MEDICINA MOLECULAR

ef de lucrri Dr. Lucian Negur

UMF Iai Disciplina Imunologie Departamentul Oncogenetic luciannegura@yahoo.fr

INTRODUCERE N

C1. Biologie molecular fundamental noiuni generale

1.1. Structura, funciile i sinteza acizilor nucleici 1.2. De la ADN la proteine: expresia genomului eucariot

C2. Tehnici de biologie molecular utilizate n diagnostic

2.1. Tehnici de detecie a variaiilor genice; PCR; secveniere ADN 2.2. Tehnici de cuantificare a acizilor nucleici: Real-Time PCR 3.1. Factorii de risc in cancer; rolul factorului ereditar

C3. Oncogenetic moleculara

C4?. Tehnici avansate n cercetarea biomedical i n diagnostic

4.1. Clonarea molecular aplicaii n terapia genic

3.2. Predispoziia ereditar la cancer: sindroame asociate

BIOLOGIE MOLECULAR Definiie ?

molecular biology
the study of biological phenomena at the molecular level molecular biology
1. The branch of biology that deals with the formation, structure, and function of macromolecules essential to life, such as nucleic acids and proteins, and especially with their role in cell replication and the transmission of genetic information. 2. The branch of biology that deals with the manipulation of DNA so that it can be sequenced or mutated. If mutated, the DNA is often inserted into the genome of an organism to study the biological effects of the mutation.

BIOLOGIE MOLECULAR
Noiuni generale
1. Structura, funciile i sinteza acizilor nucleici 2. De la ADN la proteine: expresia genomului eucariot

ADN Acidul dezoxiribonucleic ARN Acidul ribonucleic

ACIZI NUCLEICI - ISTORIC

Importana biomedical a acizilor nucleici: baza chimic a ereditii

Iniial s-a crezut c proteinele poart informaia genetic, pn la mijlocul secolului XX, cnd s-a descoperit c ADN-ul este baza ereditii, datorit faptului c este capabil de auto-replicare. 1865: Un clugr din secolul XIX pe nume Gregor Mendel a introdus pentru prima oar noiunea de gen: unitate de baz responsabil pentru deinerea i transmiterea a unei caracteristici unice. Prezentnd cercetrile sale asupra ereditii la mazre, el a pus bazele geneticii moderne. 1869: Friedrich Miescher a izolat nucleina din nucleul leucocitelor i a stabilit c aceasta era compus dintr-o fraciune acid (acizi nucleici!) i din una alcalin (care, ulterior, s-a dovedit a fi format din proteine!).

ACIZI NUCLEICI - ISTORIC

Importana biomedical a acizilor nucleici: baza chimic a ereditii 1900: Phoebus Levene studiaz acizii nucleici i izoleaz dou tipuri diferite, ce pot fi distinse prin glucidul ce intr n compoziia lor : Acidul dezoxiribonucleic (ADN) s-a dovedit ulterior a conine dezoxiriboz, iar acidul ribonucleic (ARN) s-a dovedit a conine riboz. Tot Levene a artat c unitile compozante ale acizilor nucleici (nucleotide) sunt compuse din baze azotate, pentoze i radicali fosforici. 1928: Fred Griffith a demonstrat c, atunci cnd unei colonii bacteriene nepatogenice i se adaug o colonie patogenic (responsabil de boal), colonia iniial nepatogenic devine patogenic. Acesta a devenit principiul transformrilor, cu participarea materialului ereditar. Exist deci posibilitatea de a transfera material ereditar de la o colonie la alta. 1944: Echipa format din Oswald Avery, Colin MacLeod et Maclyn McCarty descoper faptul c ADN este substana responsabil de transformrile (transferrile) descoperite mai devreme de Griffith.

ACIZI NUCLEICI - ISTORIC

Importana biomedical a acizilor nucleici: baza chimic a ereditii 1940: Erwin Chargaff descoper c, n orice eantion ADN, cantitatea de Adenin este ntotdeauna egal cantitii de Timin, iar cantitatea de Citozin este ntotdeauna echivalent cantitii de Guanin (baze azotate!). Acest raport este cunoscut i n ziua de astzi ca Raportul Chargaff: A=T. C=G). Este probabil principiul cluzitor ce a permis clarificarea structurii intime a ADN. 1950; Rosalind Franklin: O importan decisiv n cercetrile viznd determinarea structurii ADN. Lucrnd prin difracie cu raze X, R. Franklin a demonstrat structura helicoidal a moleculei de ADN. Contribuia sa nu a fost recunoscut la atribuirea premiului Nobel pentru identificarea structurii ADN. Exist, probabil, dou cauze majore: Atitudinea negativ fa de femei n tiina anilor 50 Rosalind Franklin a murit de cancer la vrsta de 38 de ani. n schimb, la 25 aprilie1953

La 25 aprilie1953, Crick i Watson descoper structura ADN

Erwin Chargaff Rosalind Franklin

Premiul Nobel pentru Medecin n 1962 F. Crick, J. Watson et M. Wilkins

ACIZI NUCLEICI
Acizii nucleici sunt substane macromoleculare polimerice, alctuite din uniti structurale (monomeri) care se repet Acizii nucleici sunt, prin urmare,

polinucleotide.

nucleotide

Nucleotidele reprezint unitatea monomeric a acizilor nucleici i sunt compuse din: o baz azotat heterociclic: - purine: adenin (A) i guanin (G) - pirimidine: citozin (C) i timin (T) (ADN) citozin (C) i uracil (U) (ARN) o pentoz: - dezoxiriboza (este prezent n ADN) - riboza (este prezent n ARN) un fosfat (radical fosforic)

ACIZI NUCLEICI
Bazele azotate purinice (A, G) sau pirimidinice (C, T, U)

(R)

(Y)

(Doar n ARN !)

ACIZI NUCLEICI
Bazele azotate numerotarea atomilor

Atomii heterociclului pirimidinic sunt numerotai de la 1 la 6 (astfel ncat atomii de N din ciclu s primeasc indicele minim). Atomii heterociclului purinic sunt numerotai de la 1 la 9 (astfel ncat atomii de N din ciclu s primeasc indicele minim).

ACIZI NUCLEICI
Bazele azotate purinice numerotarea atomilor

PURINA

ADENINA (6-amino purina)

GUANINA (2-amino purin-6-ona)

ACIZI NUCLEICI
Bazele azotate pirimidinice numerotarea atomilor

PIRIMIDINA

CITOZINA (4-amino pirimid-2-ona)

TIMINA (5-metil pirimid-2,4-diona)

URACIL (pirimid-2,4-diona) (Doar n ARN !)

ACIZI NUCLEICI
Bazele azotate TAUTOMERIA Tautomeria este capacitatea unor substane de a se afla n forme diferite (izomeri de poziie) datorit legturilor chimice conjugate pe care le conin. NH
NH2 NH2 C N N C NH

NH

forma amino

forma imino

Citozina

C HN O N

C OH

forma lactam

forma lactim

Formele mai stabile: Forma lactam este mai stabil dect forma lactim Forma amino este mai stabil dect forma imino n acizii nucleici exist formele lactam i amino.

ACIZI NUCLEICI
Zaharul (pentoza) Riboza (n ARN) sau Dezoxiriboza (n ADN)

ACIZI NUCLEICI
Zaharul (pentoza) numerotarea atomilor

Riboza
5

Dezoxiriboza
HO CH2
4 3 5

HO

CH2
4 3

OH O
1 2

OH O
2 1 lipsete 2-OH

OH OH

OH

Atomii de carbon ai pentozelor sunt numerotai de la 1 la 5. Pentoza din ADN este dezoxiriboza, cruia i lipsete gruparea hidroxil 2-OH. Pentoza din ARN este riboza.

ACIZI NUCLEICI
Zaharul (pentoza) forma spaial (pliat) Conformatiile plic ale ribozei sunt esentiale in acizii nucleici, determinnd orientarea relativ a substituienilor fosfat la fiecare rest de riboz. n B-ADN, conformatia este C2-endo, pe cand in A-ADN conformaia este C3-endo. n schimb, n Z-ADN nucleotidele purinice au toate conformaia 3-endo, iar nucleotidele pirimidice au toate conformaia 2-endo.

ACIZI NUCLEICI
NUCLEOZIDELE = Baza azotat + zahar Nucleozidele sunt derivai ai bazelor azotate care au o pentoz legat de un atom de azot din heterociclu (N9 pentru purine / N1 pentru pirimidine), printr-o legtur -N-glicozidic.

ACIZI NUCLEICI
NUCLEOTIDELE = Baza azotat + zahar + fosfat

Generarea Nucleotidelor Pirimidinice (ex. Adenina)

Generarea Nucleotidelor Purinice (ex. Citozina)

ACIZI NUCLEICI
NUCLEOTIDELE = Baza azotat + zahar + fosfat = Nucleozide + fosfat

Nucleotidele sunt compose din nucleozide (baz + pentoz) i 1, 2, sau 3 grupri fosfat (se formeaz o legtur esteric ntre fosfat i 5-OH). Mononucleotide (nucleozid-monofosfat)= nucleozid + 1 fosfat Nucleozid-difosfat = nucleozid + 2 fosfat Nucleozid-trifosfat = nucleozid + 3 fosfat

ACIZI NUCLEICI
Terminologie Ribonucleozide/Ribonucleotide (cnd pentoza = riboz)
Baza Adenina (A) Nucleozidul Adenozina (A) Nucleotidul Adenozin monofosfat (AMP) Adenozin difosfat (ADP) Adenozin trifosfat (ATP) Guanozin monofosfat (GMP) Guanozin difosfat (GDP) Guanozin trifosfat (GTP) Citidin monofosfat (CMP) Citidin difosfat (CDP) Citidin trifosfat (CTP) Uridin monofosfat (UMP) Uridin difosfat (UDP) Uridin trifosfat (UTP) Timidin monofosfat (TMP) Timidin difosfat (TDP) Timidin trifosfat (TTP)

Guanina (G)

Guanozina (G)

Citozina (C)

Citidina (C)

Uracil (U)

Uridina (U)

Timina (T)

Timidina (T)

ACIZI NUCLEICI
Terminologie Dezoxiribo-nucleozide/nucleotide (cnd pentoza = dezoxiriboz)
Baza Adenina (A) Nucleozidul Dezoxiadenozina (A) Nucleotidul Dezoxiadenozin monofosfat (dAMP) Dezoxiadenozin difosfat (dADP) Dezoxiadenozin trifosfat (dATP) Dezoxiguanozin monofosfat (dGMP) Dezoxiguanozin difosfat (dGDP) Dezoxiguanozin trifosfat (dGTP) Dezoxicitidin monofosfat (dCMP) Dezoxicitidin difosfat (dCDP) Dezoxicitidin trifosfat (dCTP) Dezoxiuridin monofosfat (dUMP) Dezoxiuridin difosfat (dUDP) Dezoxiuridin trifosfat (dUTP) Dezoxitimidin monofosfat (dTMP) Dezoxitimidin difosfat (dTDP) Dezoxitimidin trifosfat (dTTP)

Guanina (G)

Dezoxiguanozina (G)

Citozina (C)

Dezoxicitidina (C)

Uracil (U)

Dezoxiuridina (U)

Timina (T)

Dezoxitimidina (T)

ACIZI NUCLEICI
NUCLEOZIDELE : Orientarea bazei azotate

Flexibilitatea conformational a ADN-ului este limitat

Conformaia unei uniti de nucleozid/nucleotid indic prezena a 6 unghiuri de torsiune pentru partea de fosfo-zahar i un unghi de torsiune atribuit legturii glicozidice. Rotaia n jurul legturii glicozidice este mpiedicat. Rezidurile purinice au dou conformaii, sin si anti, ultima dintre acestea fiind mai stabil. n marea majoritate a acizilor nucleici, toate bazele adopta conformaia anti.

ACIZI NUCLEICI
Funciile fiziologice ale nucleotidelor

Crmizi pentru sinteza acizilor nucleici

Compui macroergici care furnizeaz energia necesar diferitelor procese biologice (ex. ATP, GTP)

Reglatori alosterici ai diferitelor enzime (ex.ADP e activator alosteric al ICDH din ciclul Krebs) Donori de grupe metil (ex.S-adenozilmetionina) Mesageri intracelulari ai hormonilor hidrofili (ex. AMPc, GMPc)
NH2 N N
O CH2

Nucleotide naturale libere : exemplu 3,5adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) este mesager secund imlicat n transmiterea mesajului hormonal din mediul extracelular n interiorul celulei.

Adenine

N N

Ribose
OH

O P O

AMPc

ACIZI NUCLEICI
STRUCTURA ADN 1. structura primar (secvena !) 2. structura secundar (dublu helix) 3. structura teriar (cromozomi)

ACIZI NUCLEICI
STRUCTURA PRIMAR A ADN
Nucleotidele se leag ntre ele prin intermediul radicalului fosforic formnd catene ADN este n structur primar o structur monocatenar rezultat n urma polimerizrii nucleotidelor; Caracteristica unei structuri primare este dat de ordinea nucleotidelor. Ordinea 5-3 a nucleotidelor n catena ADN reprezint secvena moleculei ADN ADN este un polidezoxiribonucleotid n care gruparea 3OH a unui dezoxiriobonucleotid este legat la gruparea 5OH a dezoxiriobonucleotidului vecin printr-o legtur fosfat diesteric. Lanul polinucleotidic este polar:prezint dou capete distincte. Captul 3este cel cu gruparea 3-OH liber. Captul 5este cel cu gruparea 5-OH liber sau fosforilat. Lanul polinucleotidic al ADN este ncrcat negativ la pH-ul fiziologic.

ACIZI NUCLEICI
STRUCTURA PRIMAR A ADN

Nucleotid Polinucleotid Nucleotidele se leag ntre ele prin intermediul radicalului fosforic formnd catene. ADN este o structur monocatenar rezultat n urma polimerizrii nucleotidelor; Caracteristica unei structuri primare este dat de ordinea nucleotidelor.

ACIZI NUCLEICI
STRUCTURA PRIMAR A ADN

ADN este un polidezoxiribonucleotid n care gruparea 3OH a unui dezoxiriobonucleotid este legat la gruparea 5OH a dezoxiriobonucleotidului vecin printr-o legtur fosfat diesteric. Lanul polinucleotidic este polar:prezint dou capete distincte. Captul 3este cel cu gruparea 3-OH liber. Captul 5este cel cu gruparea 5-OH liber sau fosforilat.

ACIZI NUCLEICI
STRUCTURA PRIMAR A
1
O HN H2N
5' end HO

Guanine
N N

N
CH2

5
NH2 N

Cytosine
O

ADN

N
CH2 O

3linkage

O P O O

5linkage

3
O H3C

O P O

ADN este un polidezoxiribonucleotid n care gruparea 3OH a unui dezoxiriobonucleotid este legat la gruparea 5OH a dezoxiriobonucleotidului vecin printr-o legtur fosfat diesteric.

Thymine
NH

NH

O P O O

CH2

OH 3' end

ACIZI NUCLEICI
O HN H2N
5' end HO

Guanine
N N

Reprezentare simplificat a lanului ADN Pentoza: linie orizontal OH 5 P 5

P
O H3C

N
CH2

NH2 N

Cytosine
O

Baza: litera corespondent Leg. fosfodiesteric: linie oblic i P la mijloc

3 G

O O P O O
CH2

N
O

3 C
3

O P O O

Thymine
NH

NH

O P O O

CH2

5 OH

OH 3' end

ACIZI NUCLEICI
O HN H2N
5' end HO

Guanine
N N

N
CH2

Reprezentarea simplificat a catenei de ADN

Cytosine
O N

NH2

N
CH2 O

O P O O

O P O O
H3C O

Prin convenie o caten de ADN se scrie n direcia 5- 3.

Thymine
NH

NH

O P O

CH2

ex. GCT nseamn 5GCT 3

O
OH 3' end

ACIZI NUCLEICI
STRUCTURA SECUNDAR A ADN
Dublu helixul ADN
Watson i Crick au decoperit c structura secundar a ADN este un dublu helix format din dou catene de ADN asociate prin mperecherea bazelor. Inelele glucidice legate prin resturi fosfat constituie scheletul extern al dublu helixului, n timp ce bazele azotate hidrofobe sunt orientate spre interior i perpendicular pe axa helixului. ADN-ul uman conine aproximativ 3,5 x 109 perechi de baze.

ACIZI NUCLEICI
Dublul helix al ADN ( structura secundar)
1. Stabilitatea ADNdc este asigurat de: - interaciunile hidrofobe dintre bazele azotate suprapuse (stivuite) de pe aceeai caten - legturile de hidrogen ce se stabilesc ntre bazele azotate de pe o caten i cele complementare de pe cealalt caten. 2. Cele dou catene de ADN sunt antiparalele.

ACIZI NUCLEICI
ADN, perechi de baze azotate: A=T, CG
H O T N O H H H N N A N N N R R N N N N G O N H H H N N O C N R H

N R

ACIZI NUCLEICI
Dublul helix al ADN ( structura secundar)

3.

G-C are 3 legturi de H. A-T are 2 legturi de H.

4. Cele dou catene sunt complementare (G complementar cu C, A complementar cu T). 4. Regula lui Chargaff Nr. A = Nr. T Nr. G = Nr. C

ADN, dou catene antiparalele

5 A
O -O -O -O P O O O P O O O O -O O P O O O -O O P O O N H N N O N N N O N H H N N N H N N O N
O O N N H N N N O O OO O OO O

N H N H

O N O N
O OH

OO

N H H
O H H H N N

O N N O H

N N

O O

T 3
HO

O O

OO-

ACIZI NUCLEICI
ADN, dublu helix

ACIZI NUCLEICI
Dublul helix al ADN ( structura secundar)
6. Exist mai multe confomaii ale ADN; Conformaia B (clasic): descris de Watson i Crick are orientare dreapt, pasul dublu helixului este 34 (3,4nm), diametrul de 2nm, iar nr. perechi baze per tur este 10; cea mai rspndit. Conformaia A: dublu helix de dreapta dar mai compact, pasul elicei este de 2,8nm, nr. perechi baze per tur este 11. ntlnit n cazul unor concentraii saline mari i n cazul unor deshidratri pariale. Prezent la hibrizii ADN/ARN i n structurile secundare (regiuni bicatenare) ale ARN. Conformaia Z: dublu helix de stinga, pasul elicei 4,56nm i nr. perechi baze per tur este 12. Este singurul tip cu rsucire spre stnga, i este ntlnit doar in vitro.

ACIZI NUCLEICI
Care este lungimea total a ADN-ului unei celule ?
Lungimea unei nucleotide: 0.34 10-9 m n 46 de cromozomi ai unei celule, exist peste 3 miliarde de nucleotide.

Rspuns: 3 pn la 5 metri

Care este lungimea total a ADN-ului uman ?

Lungimea unei nucleotide: 0.34 10-9 m Numr de nucleotide ntr-o celul : 6 x 109 Lungimea unei nucleotide: 0.34 10-9 m Numr de celule n corpul uman : 1013

Rspuns: 2 x 1013 metri !!!!!

ACIZI NUCLEICI

2 x 1013 metri = echivalentul a 70 cltorii dus-ntors Pmnt-Soare

ACIZI NUCLEICI
Cum ncape ADN-ul unei celule (3-5 metri) ntr-o celul (diametru max 100 m = 10-4 m) ?
Rspuns: dublul helix ADN (structura secundar) se organizeaz n structuri teriare. Moleculele de ADN formeaz lungi fibrile numite cromatin. Un cromozom este un astfel de filament de cromatin, nfurat de mai multe ori n jurul unor proteine denumite histone.

ACIZI NUCLEICI
STRUCTURA TERTIAR A ADN: polinucleozomul Lungimea unei molecule de ADN: 3-5 metri Nu ncape n nucleu! (aprox. 50 nm = 50 x 10-9 m) La nceputul fiecrei mitoze sau meioze, fiecare molecul de ADN (n dublu exemplar!) se condenseaz n cromozomi, msurnd aproximativ 5 m, ceea ce este de 10000 de ori mai mic ! Exist 5 nivele de condensare (compactera a ADN-ului, pentru a asigura a ceast reducere de talie.

ACIZI NUCLEICI
Nivelele de compactare a ADN n nucleu
-Primul nivel-

Dublul helix de ADN se nfoar n jurul unui octamer proteic format din histone- fiecare unitate de ADN spiralat de 1,75 ori n jurul unui compelx histonic se numete nucleozom. Histonele sunt proteine bazice cu mas molecular mic (max. 20.000), bogate n aa bazici (Arg pt.H2A, H2B i, Lys pt H3, H4).

ACIZI NUCLEICI
Nivelele de compactare a ADN n nucleu
-Primul nivel-

n jurul octamerului histonic (H2A H2B H3 H4)x2 este spiralat ADN-ul nucleozomic fomat din 140 perechi de baze. Nucleozomii sunt legai ntre ei prin ADN internucleozomic sau ADN linker format din 30 perechi de baze). Histona H1 itercaioneaz cu ADN linker, avnd rol n superspiralizarea nucleozomilor. Polinucleozomul seamn cu nite mrgele pe a (=fibrile de cromatin de 10nm ).

ACIZI NUCLEICI
Nivelele de compactare a ADN n nucleu
-Al doilea nivelPolinucleozomul se superspiraleaz pentru a forma structura de solenoid. Solenoidul conine 6-7 nucleozomi per tur. Pasul e de 10nm, diametrul de 30 nm. Solenoidul formeaz fibrele de cromatin de 30 nm.

ACIZI NUCLEICI
Nivelele de compactare a ADN n nucleu
-Nivelele 3, 4 i 5- Fibrele de cromatin se compacteaz i mai mult form domenii n form de bucl. - Aceste domenii n bucl sunt superspiralizate i organizate n structuri distincte numite cromozomi. - ADN -ul uman nuclear ( genomul) const n 23 perechi de cromozomi. Majoritatea celulelor eucariote conin perechi de cromozomi i sunt astfel denumite diploide. Celulele care conin cromozomi nepereche sunt denumite haploide.

Cromozomii genomului uman

ACIZI NUCLEICI

ACIZI NUCLEICI
Denaturarea ADN

DNA#1
Hyperchromicit

DNA#2

CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

ACIZI NUCLEICI
Denaturarea ADN

ACIZI NUCLEICI

ARN (acidul ribonucleic)

Trei diferene:
1. Zahr: Riboza nlocuiete dezoxiriboza 2. Uracilul nlocuiete Timina 3. ARN este monocatenar
Trei tipuri de ARN: ARN-m ARN-r ARN-t

ACIZI NUCLEICI
ARN (acidul ribonucleic)

ARN (acidul ribonucleic)

ARN poliribonucleotid monocatenar Lungimea ARN: 10-10000 nucleotide (ADN: miliarde !) n celule se gsesc diferite tipuri de ARN. Proporia lor este diferit: o mare cantitate este reprezentat de ARNr (80-90% din ARN-ul celular), ARNt n proporie de 10-15% i doar o cantitate mic de ARNm (mai puin de 5%).

ACIZI NUCLEICI

ACIZI NUCLEICI

ARN (acidul ribonucleic)

ARN Absena gruprii metil (-CH3) din molecula de uracil nu mpiedic complementaritatea (punile hidrogen) cu Adenina

Doar legturi convenionale

Legturi neconvenionale

ACIZI NUCLEICI
ARN (acidul ribonucleic)
ARN-ul mesager este ARN-ul ce va servi ca tipar pentru sinteza proteinelor. Complexul enzimatic ARN polimeraz sintetizeaz iniial un ARN mesager precursor ce conine secvenele corespunztoare exonilor i intronilor genei. Prin procesul ulterior de maturare ARN-ul premesager este modificat pentru a duce la formarea ARN-ului mesager matur ARN-ul ribozomal este un constituient principal al ribozomilor, structuri celulare la nivelul crora se realizeaz sinteza proteinelor. ARN-ul ribozomal este sintetizat prin transcripia genelor corespunztoare situate n anumite regiuni ale cromozomilor numite organizatori nucleolari. ARN-ul de transport (notat ARNt) este un ARN scurt, de 75-100 nucleotide, cu o structur teriar n trefl (cu patru regiuni scurte dublu catenare i trei bucle) ce fixeaz un anumit aminoacid si care are o regiune specific de trei nucleotide numit anticodon. Acest ARN fixeaz un aminoacid pe care l transport i n poziioneaz n dreptul unui codon (prin complementaritatea codon (de pe molecula de ARNm) anticodon (de pe molecula de ARNt) n cursul procesului de translaie.

ACIZI NUCLEICI

ARN (acidul ribonucleic)

BIOLOGIE MOLECULAR
Noiuni generale
1. Structura, funciile i sinteza acizilor nucleici 2. De la ADN la proteine: expresia genomului eucariot

FUNCIILE ADN - Replicarea - Sinteza proteinelor

Dogma Central a geneticii moleculare

Replicare
ADN

Acid dezoxiribonucleic

Propus de ctre Francis Crick n 1958 pentru a descrie fluxul informaiei genetice n celul. Informaia depozitat n ADN este transferat ARN-ului, care mai departe o transfer proteinelor. Dogma Central propus de Crick a suferit numeroase revizii n ultimii 47 de ani.

Transcripie

ARN

Acid ribonucleic

Translaie

Protein

Dogma Central a geneticii moleculare

TRANSCRIPIE

AAA

tRNA

TRANSLAIE ADN mRNA PROTEIN

REPLICARE

Dogma Central a geneticii moleculare

ADN
Transcriere

ARN

proteine
Traducere

Transcrierea / Transcripia = transferul informaiei genetice de la ADN la ARN (sintez de ARN pe matri de ADN) Traducerea / Translaia = transferul informaiei genetice de la ARN la proteinele functionale, a cror secven de aminoacizi este codificat n structura ADN-ului. Replicarea = transferul informaiei genetice de la celula mam la celulele-fiice prin copierea ADN-ului parental cu formarea a dou molecule de ADN cu structur identic ADN-ului parental

Dogma Central a geneticii moleculare

Recombinarea= rearanjarea materialului genetic
Recombination Mutation/Repair

Mutaii/Reparare = lezarea ADN cu alterarea informaiei genetice/ corectarea leziunilor ADN Revers- transcrierea = transferul informaiei genetice de la ARN la ADN

REPLICAREA ADN
DENATURAREA ADN

G+C-rich

A+T-rich

REPLICAREA ADN
REALIZAREA LEGTURII FOSFODIESTER

1. MATRICE 2. 3-OH liber

http://www.mbi.ufl.edu/facilities/msg/bch4024m/lecture45.pdf

REPLICAREA ADN
REPLICAREA = Dublarea ntregii cantiti de ADN, naintea diviziunii celulare, n scopul transmiterii fidele a informaiei genetice (materialului genetic) din generaie n generaie. Monomerul replicrii : Nucleotidul (nucleozid trifosfatul) Nucleozid trifosfatul este activ din punct de vedere chimic, datorit sarcinilor negative ale celor 3 grupri fosfat. Prin legarea la catena ADN n formare, nucleotidul pierde dou grupri fosfat (pirofosfat). Hidroliza pirofosfatului n dou molecule de fosfat anorganic genereaz energia necesar legrii nucleotidului la catena ADN n formare. Nucleozid tri-P

Pirofosfat Fosfat anorganic

P P P i

REPLICAREA ADN
Replicarea ADN precede diviziunea celulara

1.

Fiecare molecul de ADN dublu catenar se deruleaz i se separ n dou catene independente (se rup punile de hidrogen intercatenare A=T i CG), care vor servi ca matrice pentru sinteza a dou catene noi de ADN (se refac puni de hidrogen intercatenare A=T i CG, ntre o caten veche i una nou format). Astfel din 2 catene ADN obinem 4 catene. Fiecare molecul-fiic va conine o caten din molecula-mam i o caten nou sintetizat. Moleculele de ADN nou formate se nfoar la rndul lor n dublu helix . Din acest motiv, replicarea este semiconservativ.

REPLICAREA ADN

2. Nucleozidele trifosfat (nucleotidele), deja sintetizate i prezente n nucleu, se apropie de extremitile 3 ale catenelor de ADN n formare. Nucleotidele vor fi incorporate n noua caten prin fomare de legturi: - fosfodiester, cu ultimul nucleotid 3 de pe aceeai caten - de hidrogen (A=T i CG), prin complementaritate cu nucleotidele de pe cealalt caten (matrice).

3. Enzima (complex enzimatic) resposabil de biosinteza ADN este o ADN polimeraz ADN-dependent. Aceasta elibereaz pirofosfatul fiecrui nucleotid nou adugat, utiliznd energia rezultat pentru polimerizarea nucleotidelor ntre ele prin formare de legturi fosfodiester. Punile de hidrogen intercatenare se formeaz spontan (necatalitic), prin complementaritate. 4. Polimerizarea (extinderea catenelor nou formate) se realizeaz ntotdeauna n sensul 5 ctre 3. Enzima se va deplasa deci, pe fiecare caten veche (matrice), n sensul 3 ctre 5, iar catenele noi se vor extinde 5 ctre 3. Complementaritatea i antiparalelismul se respect i pentru moleculele nou formate. 5. Datorit faptului c un singur complex de polimerizare lucreaz simultan pe ambele catene matrice, i c acestea sunt antiparalele, pe una din catene sinteza va fi continu, iar pe cealalt discontinu.

REPLICAREA ADN

REPLICAREA ADN

Caten nou

Caten matrice

Legtur fosfodiester Carbon 3 al ribozei ADN polimeraz

Nucleozid tri-P

REPLICAREA ADN
Caten nou Caten matrice

Caten nou

Caten matrice

Formarea legturii fosfodiester

1. MATRICE 2. 3-OH liber

REPLICAREA ADN
Replicarea la bacterii Genom bacterian = un singur cromozom circular, aproximativ 4,6 milioane de perechi de nucleotide. ADN polimeraza recunoate o secven particular de ADN (originea replicrii), se fixeaz i separ cele dou catene, formnd astfel un ochi de replicare. Replicarea este continu, pn la copierea ntregului cromozom. Viteza: 500 nucleotide / secund. Mai puin de o or pentru replicarea ntregului cromozom.

Originea replicrii

Ochiul replicrii

Sfritul replicrii

REPLICAREA ADN
Replicarea la eucariote (om) Genom uman = 46 cromozomi lineari, aproximativ 3 miliarde de perechi de nucleotide. Sute, chiar mii de ochi de replicare se deschid pe fiecare cromozom. Replicarea se produce la extremitile fiecrui ochi (furci de replicare), pn cnd toat molecula este copiat, iar ochii de replicare se unesc. Viteza: 50 nucleotide / secund. Cteva ore pentru replicarea ntregului genom. Ochi de replicare Furci de replicare

Ochi

Elongarea unei noi catene la nivelul furcii de replicare (FR) este antiparalel Catena directoare sau continu (leading strand) Pe msur ce furca de replicare se deschide (la fel ca la un fermoar), nucleozidele se adaug unele dup altele, 5 ctre 3. Extremitatea 3-OH a acestei catene este ntotdeauna disponibil, catena avansnd ctre furca de replicare.

REPLICAREA ADN
5 5
OH

Catena discontinu (lagging strand) Nucleozidele se adaug unele dup altele, 5 ctre 3, catena avansnd n sens opus furcii de replicare. Din acest motiv, de fiecare dat cnd furca de replicare se deschide cte puin, va fi sintetizat un mic fragment de ADN (Fragment Okazaki) La bacterii: 1000-2000 nts La om: 100-200 nts

3
OH

REPLICAREA ADN
5 cresterea catenei ADN 3

3 directia de deplasare a furcii de replicare

cresterea catenei ADN

REPLICAREA ADN
Limitarea este impusa de sinteza ADN, strict in directia 5 spre 3 Cele doua catene ADN sunt utilizate diferit la nivelul furcii de replicare catena conducatoare (leading strand) este sintetizata continuu catena intarziata (lagging strand) este sintetizata de o maniera discontinua sunt sintetizate fragmente Okazaky fragmentele sunt cuplate intre ele cu ajutorul ADN ligazei

3 5 3 5 3 5 3

leading

lagging

REPLICAREA ADN

REPLICAREA ADN
Helicazele deruleaz ADN (1) Proteine stabilizeaz cele dou catene separate (2)

3 5

Amorsele extremitilor nu pot fi nlocuite, deoarece ADN Polimeraza I nu gsete o extremitate ADN 3 de care s se agae pentru a degrada amorsa. La fiecare replicare, ADNul se scurteaz !!!. (8)

O amors (primer) ARN este produs la nceputul fiecrei catene nou sintetizate (3)

ADN Polimeraza III prelungete catena (5)

ADN Ligaza sudeaz fragmentele rezultate (7)

3
ADN Polimeraza I nlocuiete amorsele ARN cu ADN (6)

Amorsa este produs de ARN Primaza (4)

REPLICAREA ADN

REPLICAREA ADN

n timpul replicrii apar numeroase erori la nivelul incorporrii de nucleotide n catenele noi (aprox. 1 / 105 nucleotide). ADN Polimeraza III posed o activitate de verificare/reparare (proofreading) a erorilor, majoritatea acestora fiind corectate (atenie! ntotdeauna varianta corect este varianta de pe catena matrice). Erorile nereparate de ADN Polimeraza III vor fi identificate i reparate de sistemele proteice celulare de reparare ADN (cam 100 la bacterii puin performat, peste 130 la om foarte performant) n medie, la fiecare replicare rmn 1 / 108 nucleotide erori nereparate. Acestea reprezint motorul evoluiei speciilor.
Mismatch (necomplementaritate)

REPLICAREA ADN

Enzim de reparare

ADN Polimeraza III ADN Ligaza

TELOMERII sunt prelungiri de rezerv la capetele cromozomilor (repetiii ale secvenei TTAGGG, la om). Dei exist sute/mii de astfel de repetiii, telomerii se erodeaz la fiecare replicare /diviziune celular. Cu trecerea anilor, prin erodarea telomerilor ne apropiem de regiuni importante, genice. mbtrnim. Atunci cnd telomerii devin prea scuri, i nainte ca genele s fie afectate, celulele i nceteaz diviziunile i intr n senescen. Interesant este povestea lui Dolly.

REPLICAREA ADN
Telomer Poriune util Telomer Amors ARN

Amors nenlocuit

EXPRESIA GENELOR
Genele (ADN) dicteaz caracteristicile fizice ale individului prin intermediul proteinelor. Gen = unitate din molecula de ADN (succesiune de nucleotide) care codific informaia pentru sinteza unei proteine (uniti funcionale ARN) Informaia genetic este codificat : CODUL GENETIC Transcripia : Sinteza ARN pornind de la ADN (enzima responsabil: ARN polimeraz ADN-dependent Translaia : traducerea informaiei ARN n protein (succesiunea de nucleotide devine succesiune de aminoacizi. Ordinea succesiunii aminoacizilor n molecula proteic (secvena proteinei) este dictat de ordinea succesiunii nucleotidelor n molecula ARN (secvena ADN). Modificarea secvenei ADN = Modificarea proteinei ??? Proteinele reprezint legtura dintre GENOTIP (gene) i FENOTIP (caractere aparente). Suntem reflecia proteinelor noastre, iar proteinele noastre sunt codificate n genele noastre.

EXPRESIA GENELOR

Genomul uman
Genom uman 3000 Mb

< 3%
Gene i alte secvene nrudite 900 Mb ADN codant 90 Mb ADN non-codant 810 Mb

ADN extra-genic 2100 Mb

ADN repetitiv 420 Mb

ADN n copie unic / numr mic de copii 1680 Mb Repetiii intercalate ( interspersed )

Pseudogene

Fragmente de gene

Introni, etc

Repetiii n tandem ADN microsatelit

ADN satelit ADN minisatelit

Elemente LTR Elemente LINE

Elemente SINE Transpozoni

EXPRESIA GENELOR

Genomul uman

Bacterii : 500 gene Om : 30000 gene

83

ACIZI NUCLEICI
Ordinea 5-3 a nucleotidelor n catena ADN reprezint secvena moleculei ADN Structura unei gene este asemntoare unei cri...

Regiunea 5 Prefaa promotor 5UTR Exon1 Intron 1 ATG Exon2

codant

Sfrit 3UTR

enhancer silencer

Intron 2

codant

Exon3

START Critic Sfatul unui prieten Capitol1

Fraze (exoni) Punctuaie(introni)

EXPRESIA GENELOR
Sinteza proteinelor : Proces care const n polimerizarea aminoacizilor, n celule sau in vitro. Intr-o celul pot exista circa 10000 proteine care au rol esenial n funcionarea i reproducerea celulei i organismului. Biosinteza proteinelor se desfoar n urmtoarele momente. 1. n primul moment are loc transcripia, care const n sinteza mARN de ctre una dintre catenele de ADN dintr-o gen. 2. n al doilea momont are loc migrarea mARN n citoplasm i asocierea mARN cu ribozomii activi n sinteza proteic 3. n al treilea moment are loc activarea aminoacizilor 4. n al patrulea moment are loc translaia, polimerizarea sau asamblarea aminoacizilor.

EXPRESIA GENELOR
Transcripia Sinteza de ARN pornind de la ADN. (se trece, prin complementaritate, din limbajul nucleotidelor ADN n limbajul nucleotidelor ARN). Se pot sintetiza molecule de ARN mesager (ARNm), ARN de transfer (ARNt), ARN ribozomal (ARNr), etc Gen = unitate din molecula de ADN (succesiune de nucleotide) care codific informaia pentru sinteza unei proteine (uniti funcionale ARN) Traducerea Sinteza unui polipeptid (protein), pornind de la un ARNm. Se trece, prin codul genetic, de la limbajul nucleotidelor ARN la limbajul aminoacizilor n protein.

EXPRESIA GENELOR
Gradul transcripiei fiecrei gene determin proporia de proteine ntr-o celul. Reglajul transcripiei determin metabolismul celular.

EXPRESIA GENELOR
Bacterii (celule procariote) Transcripia i translaia sunt cuplate, producndu-se aproape simultan, n compartimentul din zona nucleoidului. Transcripia produce o molecul de ARNm matur, tradus imediat n protein, la nivelul ribozomilor din zona nucleoidului. ntreg procesul este extrem de rapid. Om (celule eucariote) Transcripia i translaia sunt decalate i separate n compartimente celulare diferite: Transcripia are loc n nucleu, n timp ce traducerea are loc n citoplasm. Transcripia produce iniial o molecul de ARNm imatur (transcript primar sau ARN pre-mesager), care va trebui s suporte anumite transformri (maturare) pentru a deveni ARN mesager matur. ARNm este responsabil de transportul informaiei din nucleu, acolo unde este sintetizat, pn la nivelul ribozomilor din citoplasm, acolo unde se va sintetiza proteina. ntreg procesul este mult mai lent.

Bacterii (celule procariote)

EXPRESIA GENELOR
ADN

Om (celule eucariote)

Transcripie Traducere ARNm

Nucleu

ADN ARNpm

Transcripie Maturare

Caten polipeptidic

Ribozom

Traducere
Citoplasm

ARNm

Ribozom Caten polipeptidic

Bacterii (celule procariote)

EXPRESIA GENELOR

Om (celule eucariote)

ADN (pe cale de a fi transcris n molecule ARNm, de ctre mai multe polimeraze) ARN polimeraze ADN

EXPRESIA GENELOR

Ribozomi ARNm (pe cale de a fi tradus n catene polipeptidice, de ctre mai muli ribozomi)
La bacterii (celule procariote), transcripia i translaia sunt cuplate

EXPRESIA GENELOR
Transcripia : analogii cu replicarea Denaturarea celor dou catene din molecula ADN Derularea unei mici poriuni din molecula ADN Utilizarea uneia din cele dou catene ADN ca matrice Incorporarea de nucleotide prin complementaritate Nucleotidele nou incorporate sunt unite prin legturi fosfodiester Secvena catenei nou sintetizate este complementar celei matrice. Polimerizarea are loc 5 ctre 3 Transcripia : diferene fa de replicare Molecula de ARN nou sintetizat nu rmne legat de catena ADN matrice Helixul ADN se reformeaz dup trecerea polimerazei, ntre catenele ADN. Moleculele ARN formate conin maxim cteva mii de nucleotide.

EXPRESIA GENELOR

Catena sens (5-3) conine informaia genetic. Catena antisens (5-3) este copiat. Se obina secven ARNm complementar catenei antisens, deci identic cu catena sens. Polimerizarea are loc 5 ctre 3. n cursul transcripiei, o singur caten ADN este transcris n ARN catena sens. O caten sens pentru o gen poate fi antisens pentru alt gen.

93

EXPRESIA GENELOR
ARN Polimeraza
Se deplaseaz de-a lungul moleculei de ADN (5 ctre 3 pe catena sens) Deruleaz molecula ADN Iniiaz transcripia la nivelul unui promotor Adaug nucleotide progresiv, prin complementaritate, copiind catena antisens Substraturi nucleotidice : ATP,CTP,UTP,GTP ARN format fiind eliberat foarte rapid, se poate ncepe sinteza unei noi molecule nainte de terminarea sintezei moleculei precedente. Viteza : 20 de nucleotide incorporate / secund ntr-o singur or, pornind de la o singur gen pot fi generai mai multe mii de transcripi (ARNm)

94

EXPRESIA GENELOR
ARN polimeraza
Ribonucleotide Nu necesit amors 1 eroare la fiecare 104 Erori cu consecine de mic importan Sistem de reparare rudimentar

ADN polimeraza
Dezoxiribonucleotide Necesit amors 1 eroare la fiecare 107 Erori cu consecine de maxim importan Sistem de reparare foarte complex

EXPRESIA GENELOR
Gena ce trebuie transcris: - Un promotor (amont, cteva zeci de nucleotide) : iniierea transcripiei - O regiune codant (matrice) - O regiune de terminare (aval) Etapele Transcripiei: Iniierea : ARN polimeraza ADN-dependent se leag la promotor. Cele dou catene sunt desfurate i ncepe ncorporarea de nucleotide. Elongarea : 5 ctre 3, antiparalel i complementar cu catena de ADN copiat. Polimeraza expune 10-20 de baze pe catena ADN copiat. Sunt recrutate i incorporate nucleotide, la fel ca n procesul replicrii, fabricndu-se de ast dat o molecul ARN. ADN-ul se renruleaz dup trecerea polimerazei. Terminarea : transcripia continu pn la captul regiunii terminale, dup care polimeraza i molecula de ARN sunt eliberate.

EXPRESIA GENELOR
Iniiere

Elongare

ARN polymrase
3

Terminare
5

EXPRESIA GENELOR
5 UNITATE DE TRANSCRIPIE (ADN)

Amont Aval
3

Promotor
3
GD
DEBUTUL TRANSCRIPIEI

Caten sens necodant Caten antisens codant

Genoni TRANSCRIPTUL (ARN) GF

Regiune terminal
5

5UTR

3UTR

Copie a unei CD pri din promotor

Codoni

CF

Copia catenei codante (poriune a ARN care va fi tradus n protein)

Copie a regiunii terminale

GD : genon de debut CD : codon de debut

GF : genon de final CF : codon de final

UTR = UnTranslated Region = regiune netradus

EXPRESIA GENELOR
1. Transcripia are loc doar atunci cnd celula are nevoie de o protein sau de o molecul de ARN particular (nu este un proces by default. Prin urmare, trenscripia necesit (mai ales la eucariote) un reglaj complex. 2. La procariote o singur enzim e responsabil de transcripie: ARN polimeraza. La eucariote, exist ARN polimeraza I, ARN polimeraza II (cea mai important), i ARN polimeraza III. 3. Fixarea enzimei la promotor se face spontan la procariote, n timp ce la eucariote necesit participarea unor proteine numite factori de transcripie (n plus fa de secvenele Enhancer i Silencer). 4. ARN polimeraza nu posed activitate proofreading = erori (1 / 100 nt) 5. La eucariote, viteza transcripiei = 60 nucleotide / secund. 6. O gen poate fi transcris simultan de mai multe ARN polimeraze.

EXPRESIA GENELOR
La eucariote, transcriptul primar (ARN pre-mesager) sufer transformri post-transcripionale pentru a fi maturat : 1. Adugarea unei structuri protectoare n 5 (Capping) 2. Adugarea unei structuri protectoare n 3 (poly-A: 50-250 adenine) 3. Eliminarea intronilor necodani (splicing) Structurile protectoare ajut de asemenea la transportul ARNm ctre ribozom i la fixarea ARNm pe ribozom.

EXPRESIA GENELOR
8 7 9 5 4 6 3 1 2

O grupare metil CH3 este adugat n poziia 7 a guaninei ARN pre-mesager

Cap 5 M7-Gppp

Segment codant pentru protein

5UTR 3UTR

Coad poly-A

Codon de start

Codon stop

EXPRESIA GENELOR
SPLICINGUL

Transcriptul eucariotic primar conine regiuni codante (exoni) i regiuni necodante (introni), aa cum sunt distribuite acestea la nivelul genelor (discontinue la eucariote). Procesul de splicing permite eliminarea intronilor i alipirea exonilor, ntr-o secven continu codant, la nivelul ARN mesager matur. Lungimea medie a unui ARM pre-m este de 8000 nucleotide, n timp de un ARNm are n jur de 1200 nucleotide (codnd pentru o protein medie de 400 de aminoacizi). Astfel, 85% din secvena ARN pre-m este eliminat. Procesul permite unei gene s codifice simultan pentru mai multe polipeptide (proteine), de vreme ce asamblarea exonilor este deseori alternativ (splicing alternativ mai multe variante de ARNm). Aceasta explic posibilitatea celulei eucariote de a avea peste 100000 polipeptide diferite cu doar 30000 gene codante.

EXPRESIA GENELOR
SPLICINGUL

5UTR

3UTR

Exon

Intron I Intron

Exon

m7Gppp

AAAAAA

Rezumat
||| 3 Promotor ||| ||| E |||

Gen de transcris (caten codant ADN)

I ||| ||| E ||| I ||| Exon ||| ||| ||| Intron ||| ||| ||| E ||| ||| Regiune terminal 5 ||| ||| ||| ||| |||

I = Intron Regiune necodant E = Exon Regiune codant

GD TAC
5 UTR E ||| ||| ||| I ||| ||| E |||

Transcripie
I ||| Exon ||| ||| ||| Intron ||| ||| |||

GF ATT ACT ATC

E ||| ||| ||| ||| ||| ||| 3 UTR |||

ARNpm Coad poly-A

AAAAAAAAAAA

Cap (guanin)
M7G
5 UTR ||| |||

CD AUG
E I ||| ||| ||| E |||

Maturarea ARN Adugare capping 5 i coad 3

I ||| E ||| ||| I ||| ||| ||| ||| E ||| ||| ||| |||

CA UAA UGA UAG

||| 3 UTR ||| |||

Maturarea ARN Splicing

5 UTR ||| ||| E E ||| ||| E ||| ||| E ||| ||| ||| ||| ||| ||| 3 UTR |||

I Intron

AAAAAAAAAAA

ARN m matur

NUCLEU
5 UTR ||| ||| 3 UTR |||

||| |||

||| |||

||| |||

|||

|||

|||

|||

AAAAAAAAAAA

ARN m matur

Traducere Citoplasm

Polipeptid (Succesiune de aminoacizi)

CODUL GENETIC
1. Codul genetic decripteaz triplete de nucleotide n aminoacizi echivaleni GENON (ADN) CODON (ARNm) - ANTICODON (ARNt) AMINOACID (protein)

CODUL GENETIC
2. Prin convenie, codul genetic definete lista de codoni i aminoacizii echivaleni. 3. 43 = 64 de codoni codific pentru 20 de aminoacizi. Dar: 60 de codoni codific pentru aminoacizi Un codon (AUG) codific simultan pentru Met i START Trei codoni (UAG, UGA, UAA) sunt codoni STOP

CODUL GENETIC
61 codoni codific pentru aminoacizi 3 codoni nu codific pentru aminoacizi i sunt codoni STOP

1 codon codific Metionina i este codon START

CODUL GENETIC
4. Codul genetic este degenerat: redundan a mai multor codoni pentru acelai aminoacid
Rolul redundanei Minimizeaz efectul mutaiilor: o substituie poate fi silenioas, dac modificarea la nivelul ADN nu implic o modificare la nivelul proteinei.

5. Codul genetic este universal = origini comune ! Excepii : mitocondrii, cloroplaste

In anul 1489, tefan cel Mare a luptat cu turcii pentru a oferi poporului gru. In anul 1489, tefan cel Mare a luptat cu turcii pentru a oferi poporului fru. In anul 1489, tefan cel Mare a luptat cu murcii pentru a oferi poporului gru. In anul 1489, tefan cel Mare a luptat cu turcii pentru a oferi popoorului gru. In anul 1989, tefan cel Mare a luptat cu turcii pentru a oferi poporului gru. In anul 1489, tefan del Mare a luptat cu turcii pentru a oferi poporului gru. In anul 1489, tefan cel Mare a luptat cu turcii centru a oferi poporului gru. Pentru a oferi poporului gru, tefan cel Mare a luptat cu turcii n anul 1489. In anul 1489 turcii au luptat cu gru pentru a oferi poporului tefan cel Mare. A oferi n anul poporului cel Mare au luptat 1489 turcii gru au cu tefan . Domnioara Domnioara Domnioara Domnioara Domnioara Domnioara Maria Maria Maria Maria Maria Maria Popescu Ponescu Popescu Popescu Popescu Popescu se se se se nu se cstorete cu domnul Ionel Timofte. cstorete cu domnul Ionel Timofte. cspete cu domnul Ionel Timofte. cstorete. se cstorete cu domnul Ionel Timofte. csstorete cu domnul Ionel Timofte.

CODUL GENETIC

Marcel i da lui Ninel 200 RON. Marcel i ia lui Ninel 200 RON. Marcel i da lui Ninel 2000 RON. Marcel i da lui Gigel 200 RON. NOR 002 leniN iul ad i lecraM.

CODUL GENETIC
6. Codul genetic este puctuat (are punctuaie): Codonul iniiator AUG (Met) definete nceputul mesajului i cadrul de lectur n care se va citi acest mesaj. ntrebare: cte cadre de lectur diferite pot exista pentru acelai mesaj, dac citirea se face pe codoni (3 cte 3 litere) ?

YXDNDJSNSHSSTARTIARMAIIAUDOIPUIDINCOCTPOTSTOPXBSGSBSKM YXDNDJSNSHSSTARTIARMAIIAUDOIPUIDINCOCTPOTSTOPXBSGSBSKM

IAR MAI IAU DOI PUI DIN CO CT POT ARM AII AUD OIP UID INC OC TP OT RMA IIA UDO IPU IDI NCO C TPO T

SINTEZA PROTEINELOR
TRANSLAIA (TRADUCEREA) : Sinteza unei catene polipeptidice (succesiune de aminoacizi) pornind de la informaia coninut de o molecul de ARNm (succesiune de nucleotide), prin codul genetic. PARTICIPANI : - ARNm matur : succesiune codoni = succesiune aminoacizi - Aminoacizi (20) : prezeni n citoplasm - ARNt : transport (transfer) aminoacizii din citoplasm ctre ribozomi - Ribozomi : sediul sintezei proteice. Complexe ribonucleoproteice (ARNr + proteine) ETAPE : 1. Ribozomul se fixeaz pe ARNm. 2. ARNm este scanat pn la iddentificarea AUG iniiator. 3. Un ARNt aduce o metionin echivalent cu AUG. 4. ARNm traverseaz ribozomul, fiind citit codon cu codon. 5. De fiecare dat cnd un codon este citit, ARNt echivalent aduce aminoacidul echivalent pentru a fi legat prin legtur peptidic la proteina nascent. 6. Atunci cnd este citit un codon de terminare (UAA; UAG sau UGA), nu mai este incorporat nici un aminoacid i procesul ia sfrit 7. ARNm este citit 5 ctre 3, proteina sitetizat Nter ctre Cter

SINTEZA PROTEINELOR
ARNm

ARN matur CF
3UTR AAA

M7G

5UTR CD

Codoni

AUGCUUCAGAGGCUGUAA

Semnal de terminare a traducerii

Met Leu Gln Arg Leu

SINTEZA PROTEINELOR
ARN (acidul ribonucleic)
ARN-ul mesager este ARN-ul ce va servi ca tipar pentru sinteza proteinelor. Complexul enzimatic ARN polimeraz sintetizeaz iniial un ARN mesager precursor ce conine secvenele corespunztoare exonilor i intronilor genei. Prin procesul ulterior de maturare ARN-ul premesager este modificat pentru a duce la formarea ARN-ului mesager matur ARN-ul ribozomal este un constituient principal al ribozomilor, structuri celulare la nivelul crora se realizeaz sinteza proteinelor. ARN-ul ribozomal este sintetizat prin transcripia genelor corespunztoare situate n anumite regiuni ale cromozomilor numite organizatori nucleolari. ARN-ul de transport (notat ARNt) este un ARN scurt, de 75-100 nucleotide, cu o structur teriar n trefl (cu patru regiuni scurte dublu catenare i trei bucle) ce fixeaz un anumit aminoacid si care are o regiune specific de trei nucleotide numit anticodon. Acest ARN fixeaz un aminoacid pe care l transport i n poziioneaz n dreptul unui codon (prin complementaritatea codon (de pe molecula de ARNm) anticodon (de pe molecula de ARNt) n cursul procesului de translaie.

SINTEZA PROTEINELOR

ARN (acidul ribonucleic)

SINTEZA PROTEINELOR
aminoacizi LP ARNt

Ribozom

Anticodon ARNm 3 Codon

5 LP : Legturi peptidice

SINTEZA PROTEINELOR
ARN de transfer
A C C

Bucl destinat legrii la aminoacid

Situs de legare a aminoacidului specific

Baze neobinuite mpiedic legarea, crend bucle

Bucl de fixare la ribozom 3 AAG 5

Bucl anticodon Parte specific fiecrei mulecule de ARNt (restul moleculei este comun la toate ARNt)

SINTEZA PROTEINELOR
ARN de transfer
Este produs prin transcripie i migreaz n citosol Aproximativ 80 nucleotide cu structur secundar complex Fiecare bucl joac un rol distinct Fiecare ARNt este specific unui anumit aminoacid, pe care l transport la ribozom. Odat eliberat, molecula de ARNt se leag de alt aminoacid. Aproximativ 45 tipuri de ARNt sunt suficiente Pentru 61 de codoni, datorit relaxrii regulilor De complementaritate A G n poziia 3, U se poate lega de A sau de G

n poziia 3, Inozina (baz neobinuit) se poate lega de A, U sau G

Dou roluri ale ARNt

a.a.
ENZIMA

1. Se leag la aminoacidul specific (anticodonului) Cu ajutorul enzimei: aminoacil- ARNt sintetaza i cu energie de la ATP. Pentru 20 de aminoacizi, exist n celul 20 de enzime specifice, cte una pentru fiecare aminoacid. 2. Transport aminoacidul la ribozom Datorit asocierii anticodonului cu codonul echivalent din ARNm (complementaritate !)

Aminoacid activat

ARNt Eliberare AMP din ATP ARNt legat la aminoacidul specific

SINTEZA PROTEINELOR
ARN de transfer

SINTEZA PROTEINELOR
Ribozomul
Dou subuniti ribonucleoproteice (1/3proteine + 2/3ARNr) ARNr produs prin transcripie, apoi maturat Asamblajul subunitilor se face n nucleu, apoi sunt exportate Asamblajul ribozomului se face pe o molecul ARNm

Polipeptid pe cale de a fi sintetizat

Ribozom procariot 70S Ribozom eucariot 80S

Subunitate mare 50S : 2 filamente ARNr i 31 proteine Subunitate mic 30S : 1 filament ARNr i 21 proteine Subunitate mare 60S : 3 filamente ARNr i 50 proteine Subunitate mic 40S : 1 filament ARNr i 33 proteine

3 filamente ARNr
Subunitate mare Subunitate mic

ARNm

S : constant de sedimentare, reflect masa ARNr

SINTEZA PROTEINELOR
Situs P Reine ARNt legat de polipeptidul pe cale de a fi sintetizat Legtur peptidic Polipeptid n formare Aminoacid

E PA M

Situs E Permite ieirea ARNt care i-a ncheiat misiunea 5 Situs M Fixeaz ARNm la nceputul traducerii

Situs A Reine ARNt care tocmai sosete ARNm 3

Ribozomul conine mai multe situsuri de fixare pentru partenerii si

Rolurile ribozomului : 1. Aduce n apropiere (plaseaz n context conformaional ARNm i ARNt 2. Plaseaz urmtorul aminoacid n sensul corect: gruparea amino n proximitatea gruprii carboxil a catenei polipeptidice deja existente. 3. Catalizeaz legturile peptidice ce se vor forma ntre aminoacizii ce se adaug unii dup alii n polipeptid H H
H RX H RX H H H H I I I I I I I I H N C C N C C N C C N C C I II I II I II I II O RX O H O H O RX

SINTEZA PROTEINELOR

H H | | N C RX |

H H | | HN C RX
| C=O | O

Polipeptid 3
5

C=O | O
Site P

| | H N C RX | C=O | O

Site A

CCC

Site E

UUU AGC AAA UCG

AGC

10

SINTEZA PROTEINELOR
Translaia (Traducerea) reprezint transformarea codonilor ARNm n caten polipeptidic. Necesit participarea a numeroi factori proteici i a ARNm, ARNt, ARNr. Consum energie provenind de la GTP (guanozin trifosfat). Necesit activitatea catalitic a ARNr. ETAPELE TRANSLAIEI: 1. Iniierea : etapa cea mai lung i mai complex, necesit asamblarea tuturor participanilor i identificarea codonului START. 2. Elongarea : ciclic, la fiecare ciclu este citit un codon pe ARNm i este adugat aminoacidul corespunztor la catena polipeptidic. 3. Terminarea : Atunci cnd este citit un codon STOP, toi actorii translaiei sunt eliberai, precum i produsul rezultat, catena polipeptidic.

INIIEREA
Grupare formil
O

Metionin

H O I C NH C C I H R O

Rezumat: 1. ARNt iniiator purttor de Metionin formilat se instaleaz pe subunitatea mic a ribozomului. 2. Subunitatea mic fixeaz ARNm la nivelul situsului M, apoi scaneaz ARNm (regiunea 5-UTR) ]n cutarea codonului Start CD, echivalent metioninei 3. ARNt iniiator se leag la codonul start AUG, prin anticodonul echivalent (CAU !!!). La acest moment este generat situsul P, metionina fiind primul aminoacid N-ter al proteinei. 4. Subunitatea mare a ribozomului se fixeaz datorit energiei degajate prin hidroliza GTP.

ARNt iniiator Situs M CD

3
Anticodon

F Met ARNt

Situs P

GTP

GDP

Ribozom

ELONGAREA
Durata : 0,1 sec Ribozomul i ARNm se deplaseaz n sensuri nceputul contrare unui nou ciclu
Translocarea Catena, mpreun cu ARNt (ultimul venit) trece din A n P. A rmne astfel liber. 3 ARNt din situsul P, rmas fr caten, trece n situsul E (exit), dup care prsete ribozomul.

Recunoaterea unui codon 1 Un aaARNt se adaug la situsul A.

3
2 GTP 2 GDP

Legtur peptidic

ARNm Ribozom
E P A
Noul aa este incorporat C-ter
GDP GTP

P A

P A

Legtur peptidic Legtura se formeaz ntre aa nou venit i catena polipeptidic n fomare. Transfer al catenei de la situsul P la ARNt din situsul A, astfel aa devine C-ter. Catalizat de ARNr.

TERMINAREA
Factor de terminare
E

A Codon STOP UAG, UAA ou UGA

Ribozomul 1 citete un codon STOP. Un factor proteic de terminare se leag la situsul A.

PA

Factorul de terminare hidrolizeaz legtura dintre polipeptid i ARNt, ambele fiind astfel eliberate.

3 Subunitile ribozomului se deteeaz i ARNm este eliberat.

SINTEZA PROTEINELOR
ARNm, ARNt i ARNr servesc de mai multe ori pn a fi degradate. ARNt i ribozomii sunt aproape identici la toate eucariotele. ARNm difer de la o specie la alta, i de la o gen la alta, permind producerea de proteine specifice. O molecul de ARNm este tradus simultan de mai muli ribozomi, genernd un poliribozom sau polizom, generator de mai multe proteine simultan. ARNm Ribozomi

SINTEZA PROTEINELOR
Sinteza oricrui polipeptid ncepe la nivelul unui ribozom liber, n citoplasm, ns finalitatea procesului depinde de identificarea, Nterminal la proteine, a unei eventuale secvene semnal. n absena secvenei semnal sinteza proteinei are loc pn la capt n citoplasm
n prezena Secvenei semnal

1.

Sinteza se ntrerupe. 2. Ribozomul se leag de membranele externe ale reticulului endomplasmic (rugos). 3. Sinteza este reluat.

SINTEZA PROTEINELOR
Proteine fabricate n ribozomii liberi din citosol Proteine fabricate n ribozomi legai la membrane Proteine care se dizolv n citosol, unde i ndeplinesc funciile, sau se dirijeaz ctre organite ce nu fac parte din reeaua intracelular de membrane: peroxizomi, cloroplaste, mitocondrii. Proteine aparinnd reelei intracelulare de membrane: membrana nuclear, RE, complex Golgi, lizozomi, vacuole, membrana celular, precum i proteine ce vor fi secretate n afara celulei.