrise la noii nscui, sunt raportate la virulena acestui germen i nu trebuie neglijate. n mod sigur suele toxicogenice de Clostridium difficile, care sunt responsabile la copii de enteropatiile cronice persistente, rspund la un tratament bine adaptat [12] . ntr-un studiu, n care 19 noi nscui i copii, prezentau un tablou de diaree cronic cu colit, hipermeteorism i absorbie dificil, a fost identificat Clostridium difficile, ca singurul enteropatogen din coprocultur. Cei mai muli dintre copii au primit unul sau mai multe tratamente cu antibiotice n sptmnile sau lunile precedente admisiei de Ultra Levure. Tratamentul cu Ultra Levure a condus la dispariia simptomatologiei clinice la 18 copii i la dispariia toxinei B, la 16 dintre acetia[13] . La ora actual este uor de identificat Clostridium difficile n practica curent. Evoluia tehnicilor de diagnostic este considerabil n ultimii 10 ani, graie aportului imunologiei i geneticii moleculare. Punerea n eviden a efectului citopatogenic a toxinei B, din culturi celulare a fost realizat cu o tehnic de referin. Testele imunoenzimatice Elisa permit la ora actual realizarea n mai puin de 3 ore a unui diagnostic sensibil i specific infeciei cu Clostridium difficile. Markerii pot fi fenotipici, la fel ca rezistena la antibiotice, profilul electroforetic, tipurile serologice sau testele imunologice. Markerii genetici pot fi la fel ca profilul plasmidic, care permite identificarea specific i sigur a diferitelor tipuri de sue de Clostridium difficile. 7.2.6. Mecanismul de aciune al drojdiei Saccharomyces boulardii Saccharomyces boulardii elibereaz n vivoo proteaz de 54 kDa, susceptibil de a hidroliza prima dat toxina A i receptorul su eritrocitar, sau printr-o inhibiie, efectele enterotoxice, ca hipersecreia i permeabilitatea membranar. Alte mecanisme de aciune se refer la efectul protector al drojdiei Saccharomyces boulardii, care const ntr-o cretere marcant a concentraiei de Iga, secretat n lichidul intestinal. La om Saccharomyces boulardii antreneaz o utilizare semnificativ a dizaharidelor intestinale: sucraza, maltaza i lactaza. Aceste efecte trofice pot fi legate de poliamine (spermin, spermidin) eliberate n cursul tranzitului intestinal de ctre Saccharomyces boulardii [ [14], [15] ]. 7.3. Proteine terapeutice De la prima comercializare a unei proteine terapeutice umane din drojdie, care a fost n 1986, vaccinul contra Hepatitei B, alte cteva produse au fost cercetate i utilizate clinic ca leukine GM CSF, pentru transplantul de mduv, insulina uman pentru tratamentul diabetului, factorul de necroz tumoral, iar altele sunt n diferite stadii de cercetare i testare clinic cum ar fi vaccinul terapeutic anti HIV. n Tabelul 1 sunt listate cteva gene heterologe care au fost exprimate cu succes n celulele de drojdii i care prezint un real potenial n aplicaiile farmacologice [[16] ,[17] ]. Tabel 1. Exemple de proteine terapeutice clonate i sintetizate de drojdii Surs donor ADN Exemple de produse ale genelor

Procariote Viral Protozoare Animale

Fragmentul de toxin tetanic, streptokinaz Diferite gene care codific antigeni de suprafa, enzime i proteine din urmtoarele virusuri: hepatita B, HIV, influento, polio, leucemie bovin, polyoma Epstein Barr, retrovirusuri oncogene. Antigenul malariei Hirudin de lipitoare, echistatiu de viper, interferon porcin, - globina turbrii, urokinaz porcin, inhibitor de tripsin pancreatic bovin (aprotinin), interleukin bovin Hormoni: insulin, hormon paratiroidian, gonodotrofin uman, hormonul de cretere uman, somatostatin. Anticorpi: anticorpi funcionali i fragmente Fab, receptor IgE Factori de dezvoltare: factor de dezvoltare a insulinei (IGF1), factori de dezvoltare nervoas, factori de dezvoltare a epiderminei, factori tisulari, interleukine, factor de stimulare a coloniilor de macrofage, leukin GM CSF, factor de necroz tumoral Interferoni: interferon leucocitar alfa (D), interferon alfa 2, - beta 1 i hibrid X 430. Proteine sanguine: hemoglobin, factorii VIII i XIII, eritropoetin, serum albumin, antitrombin III, antitripsin alfa1, activator de plasminogen tisular, fibrinogen, lactoferin. Enzime i inhibitori: proteinaza inhibitoare 6, lipaz gastric, peroxidaz tiroidian, pro urokinaz, - amilaz salivar, lizozim, inhibitor de elastaz (Elafin), superoxiddismutaz Cu, Zn, citocrom P450. Amestecuri: receptor estrogenic, regulator (CFTR) de conductan transmembranar a fibrozei chistice, cicline homoloage CDC28 i G1, antigeni de suprafa ai celulelor canceroase, endorfin - . 7.4. Aplicaii biomedicale

Uman

Pentru descoperirea de noi ageni terapeutici umani, celulele de drojdie au fost utilizate ca modele experimentale n cercetrile biomedicale referitoare la oncologie, farmacologie, toxicologie, virologie i genetic uman. Pentru studiile fundamentale din aceste domenii au fost utilizate dou tulpini de drojdii: Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe (Tabelul 2) [18] . Tabelul 2. Cercetri biomedicale cu drojdii. Domenii biomedicale Oncologie Exemple de cercetri cu drojdii - mecanismele moleculare ale punctelor de control G1 S i G2 M din ciclul celular sunt determinate prin utilizarea nmuguririi i fiziunii drojdiilor. Aceste controale sunt importante pentru

nelegerea diviziunii celulei canceroase, - reglarea biochimic a ctorva cancere umane a fost studiat n Saccharomyces cerevisiae, - mutaiile genei p53, care este implicat n tumorogenez, au fost studiate prin analiza funcional pe drojdii, - funcionarea unor proteine de legtur n Schizosaccharomyces pombe, pentru descifrarea mecanismelor cancerului celular, - Saccharomyces cerevisiae a fost utilizat pentru studiul strii de apoptoz a celulelor. - drojdiile sunt utilizate n studii de genetic i biochimie a rezistenei multimedicamentoase, - studierea modului de aciune a medicamentelor (ageni antitumorali) este fezabil n celulele de drojdii, - n drojdii au fost studiate aspecte privind metabolismul medicamentului, interaciunile medicament medicament i aspecte farmacocinetice, - n Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe au fost studiate aspecte de screening a medicamentului i realizate teste rapide de mutagenez i genotoxicitate, - drojdiile au fost de asemenea utilizate pentru studiul unor micotoxine i a xenoestrogenilor, - chimicalele toxice i poluanii simpli au fost detectai cu biosenzori de drojdii. - Saccharomyces cerevisiae a fost folosit n virusologia uman ca model viral pentru obinerea de plasmide killer, pentru componente antivirale (antigeni de suprafa pentru vaccinuri), ca sistem pentru studierea aciunii proteinei virale, i ca dublu sistem hibrid pentru studierea interaciunii proteinelor virale. - cromozomii artificiali de drojdie (YACa) sunt de nenlocuit n clonarea ADN uman i n cartarea genomului uman. - cercetarea prionilor de drojdie ofer noi perspective n biologia molecular a proteinelor ereditare i a unor posibile terapii pentru cteva afeciuni umane neurodegenerative ca, maladia Creutzfeld Jacob, insomnia familial fatal i kuru.

Farmacologie i Toxicologie

Virusologie

Genetic Tulburri neurodegenerative

Studierea proteinelor ABC din drojdie (caseta de legtur ATP) a creat perspective de a se ptrunde n biologia molecular fundamental a ctorva afeciuni umane, care sunt definite ca funcii de transport ale unui ABC deficient i includ fibroza chistic, adrenoleukodistrofia, sindromul Zellweger, hiperinsulinemia infantil, sindromul Dubin

Jonson, sindromul limfocitar Tip1, diabetul insulino dependent i scleroza multipl. n termenii practici cunoaterea structurii genomului de drojdie i homologia cu genomul uman poate duce la noi descoperiri (medicamente specifice sau terapie genic) n tratamentul acestor afeciuni umane. 7.5. Drojdiile ca medicament aliment Contientizarea legturii strnse existente ntre hran i alimentaie a determinat recunoaterea rolului activ pe care alimentaia trebuie s-l joace n terapia modern, trecnduse de la alimentele dietetice (cu rol pasiv) la alimentele medicament. Asemenea produse sunt numite i alimente de protecie, deoarece ele se adreseaza i colectivitilor expuse la anumii factori de risc, ca urmare a condiiilor specifice de munc si via. Concentraia ridicat de oxigen din atmosfer este potenial toxic pentru organismele vii datorit formrii radicalilor liberi, extrem de nocivi pentru moleculele cu activitate biologic. Aprarea organismului contra aciunii radicalilor liberi este asigurat de trei enzime cu rol antioxidant: superoxid dismutaza (SOD), glutation peroxidaza si catalaza. Principalul rol al acestor antioxidanti este cel de impiedicare a propagrii reaciilor radicalice. Descoperirea prezenei selenitului in situsul activ al glutation peroxidazei a permis nelegerea rolului esenial al seleniului n prevenirea unor maladii, aparent foarte diferite distrofie muscular, necroza ficatului, tulburri de reproducere, cancer, deficit imunitar, cardiopatii, astm, ateroscleroza, depresie. Un deficit de seleniu, chiar nensemnat, afecteaz activitatea glutation - peroxidazei i conduce la peroxidarea membranelor celulare i intracelulare. Stresul datorat deficitului n seleniu, provoac sindroame clinice specifice, ca de exemplu hemolize, necrozarea tesutului, degenerescene si ca urmare, crete riscul dezvoltrii maladiilor cronice [[19] , [20] , [21] , [22] , [23] ]. Datorit aciunii antioxidante , imunomodulatoare i de protecie a celulei hepatice n ultimul timp utilizarea compuilor cu seleniu a dat rezultate bune n profilaxia i tratamentul anumitor forme de cancer (de prostata, pulmonar, ciroz etc.) [24]. Prin creterea efectului bioproductiv i aciunea sa contra micotoxicozelor i creterea fertilitii masculilor, compuii cu seleniu pot contribui la mbuntirea productivitii i sntii animalelor de ferm. n prezent, raiile alimentare utilizate pentru creterea psrilor i animalelor de ferm, n strintate, sunt imbogite cu seleniu. Cele mai utilizate fome de seleniu sunt selenitul i selenatul de sodiu, selenometionina i "drojdia seleniata".[25] Din punct de vedere biochimic administrarea de seleniu, sub forma anorganic, ca antioxidant, apare ca o metod tot mai puin recomandat, datorit coninutului ridicat de oxigen al surselor anorganice de seleniu [[26] , [27] , [28]]. n prezent pe plan mondial sunt comercializate peste 30 de produse ce furnizeaz seleniul sub form organic. n Romania se comercializeaz n special produse din import (ORGASEL 50), iar medicamentele ce conin seleniu organic, sunt doar condiionate n ar (Selevit). Biomasa de drojdie cu coninut ridicat de seleniu este destinat utilizrii ca aditiv n hrana psrilor i animalelor de ferm i ca principiu activ pentru obinerea unor medicamente cu aciune antioxidant, imunomodulatoare i hepatoprotectoare.

7.5.1. Obinerea biomasei de drojdie seleniat Pentru obinerea biomasei de drojdie ce conine seleniu intracelular s-au publicat date privind experimentarea cu tulpini microbiene din genurile Saccharomyces si Candida. Astfel, s-a brevetat un procedeu de obinere a unor preparate de drojdie utilizate ca surse organice de seleniu, crom sau germaniu, minerale a cror absen, n organism produc perturbri n procesele metabolice, ce conduc la creterea incidenei unor boli cum ar fi, diverse cancere, diabet. Autorii prezint, de asemenea, metode de izolare a unor tulpini de Saccharomyces boulardii PY31, compoziia mediilor de cultur pentru creterea biomasei de drojdie i metode de administrare a preparatelor obinute ca supliment nutriional la om - date ce constituie i obiectul unui alt brevet al acelorai autori [ [29] , [30] ]. Procedeul brevetat cuprinde izolarea tulpinilor de drojdie din mostre de sol, screeningul tulpinilor izolate, cultivarea tulpinii selectate pe medii de cultura imbogaite n factori de cretere, conservarea acesteia, precum i obinerea biomasei de rojdie seleniata!prin creterea microorganismului n mediu cu adaos de seleniu anorganic. Alt brevet prezint un procedeu de obinere a biomasei de drojdie cu un coninut bogat de seleniu intracelular utinznd o tulpin de Candida utilis i Saccharomyces cerevisiae. Autorii descriu o metod de alimentare continu cu substanele nutritive i compui cu seleniu n timpul ciclului de cretere al drojdiei. Rezultate mai bune privind coninutul in seleniu al biomasei de drojdie s-au obinut prin cultivarea tulpinii de S. cereviziae, n sistem cu alimentare continu de mediu ce conine selenit de sodiu (NazS03) n concentraii crescnde mai mari de 128 ppm (g/ml), la un volum de 7 1 mediu /bioreactor apacitate 10l [[[31] , [32]]. Au fost publicate date privind izolarea i selecia unor tulpini de drojdie ce au capacitatea de a asimila seleniul. Astfel, autorii au izolat patru tulpini de Saccharomyces cerevisiae din mostre de drojdie de bere , banane, grapefruit i piersici fermentate [33] . Aceste tulpini au fost cultivate n medii ce conin selenit de sodiu, n diferite concentratii. A fost selectat tulpina izolat din mostra de drojdie de bere, ce a asimilat 126-171 g Se /g drojdie uscat n condiii de cultivare anaerobe. Capacitatea de asimilare a seleniului de ctre celulele de drojdie a fost cea mai bun, prin cultivarea acestora la temperatura de 30 -32 C, inoculare 10% i administrare de seleniu (N02SO3) dup 24 ore de cultivare. Au fost efectuate studii asupra efectului seleniului i al sulfului din mediu de cultur asupra asimilrii seleniului organic de ctre celulele de drojdie [34]. Astfel, autorii au artat c raportul ntre concentraia seleniului i sulfului, n mediu de cultur afecteaz puternic coninutul seleniului n biomasa de drojdie. Utiliznd un mediu de cultura cu un raport de concentraie Se /S de 1,216 /7,95 autorii au obinut biomas, ce conine >2000g Se/ g drojdie uscat. 7.5.2. Prelucrarea mediului de cultur Procedeul de obinere a biomasei de drojdie seleniat prezentat de unii autori arat, de asemenea, fazele procesului de prelucrare a mediului de cultur rezultat la sfritul perioadei de cultivare a microorganismelor. Astfel, cnd fermentaia este complet, se separ biomasa prin centrifugare (3500- 3900 rpm) timp de 10 minute apoi se inltur supernatantul. Celulele

de drojdie se spal de cteva ori cu ap distilat (in dilutie 1:10), pentru a ndeparta reziduurile metalice extracelulare neprocesate [35]. Unii autori au utilizat la splarea celulelor de drojdie (S. boulardi sequela PY31)- o solutie de EDTA (pH 7,8), soluie tampon fosfat de sodiu 0,01 M i ap distilat. Celulele de drojdie rezultate dup splare (yeast cream) se usuc n vacuum, pentru reducerea umiditii pn la aproximativ 4,5%. Alii indic o faz de pasteurizare a celulelor de drojdie rezultate dup splarea cu ap distilat la 85C timp de 45 minute, prin care se reduce umiditatea biomasei la 16- 18 % urmat de uscarea acesteia. Dup obinerea biomasei de drojdie seleniata se determin coninutul n seleniu din celule, utiliznd diferite metode de determinare [36]. Pentru obinerea biomasei de drojdie seleniat (ce conine seleniu), se izoleaz mai nti tulpinile de drojdie din diferite mostre de sol, fructe fermentate (banane , grapefruit, piersici), drojdie de bere. Dup purificarea culturilor se face identificarea acestora. Dintre tulpinile de drojdie utilizate la obinerea biomasei de drojdie seleniat fac parte: Saccharomyces cerevisiae, S.boulardi, S.bayanus, S. uvarum, Candida utilis i altele [37] . Pentru creterea microorganismelor n mediu de cultur cu adaos de seleniu (selenit sau selenat de sodiu) se efectueaz mai nti selectarea (screeningul), coloniilor cele mai viabile. Fiecare dintre coloniile selectate se cultiv n mediu cu extract de mal sau glucoz- agar i se selecteaz apoi coloniile, cele mai robuste. Coloniile selectate se cultiv, fiecare , pe 1-2 tuburi cu mediu solid la temperatura de 300C, timp de aproximativ 2 zile. Culturile obinute se utilizeaz la insmnarea mediului lichid de cretere a biomasei de drojdie. Se utilizeaz doua faze de cretere a biomasei n mediu lichid - prima const n cultivarea drojdiei la 30C timp de 8 -10 ore, urmat de nsmnarea acesteia n mediul de cultura i incubarea (aprox. 18 ore) la 30C. n prealabil se prepar soluia de selenit sau selenat de sodiu in ap distilat i se filtreaz. 7.5.3. Metode de determinare a seleniului din mediul de cultura i biomasa de drojdie seleniat n literatura de specialitate se cunosc numeroase metode calitative de detemninare a seleniului care se bazeaz fie pe reacii de precipitare fie pe reacii de culoare. Astfel cu AgNO3, BaCl2, Hg(N03)2 seleniul sub forma SeO2- formeaz precipitate albe, cristaline, solubile n acizi. Seleniul formeaz cu CuS04, un precipitat cristalin, verde albastrui.[38] Tioureea reduce Se032- din mediile slab acide, la soluii coloidale de seleniu, colorate n portocaliu. Acidul ascorbic (n medii slab acide) i glucoza (n medii bazice) reduc compuii cu seleniu la seleniu metalic, de culoare roie. 4-Metilen-l,2-fenil diamina conduce la o coloraie albastr-purpurie, stabil n H2S04 50%. Analiza cantitativ are la baz metode gravimetrice , volumetrice, spectrofotometrice de absorbie atomic. Seleniul poate fi determinat gravimetric dup reducerea cu Fe(II) n mediu de HCl concentrat. Precipitatul obinut se cntrete sau se dizolv i se determin seleniul prin absorbie aomic.[39] Metoda volumetric se bazeaz pe tritrarea acizilor selenioi cu tiosulfat de sodiu in exces, conform reactiei:

Na2Se03 + 4 Na2S203 +6 HCl Na2SeS4O6 + Na2S4C6+ 6 NaCl +3 H2O Se formeaz monoselenopentationat, iar excesul de tiosulfat de sodiu se titreaz iodometric. Clorhidratul de 3-3 diaminobenzidin, n mediu amoniacal i n prezenta de acid formic, conduce la compui galbeni, extractibili n toluen cu maxim de absorbie la =420 nm. Determinarea seleniului din drojdiile cu seleniu, se realizeaz cu un spectofotometru de absorbie atomica. Se face mai inti o digestie a biomasei cu HN03, timp de 4 ore, apoi coninutul de seleniu este determinat cu un spectofotometru de absorbie atomic la 196 nm, utiliznd o lamp de seleniu la 16mA.[40]

[1] Vlsutean, E., Food science and technologies, vol. IV, 190-194, (1998). [2] Carbon, C., Richard, A., Bons, B., Thrapie, 49, 325-331, (1994). [3] Bergone-Brzin, E., La presse mdicale, 145-156, (1995). [4] Bouhnik, Y., Marteau, Ph., Rambaud, J.C., Ann. Gastroenterol Hepatol., 29, 241-249, (1993). [5] Bergone-Brzin, E., La presse mdicale, 145-156, (1995). [6] Castex, F., Corthier, G., Jouvest, F., Elmer, W. G., Lucs, F., J. Gen. Microbiol., 47, 10851089, (1990). [7] Bergone-Brzin, E., La presse mdicale, 145-156, (1995). [8] McFarland, L.V., Sarawicz, C.M., Greenberg, R. N., Jama, 271, 1913-1918, (1994). [9] Surawicz, C. M., McFarland, V., Elmer, G., Chinn, M. D., Am. J. Gastroenterol, 18, 1285-1287, (1989). [10] Boddy, A.V., Elmer, G. W., McFarland, L. V., Levy, R. H., Pharmaceutical Res., 8, 796-800, (1991). [11] Berg, R., Bernoscomi, P., Fowler, D., Gautreaux, M., J. Infect. Dis., 168, 1314-1318, (1993). [12] McFarland, L. V., Surawicz, C. M., Greenberg, R. N., Elmer, G. M., Moyer, K. A., Bowen, K. E., Cocs, J. L., Am. J. Gastroenterol., 90, 439-448, (1995). [13] Buts, I., Corthier, G., Delme, M., J. of Pediatric Gastroenterol and Nat., 16, 419-425, (1996). [14] McFarland, L. V., Surawicz, C. M., Greenberg, R. N., Elmer, G. M., Moyer, K. A., Bowen, K. E., Cocs, J. L., Am. J. Gastroenterol., 90, 439-448, (1995). [15] Buts, I., Corthier, G., Delme, M., J. of Pediatric Gastroenterol and Nat., 16, 419-425, (1996).

[16] Spencer, I., Spencer, D., Yeasts Technology, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, (1994). [17] Piggott, J. R., Doel, S. M., Goodey, A. R., Watson, M. E. E., Carter, B. L. A., Hetrologous Protein Production from yeast in Yeast Technology, 365-373, (1994). [18] Walker, M. G., yeast Physiology and Biotechnology, Wiley I. And Sons, 264-319, (1998). [19] Clark, L. C., Combs, G. F., Turnbull, B. W., Jama, 276, 1957-1963, (1996). [20] Yoshida, M., Fukunaga, K., Tsuchita, H., Yasumoto, K., J. Nutr. Sci. Vitaminol., 45, 119-128, (1999). [21] Peretz, R., Neve, J., Desmedt, J., Am. J. Clin. Nutri., 53, 1323-1328, (1991). [22] Lai, K., Lu, R., Xu, D., Yiangyang Xuchao,14(1), 48-53, (1992), Conf C.A., 117(13), 130285S, (1992). [23] Yu, S. Y., Zhu, Y. J., Li, W. G., Bio Trace elem. Res., 56(1), 117-124, (1997). [24] Lu, J., Pei, H., Ip, C., Carcinogenesis, 17, 1903-1907, (1996).