Curs 9 Evaluarea proceselor de separare Bioproduii obinuti cu ajutorul unui agent biologic, microorganisme, celule animale, plante, celule

vegetale, organe animale, enzime etc. sunt supui unor procese de izolare, purificare i concentrare specifice fiecrui bioprodus n parte. Alegerea etapelor individuale de prelucrare a produsului brut, pentru obinerea preparatului final dorit, este guvernat att de proprietile produsului de interes dar i de proprietile compuilor existeni n mediul de cultur, compui care acompaniaz produsul de interes i care n cele mai multe cazuri trebuie ndeprtai. entru evaluarea unui proces complex de separare, purificare sau!i concentrare, principalii parametri utilizai, pentru fiecare nivel de producie "micropilot, pilot, industrial la diferite niveluri# al etapei, sunt $ Producia etapei : roducia unei etape se exprim n cantiti "de exemplu g sau %g# sau uniti "de exemplu unitati de activitate# obinute in functie de condiiile de lucru i documentele care permit s se concluzioneze asupra procesului i ec&ipamentului utilizat. 'uantificarea produciei se exprima prin valori procentuale conform ecuaiei$ ()
unitati (sau cantitati ) dupa proces * +,, unitati (sau cantitati ) inainte de proces

roces ) purificare, separare, extractie, cncentrare, etc. rin calcularea produciei se realizeaz i evaluarea pierderilor de bioprodus n timpul etapei respective. Puritatea bioprodusului de interes dup purificare, mbogire sau concentrare se calculeaz prin ecuaii de forma $
cantitate de bioprodus cantitate totala unitati unitati de activitate mg proteina

- cantitate totala -

etc.

Factorul de mbogire este definit, dupa determinarea puritii bioprodusului, conform relaiei $
puritatea bioprodusului dupa purificare puritatea bioprodusului inainte de purificare

.n mod obinuit, evaluarea factorului de mbogire i a produciei procentuale pentru o etap de prelucrare permit stabilirea eficienei te&nologiei utilizate n etapa respectiv. rodusul dintre factorul de mbogire i producia procentual pentru o etap reprezint eficiena etapei respective. arametrii te&nici i tiinifici nu sunt suficieni pentru evaluarea unei etape, este nevoie s se ia n considerare i aspectele economice implicate, n special costurile de manoper, de realizare a bioprodusului. .n acest sens este necesar ca pentru preul de producie a unui bioprodus s fie luate n calcul $ costurile materialelor brute i auxiliare, costurile de personal, costurile de energie, costurile de reparaii, deprecierile, pierderile, costurile pentru tratamentul deeurilor i c&eltuieli de regie. /oate aceste costuri trebuie adunate i raportate la valoarea de producie a etapei. Astfel preurile de producie pot fi calculate, integrnd parametrii te&nici i economici ai unei etape, prin relaii de forma$
costuri totale kg de bioprodus

sau unitati "mega# de bioprodus

costuri totale

0valuarea intregului proces de prelucrare i condiionare a unui bioprodus se obine din evalurile etapelor individuale. Astfel producia procentual total se obine prin multiplicarea produciilor procentuale per etape, iar preul total de cost al bioprodusului final se afl prin nsumarea tuturor tipurilor de costuri i raportarea sumei la producia total. 0valuarea te&nic i economic a unui proces pe etape permite nu numai optimizarea procesului dar i o adaptare imediat prin intervenie adecvat n etapele de prelucrare corespunztoare. Modaliti de verificare a puritii preparatelor proteice uritatea preparatelor proteice poate fi verificata cu ajutorul unor teste specifice. 1nele dintre metodele de purificare pot fi utilizate la scara analitica pentru a verifica daca un preparat proteic este omogen. /estele analitice pot fi utilizate pentru a demonstra prezenta unei impuritati, fara a dovedi absenta acestora. 'ateva dintre testele de puritate cele mai utilizate sunt$ ultracentrifugarea, electroforeza si focusarea izoelectrica, analiza aminoacizilor de la extremitatea N-terminala, curbele de solubilitate si cristalizarea. Ultracentrifugarea roba de proteina este introdusa in eprubetele unei ultracentrifugi, eprubete gradate care sunt prevazute cu un sistem optic care urmareste variatia indicelui de refractie din timp in timp. 2n cazul proteinelor pure curbele de variatie a indicelui de refractie pe parcursul ultracentrifugarii prezinta un singur pic. 'urbe de sedimentare cu mai multe picuri apar in cazul proteinelor

impure. 1ltracentrifugarea nu este un criteriu satisfacator de puritate in detectarea unor cantitati mici de proteine, de impuritati sub 3(. /estul nu reprezinta un criteriu absolut de puritate deoarece intr4un pic pot sedimenta doua sau mai multe proteine care au mase moleculare foarte apropiate. 5e asemenea ultracentrifugarea nu poate fi utilizata in aprecierea puritatii enzimelor care sufera fenomene de asociere4disociere. Astfel o enzima care sufera acest gen de fenomene de agregare are cele doua forme in ec&ilibru conform reactiei$ nA An 6olecula stabila de enzima poate fi un monomer, dimer, trimer etc,"A#, iar proceesul de agregare va duce in functie de marimea proteinei la forme agregate foarte mari. 1n exemplu in acest sens este glutamat de&idrogenaza din ficat bovin. 0nzima este alcatuita din sase catene polipeptidice, cu masa moleculara a &examerului de 778,,, 5a. Agregatul pe care il formeaza va avea masa moleculara mai mare ca 9x+,8. 5eplasarea ec&ilibrului sistemului depinde de concentratia enzimei, agregarea fiind favorizata la concentratii mari ale acesteia. :a orice concentratie de enzima, coexista cele doua specii ale enzimei, astfel incat la ultracentrifugare se obtin doua maxime corespunzatoare celor doua forme cu mase moleculare diferite. Electroforeza 0lectroforeza nativa poate fi utilizata pe tot parcursul procedeelor de purificare pentru a se urmari indepartarea proteinelor contaminante. entru evaluarea puritatii unei proteine metoda trebuie aplicata la diferite valori de p;. <btinerea cate unei singure benzi proteice la un p; acid si la unul bazic este un indiciu pentru omogenitatea proteinei. 0lectroforeza in conditii denaturante "=5=4 A>0# este o metoda eficienta in decelarea impuritatilor care difera putin, din punct de vedere al masei moleculare de proteina purificata. 6etoda este foarte utilizata in determinarea gradului de proteoliza a preparatelor purificate. ?ezultate neconcludente apar in cazul proteinelor alcatuite din subunitati diferite, care conduc la obtinerea mai multor benzi. Focusarea izoelectrica este o metoda mai sensibila de decelare a impuritatilor decat electroforeza. Analiza aminoacizilor de la extremitatea N-terminala

Analiza naturii resturilor de aminoacizi de la extremitatea @4terminala poate fi de asemenea utilizata ca test de puritate. ?ezultate neconcludente se obtin in cazul enzimelor alcatuite din mai multe subunitati diferite, caz in care se obtin mai multe benzi. Cur ele de solu ilitate 2n astfel de teste, cantitati diferite de proteina purificata se dizolva in acelasi volum mic de solvent si dupa centrifugare se determina concentratia proteica din supernatante. 'urbele de solubilitate se obtin prin reprezetarea concentratiei de proteina determinata experimental in functie de cantitatea de proteina solida care a fost adaugata in fiecare proba. Alura curbelor de solubilitate pentru preparatele pure difera de cea a preparatelor impure. 2n cazul proteinelor pure, curba de solubilitate se aplatizeaza atunci cand se atinge maximul de solubilitate al proteinei in solvent "fig..#. unctele de inflexiune care apar pentru proteine impure reflecta solubilitatile diferite ale componentelor din amestec. entru siguranta rezultatelor se recomanda realizarea curbelor cu solubilitate in diferiti solventi. =unt foarte rare cazurile in care doua proteine au aceiasi solubilitate in acelasi solvent, si foarte putin probabil ca doua proteine sa aiba solubilitati identice in doi solventi diferiti. mg proteina solubilizata

roteina pura

roteina impura

mg proteina adaugata in solvent

'ontaminarea preparatelor proteice cu diferite impuritati poate fi demonstrata si prin teste functionale prin care potfi decelate cantitati mici de substante contaminante in cazul in care acestea au proprietati biologice specifice. Cristalizarea. 'ristalizare proteinelor a fost considerata multa vreme ca fiind un criteriu absolut de puritate. 2n prezent, cristalizarea nu mai este considerata un criteriu absolut de puritate pentru ca in multe cazuri cristalele formate s4au dovedit ca apartineau mai multor proteine unele fiind proteinele contaminante. e de alta parte, exista te&nici de purificare, cum ar fi cele bazate pe afinitate sau imunoadsorbtie, care conduc la obtinerea de proteine pure, fara ca acestea sa se obtina in stare cristalina. 'and preparatele enzimatice au atins un anumit grad de puritate exista posibilitatea cristalizarii lor. Aorma cristalelor pentru o anumita enzima depinde de sursa de izolare, de procedeul de purificare, de agentul folosit pentru cristalizare si de p;4ul folosit pentru realizarea cristalizarii. Aparitia unor cristale in solutia proteica nu este un indiciu al cristalizarii enzimei de interes. 5aca, prin recristalizari repetate, activitatea enzimatica ramane constanta, inseamna ca enzima de interes a cristalizat si e pura. 5aca insa se inregistreaza o scadere a activitatii enzimatice cristalele obtinute apartin si unor proteine contaminante. 'el mai utilizat agent de cristalizare a enzimelor este sulfatul de amoniu care se poate utiliza in stare solida sau ca solutie saturata. 'ristalizarea enzimelor este un procedeu lent, care se realizeaza in perioade mari de timp, sub agitare lenta, la o temperatura de B ,'. Aormarea si cresterea cristalelor este urmarita la microscop. Alti agenti de cristalizare sunt solventii organici, caz in care cristalizarea trebuie realizata la temperaturi sub , ,', pentru a se minimaliza efectul denaturant al acestora si procesul de evaporare. @ici una dintre metodele prezentate nu reprezinta un criteriu absolut de puritate. 5e aceea se recomanda utilizarea a cel putin doua metode pentru a se putea trage concluzii referitoare la puritatea unui preparat proteic.