UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII COALA DE STUDII DOCTORALE Domeniul : BIOTEHNOLOGII

Chim. SONIA ANCUA SPINEAN (SOCACI)

TEZ DE DOCTORAT OPTIMIZAREA SISTEMELOR GC-MS PENTRU DETERMINAREA AMPRENTEI ULEIURILOR VOLATILE DIN PLANTE AROMATICE I MEDICINALE

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

Conductor tiinific: Prof. univ. dr. Carmen Socaciu

CLUJ-NAPOCA 2009

INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE

Uleiurile volatile sunt cunoscute nc din cele mai vechi timpuri datorit efectelor lor terapeutice. Ele au fost utilizate de egipteni, greci, romani, arabi att n tratarea diferitelor afeciuni (arsuri, rni, etc.) ct i n practicile religioase (ex. mbalsmri), dar i n viaa de zi cu zi (aromatizante pentru diferite buturi, uleiuri pentru masaj sau bi). Proprietile antioxidante, anti-microbiene, anti-fungice, anti-cancerigenne, antimutagene, imunostimulatoare, sedative, aromatizante, etc. demonstrate de multitudinea de studii efectuate asupra compoziiei lor n ultimii ani, fac ca ale uleiurilor volatile s joace un rol important n domenii precum : industria alimentar, farmaceutic, chimic, n parfumerie, agricultur i nu n ultimul rnd n medicin. Proprietile uleiurilor volatile sunt direct corelate cu compoziia lor, att din punct de vedere calitativ ct i cantitativ. Prezena unor falsuri conduce adesea la modificarea proprietilor uleiurilor volatile, n special ale celor terapeutice, care rezult prin aciunea sinergetic a tuturor componenilor. Mai mult, uleiurile volatile, diferitele extracte de plante sunt utilizate n suplimentele alimentare sau n scopuri medicinale, i prin urmare este crucial s se asigure autenticitatea i calitatea produsului respectiv, existnd riscul ca falsificarea lor s induc efecte negative severe asupra sntii consumatorului. Lund n considerare toate aceste aspecte este uor de neles amploarea pe care au luat-o n ultimii ani cercetrile privind compoziia uleiurilor volatile. Studiile actuale se axeaz pe dezvoltarea i optimizarea unor metode de analiz capabile fie s determine compoziia acestor uleiuri (amprenta cromatografic/metabolomic), fie s identifice anumii compui markeri care s ateste calitatea i autenticitatea produsului respectiv. Avnd n vedere complexitatea compoziiei (zeci sau chiar sute de compui), cele mai des utilizate metode pentru studiul uleiurilor volatile sunt: gaz-cromatografia cuplat cu spectrometria de mas (GC-MS), headspace-gaz-cromatografia (HS-GC),

microextracia n faz solid gaz-cromatografia (SPME-GC), in-tube extraction-gazcromatografia (ITEX-GC), spectroscopia vibraional (NIR, IR, ATR-IR, Raman), electroforeza capilar (CE), etc. Scopul acestei lucrri este optimizarea sistemelor GC-MS pentru determinarea amprentei uleiurilor volatile din plante aromatice i medicinale.

Principalele obiective ale studiului de fa sunt: Evaluarea metodelor gaz-cromatografice de separare i identificare a

componentelor uleiurilor volatile i a compuilor volatili din matrici vegetale; Optimizarea unor metode GC-MS, HS/GC-MS, i HS/ITEX/GC-MS de separare i identificare a componentelor uleiurilor volatile; Determinarea amprentei gaz-cromatografice a rozmarinului i uleiului volatil de rozmarin, prin folosirea comparativ a tehnicilor de analiz optimizate (GC-MS, HS/GC-MS, i HS/ITEX/GC-MS); Determinarea amprentei gaz-cromatografice a hameiului, peleilor i uleiului volatil de hamei, prin folosirea comparativ a tehnicilor de analiz optimizate (GC-MS, HS/GC-MS, i HS/ITEX/GC-MS); Evidenierea diferenelor compoziionale n cadrul uleiurilor volatile analizate, expresie a influenei unor factori intrinseci i extrinseci asupra biochimismului plantei; Evidenierea unor compui volatili specifici plantelor / uleiurilor analizate i posibilitatea folosirii lor ca markeri n autentificare; Discriminarea soiurilor de hamei pe baza compoziiei uleiurilor volatile, folosind metode de analiz statistic a datelor (analiza cluster).

STRUCTURA TEZEI

Teza este structurat n dou pri principale, prima parte incluznd studiul de literatur, iar cea de a doua parte cercetri proprii, rezultate, discuii, concluzii i perspective. PARTEA NTI: STUDIU DE LITERATUR, cuprinde 2 capitole: Capitolul 1. Evaluarea metodelor gaz-cromatografice de separare si identificare a componentelor uleiurilor volatile, cuprinde 5 subcapitole n care sunt prezentate tehnici de analiz utilizate n determinarea/identificarea compuilor volatili i semi-volatili. Capitolul 2. Compozitia uleiurilor volatile expresie a variabilitatii genetice i originii geografice a plantelor, descrie n 2 subcapitole principalele noiuni de biologie

II

ale plantei de rozmarin i hamei, precum i compoziia i variabilitatea compoziional a uleiurilor volatile extrase din cele dou plante.

PARTEA A DOUA: CERCETRI PROPRII, cuprinde 3 capitole: Capitolul 3. Evaluarea compoziiei uleiului volatil de rozmarin prin optimizarea unor tehnici de tip GC, cuprinde 3 subcapitole referitoare la cele trei tehnici folosite pentru determinarea amprentei cromatografice a uleiului volatil de rozmarin, fiecare la rndul lor fiind structurate n sub-subcapitole care prezint modul de optimizare al diferiilor parametrii ai metodelor de analiz, precum i evaluarea compoziiei volatile a rozmarinului n funcie de vrst. Capitolul 4. Evaluarea compoziiei uleiului volatil de hamei prin optimizarea unor tehnici de tip GC, are aceeai structur ca i capitolul 3, evaluarea compoziiei volatile a hameiului realizndu-se n funcie de soi, dar i n funcie de modalitatea de prelucrare a conului. Capitolul 5. Analiza chemometric a datelor, cuprinde 2 subcapitole, referitoare la folosirea unor metode de analiz statistic pentru predicia evoluiei compoziiei chimice a uleiului volatil n timp, respectiv pentru clasificarea/discriminarea diferitelor soiuri pe baza compoziiei uleiul volatil.

Elementele de originalitate ale tezei sunt: 1) Optimizarea unor metode moderne pentru caracterizarea compoziiei volatile a unor plante aromatice i medicinale indigene; 2) Folosirea uneia dintre cele mai performante tehnici actuale - HS/ITEX - in evidentierea unor compusi volatili prezenti in urme; 3) Evidentierea unor compui marker ce pot fi utilizai n autentificarea plantelor studiate; 4) Evidentierea variabilitatii compozitionale a uleiurilor volatile expresie a influentei unor factori intrinseci si extrinseci; 5) Clasificarea/discriminarea unor soiuri de hamei cultivate n Romnia pe baza compoziie lor volatile.

III

CERCETRI PROPRII

Uleiurile volatile mai sunt cunoscute i sub denumirea de uleiuri eterice sau uleiuri eseniale fiind produse n protoplasma celular a plantelor ca metabolii secundari. Sub aspect chimic, uleiurile volatile nu sunt compui unitari, ci reprezint amestecuri de zeci sau chiar sute de substane organice (aldehide, cetone, alcooli, esteri, etc.) cunoscute sub denumirea de terpene i terpenoide. Importana acordat n ultimii ani uleiurilor volatile, se datoreaz i proprietilor pe care monoterpenele constituente le au. Pentru optimizarea unor sisteme GC-MS pentru determinarea amprentei cromatografice a uleiulurilor volatile s-au ales dou plante aromatice i medicinale indigene, i anume rozmarinul i hameiul. Rozmarinul, este o plant aromatic i medicinal, cunoscut nc din antichitate, care poate fi folosit att n stare proaspt ct i uscat. Rozmarinul conine o cantitate mare de ulei volatil care are proprieti tonice, colagoge, poate fi folosit ca antiseptic pulmonar, coleric, are proprieti stomahice, antidiuretice i antireumatice. De asemenea uleiul volatil de rozmarin este folosit n parfumerie, fitocosmetic, medicin, industria alimentar, a buturilor alcoolice (lichior), agricultura, etc. Hameiul este o plant peren, cu durata de via cuprins ntre 30-50 de ani, fiind ns productive numai planiile de 20-25 de ani. Hameiul se numr printre puinele plante cultivate la nivel mondial, datorit multiplelor sale utilizri, o importan deosebit avnd ns pentru industria berii, pentru care inflorescenele female (conurile) reprezint materia prim indispensabil pentru producerea acestei buturi. Hameiul mai poate fi folosit att ca legum, ct i n scop furajer sau medicinal, avnd proprietile bactericide, antiseptice, antimicrobiane, antispasmice, astringente, diuretice, emoliente, estrogenice, hipnotice, sedative, etc.

IV

I. EVALUAREA COMPOZIEI ULEIULUI VOLATIL DE ROZMARIN PRIN OPTIMIZAREA UNOR TEHNICI DE TIP GC

I.1. MATERIAL I METODE I.1.1. Probele de rozmarin

Pentru evaluarea variabilitii compoziionale a uleiurilor volatile in funcie de stadiul vegetativ, s-au recoltat, la un interval de timp de ase luni, probe de rozmarin de vrste diferite, cultivate n sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj. Probele au fost codificate dup cum urmeaz: - R2004-aug07 - R2004-mar08 - R2004-oct08 - R2005-aug07 - R2005- mar08 - R2005-oct08 - R2006-aug07 - R2006-mar08 - R2006-oct08 - R2007-aug07 - R2007-mar08 - R2007-oct08 - rozmarin plantat n anul 2004 i recoltat n august 2007; - rozmarin plantat n anul 2004 i recoltat n martie 2008; - rozmarin plantat n anul 2004 i recoltat n octombrie 2008; - rozmarin plantat n anul 2005 i recoltat n august 2007; - rozmarin plantat n anul 2005 i recoltat n martie 2008; - rozmarin plantat n anul 2005 i recoltat n octombrie 2008; - rozmarin plantat n anul 2006 i recoltat n august 2007; - rozmarin plantat n anul 2006 i recoltat n martie 2008; - rozmarin plantat n anul 2006 i recoltat n octombrie 2008; - rozmarin plantat n anul 2007 i recoltat n august 2007; - rozmarin plantat n anul 2007 i recoltat n martie 2008; - rozmarin plantat n anul 2007 i recoltat n octombrie 2008.

I.1.2. Metode de analiz

I.1.2.1. Extracia uleiului volatil Extracia uleiului volatil s-a realizat prin hidrodistilare, dup cum urmeaz: o cantitate de 50 g de frunze verzi de rozmarin, respectiv uscate i mcinate au fost introduse mpreun cu 750 ml ap distilat n balonul de distilare al instalaiei de dozare a uleiurilor volatile din produse vegetale. n balonul de distilare au fost adugate i cteva bile de sticl n vederea omogenizrii fierberii. Materialul vegetal a fost supus distilrii

timp de 3h. La sfritul distilrii, uleiul volatil de rozmarin a fost colectat i msurat volumul obinut. Probele de ulei volatil au fost pstrate la frigider, n fiole bine nchise, pn n momentul analizei. Pentru ndeprtarea eventualelor urme de ap, n fiolele de pstrare a fost adugat sulfat de sodiu anhidru. Pentru determinarea compoziiei uleiurilor volatile prin diferite metode gaz-cromatografice a fost preparat o soluie de 2% ulei volatil n hexan.

I.1.2.2. Analiza GC-MS a uleiurilor volatile de rozmarin Analiza probelor de rozmarin i de ulei esenial de rozmarin prin cele trei tehnici utilizate (GC-MS; HS/GC-MS i ITEX/GC-MS) s-a realizat cu ajutorul unui aparat GCMS QP-2010 Schimadzu, echipat cu un autosampler AOC-5000 (CombiPAL). Coloana utilizat pentru separarea constituenilor uleiurilor volatile a fost o coloan capilar Alltech, USA, AT-5 de 30m cu diametrul intern de 0,25mm i grosimea filmului de 0,25m. Pentru o separare i o identificare ct mai bun a constituenilor uleiurilor volatile, s-a recurs la optimizarea metodei de analiz. Principalul parametru de care depinde separarea compuilor din uleiurile volatile este programul de temperatur al coloanei cromatografice. Prin urmare, au fost testate 5 programe de temperatur: PROGRAMUL DE TEMPERATUR AL COLOANEI CROMATOGRAFICE a) b) c) d) e) 50.0oC (2 min) la 250.0oC (10 min) cu 3oC/min 60oC (5 min) la 160oC cu 4oC/min la 240oC (1min) cu 15oC/min 60oC (1 min) la 180oC (15 min) cu 3oC/min 40oC (1 min) la 250oC (5 min) cu 4oC/min 60oC (10 min) la 220oC (10 min) cu 4oC/min la 240oC cu 1oC/min CODIFICARE METOD MEOR MEOR1 MEOR2 MEOR3 MEOR4

Ceilali parametrii ai metodei GC-MS au fost: temperatura injectorului 250.0oC; volumul de injectare 1.0L; presiunea 37,1 kPa; viteza liniar 32.4 cm/s; raportul de splitare 1:200; gaz purttor heliu; detector MS; temperatura sursei ionice 250.0oC; temperatura de interfa 250.0oC; MS mode EI, intervalul de scanare 40-400u; viteza de scanare 769u/s. Datele au fost achiziionate cu ajutorul softului aparatului, iar

VI

identificarea compuilor s-a realizat prin comparaea spectrelor de mas obinute cu cele din bibliotecile de date a softului (NIST147 i NIST27).

I.1.2.3. Analiza HS/GC-MS a rozmarinului i uleiurilor volatile de rozmarin Tehnica headspace este utilizat pentru extracia compuilor volatili din diferite matrici biologice. Pentru o extracie ct mai eficient a compuilor de arom/volatili din rozmarin a fost necesar optimizarea urmtorilor parametrii:

Metoda HSrT30t40m1 (HS1) HSrT40t40m1 (HS2) HSrT60t40m1 (HS3) HSrT60t30m1 (HS4) HSrT75t15m1 (HS5) HSrT75t15m0.5 (HS6) HSrT80t15m0.5 (HS7) HSrT85t15m0.25 (HS8) HSrT95t15m0.15 (HS9)

Masa prob (g) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,50 0,50 0,25 0,15

Temperatura de incubare (oC) 30 40 60 60 75 75 80 85 95

Timpul de incubare (min) 40 40 40 30 15 15 15 15 15

Dup incubare, 250 L din faza de headspace a fiolei cu prob au fost introdui n injectorul gaz-cromatografului i analizai folosind metoda MEOR1.

I.1.2.4. Analiza ITEX/GC-MS a compuilor volatili din rozmarin Parametrii variai n vederea optimizrii acestei metode au fost: temperatura de incubare, timpul de incubare, numrul de pompri din faza de headspace, precum i masa probei luat n analiz. Codificarea metodelor ITEX/GC-MS testate n funcie de parametrii variai, s-a fcut dup cum urmeaz: a) T = 30oC t = 40min. b) T = 40oC t = 40min. c) T = 60oC t = 30min. d) T = 60oC t = 30min. e) T = 60oC t = 10min. f) T = 60oC t = 10min. g) T = 60oC t = 5min. pompri = 20 pompri = 20 pompri = 20 pompri = 20 pompri = 20 pompri = 30 pompri = 20
VII

m = 1g m = 1g m = 1g m = 0,50g m = 0,50g m = 0,50g m = 0,15g

ITEXT30t40s20m1 ITEXT40t40s20m1 ITEXT60t30s20m1 ITEXT60t30s20m0.5 ITEXT60t10s20m0.5 ITEXT60t10s30m0.5 ITEXT60t5s20m0.15

h) T = 75oC t = 15min. i) T = 85oC j) T = 95oC t = 15min. t = 15min.

pompri = 20 pompri = 20 pompri = 20

m = 0,50g m = 0,25g m = 0,15g

ITEXT75t15s20m0.5 ITEXT85t15s20m0.25 ITEXT95t15s20m0.15

Ceilalia parametrii ai metodelor de extracie ITEX au fost : temperatura siringii: 60oC; viteza de agitare 500 rpm; volumul extras 1000 L; viteza de extracie 100 L/s; temperatura de desorbie 200oC; temperatura de curare a trapei 250oC; timpul de curare a trapei 2 min. Fibra ITEX utilizat pentru extracia compuilor volatili a fost o fibr ITEX-II Trap (G23)-SilicoNert 2000, Tenax TA 80/100 mesh, ea. Dup incubare, 250 L din faza de headspace a fiolei cu prob au fost introdui n injectorul gaz-cromatografului i analizai folosind metoda MEOR1.

I.2. REZULTATE I DISCUII

I.2.1. Rezultate i discuii privind analiza GC-MS a uleiului volatil de rozmarin

Dintre cele cinci programe de temperatur a coloanei descrise la capitolul I.1.2.2., cele mai bune rezultate, n ceea ce privete numrul de compui separai, separarea i rezoluia picurilor, precum i timpul de analaiz (35 de minute), s-au obinut cu metoda MEOR1. Principalii constitueni ai uleiului volatil de rozmarin din probele R2004-aug07, R2004-mar08 i R2004-oct08 sunt: -pinenul (31,71-33,67%), camforul (15,68-17,12%), eucaliptolul (8,39-9,35%), camfenul (6,15-6,77%), borneolul (5,89-7,74%), 3-octanona (3,804,37%), -mircenul (3,283,53%), limonenul (4,00-4,26%), o-cimen (2,52-3,62%). Aceiai compui majoritari i n aproximativ aceeai concentraie au fost identificai i n celelalte probe supuse analizei: R2005, R2006 i R2007. Printre compuii secundari identificai n probele analizate se numr: trans-verbenolul, 3-octanolul, -felandrenul, -terpineolul, verbenona, acetatul de bornil, -terpinen, cariofilenul i -cariofilenul. Lund n considerare ariile picurilor corespunztoare celor trei compui principali ai uleiului de rozmarin, se obine urmtorul raport: -pinen:camfor:eucaliptol 2:1:0,6, acest raport putnd fi utilizat ca marker n autentificarea uleiului volatil de rozmarin

VIII

provenit din sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca. Alte dou rapoarte care se pstreaz aproximativ constante n cazul tuturor probelor analizate, sunt cel dintre 3-octanon i 3-octanol, a crui valoare este de cuprins ntre 18 -21, i cel dintre eucaliptol i limonen care este cuprins ntre 1,7 -2,7. Comparativ cu datele de literatur referitoare la compoziia uleiului volatil de rozmarin din diferite regiuni geografice, n probele provenite din sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca se pot evidenia civa compui care ar putea fi considerai ca markeri specifici ai acestora precum 3-octanona, prezent ntr-o concentraie relativ ridicat n probele analizate (3,80-6,30%), sau ali compui minoritari precum 3-octanolul sau trans-verbenonul. 3-octanona i 3-octanolul nu sunt prezeni nici n compoziia uleiului volatil de rozmarin din: regiunea Sardiniei, Italia, Algeria, Turcia, Grecia, Spania, Japonia ser, Frana, Portugalia, Tunisia. n schimb, 3-octanona a fost identificat n uleiul volatil de rozmarin din Iran, ns ntr-o concentraie mult mai mic. n figura 1 este prezentat coninutul mediu n principalii compui ai uleiului volatil de rozmarin din sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca (pinen, camfor i eucaliptol), n raport cu cel regsit n uleiuri volatile de rozmarin provenite din alte regiuni geografice. Dup cum se poate observa, raportul acestor compui este caracteristic uleiului volatil de rozmarin provenit din sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca. Totodat, n datele de literatur studiate, nici un alt ulei volatil de rozmarin nu are concentraia de -pinen cuprins ntre 30-40%.

IX

60

50

Concentration, %

Concetratia, %

40

30

20

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Regiunea geografica G e og rap hic re gio n

Legenda: 1-Romnia (Cluj); 2- Brazilia; 3-Frana (regiunea sudic); 4- Italia (Sardinia); 5-Portugalia; 6Spania (Aragon); 7-Algeria; 8-Iran; 9-Tunisia; 10-Grecia (Atena); 11-Grecia (Creta); 12-Turcia (Izmir); 13-Turcia (Mersin); 14-Turcia (Cannakkale)

Figura 1. Variaia concentraiei de -pinen (), camfor ()i eucaliptol () n funcie de regiunea geografic

I.2.2. Rezultate i discuii privind analiza HS/GC-MS a compuilor volatili din rozmarin

I.2.2.1. Optimizarea metodei de analiz HS/GC-MS n vedera optimizrii extraciei compuilor volatili din rozmarin s-au variat diferii parametrii, conform metodelor descrise la capitolul I.1.2.3. Numrul de compui separai, respectiv identificai din proba de frunze uscate de rozmarin (R2007-oct08) variaz n funcie de metoda de headspace utilizat. Prin compararea rezultatelor obinute cu metoda HS3, n care timpul de incubare a fost de 40 de minute i metoda HS4 n care timpul de incubare a fost de 30 de minute, se poate constata c mrirea timpului de incubare nu duce la o cretere a numrului de compui separai, n ambele cazuri fiind separat acelai numr de compui volatili, i n aproximativ aceeai concentraie (figura 2).

Figura 2. Cromatograma HS/GC-MS pentru proba de frunze uscate de rozmarin incubate la 60oC timp de 40 de minute (HS3), respectiv 30 de minute (HS4)

Un alt parametru variat a fost masa de prob supus incubrii. S-a constatat c pentru acelai timp i temperatur de incubare, se separ un numr mai mare de compui dac masa de prob este mai mic. Astfel, folosind metoda HS5, n care s-a analizat o prob de 1g, au fost separai 18 compui, n timp ce pentru o prob de 0,5g (metoda HS6) au fost separai 19 compui. Prin urmare, micornd masa de prob incubat, scade concentraia de -pinen din faza de headspace a fiolei, putnd fi astfel detectai compui minoritari precum -linaloolul. Cea mai mare influen asupra numrului de compui volatili separai o are ns temperatura de incubare (figura 3). Din proba de rozmarin incubat la 30oC au fost separai i identificai 4 compui, i anume: -pinenul, camfenul, 3-octanona i eucaliptolul, ceea ce sugereaz faptul c aceti compui sunt constituenii cei mai volatili ai rozmarinului fiind responsabili de aroma i mirosul caracteristic perceput de om. La temperatura de incubare de 40oC ncep s se extrag n faza gazoas noi compui volatili, precum: -pinenul, -mircenul, o-cimenul i limonenul. Dac incubarea probelor de rozmarin se face la 60oC sunt extrai i -felandrenul, -terpinenul, -terpinen i camforul. In cazul incubrii probelor de frunze uscate de rozmarin la temperaturi de 95oC (HS9), 7 noi compui au fost separai fa de cazul n care probele au fost incubate la temperatura de 80oC, i anume: 1-octen-3-ol, alfa-terpineol, ylangen, cariofilen, alfacariofilen i doi compui neidentificai. Prin urmare, mrind temperatura de incubare, att

XI

timpul de incubare ct i masa de prob supus incubrii pot fi reduse considerabil (metoda HS4 i HS5, respectiv HS4 i HS6).
30

Numar compusi separati Number of separated compunds

25

20

15

10

5 30 40 50 60 70 80 90 o o Temperatura de incubare, C (Incubation temperature, C ) 100

Figura 3. Influena temperaturii de incubare asupra numrului de compui separai

I.2.2.2. Evidenierea compuilor uor volatili din frunze i ulei volatil de rozmarin prin incubare la 40oC Compuii volatili majoritari ai probelor de frunze uscate de rozmarin incubate la 40oC sunt: -pinenul (65,64 - 67,27%), camfenul (12,72 14,44%) i -pinenul (3,48 4,41%). n concentraii considerabile se regsesc i o-cimenul (2,94 4,12%) i mircenul (3,12 3,84%). Faptul c la temperatura de incubare de 40oC, att n probele de frunze uscate ct i n cele de frunze verzi, a fost separat i identificat 3-octanona, ntro concentraie de ~1,2 -3%, demonstreaz faptul c 3-octanona este un compus volatil caracteristic rozmarinului cultivat n sera Departamentului de Fitotehnie a USAMV Cluj, i prin urmare poate fi utilizat n autentificarea acestuia. In urma incubrii probelor de ulei volatil de rozmarin la aceiai temperatur ca probele de frunze uscate de rozmarin (40oC), dar pentru un timp mai scurt (15 minute), sau separat i identificat 22 de compui. Compuii majoritari identificai pentru probele de ulei volatile sunt: -pinenul (60,32 - 62,18%), camfenul (9,25 11,08%) i eucaliptolul (5,83 7,06%), urmai de 3-octanona (2,62 4,15%), camfor (3,10 3,91%), -mircen (2,73 3,13%) i -pinen (2,10 2,90%). Analiznd comparativ compoziia celor dou categorii de probe (frunze uscate i ulei volatil), incubate la 40oC, se poate constata o uoar scdere a contribuiei XII

pinenului, camfenului i -pinenului i o cretere a contribuiei eucaliptolului, camforului i 3-octanonei la mirosul caracterisc al uleiului volatil de rozmarin (figura 4).

13.9% 4.11% 1.75% 2.65% 0.54%

10.3%

2.55%

3.29% 6.48% 3.61%

10.8% 66.3%

12.5% 61.3%

a)

b)

Figura 4. Contribuia compuilor volatili separai la mirosul caracteristic frunzelor uscate de rozmarin (a), respectiv uleiului volatil de rozmarin (b): -pinen; camfen; -pinen; 3-octanona; eucaliptol; camfor; ali compui.

I.2.2.3. Evidenierea compuilor uor volatili din frunze i ulei volatil de rozmarin prin incubare la 85oC Constituenii volatili majoritari extrai din probele de frunze uscate de rozmarin incubate la 85oC, sunt: -pinenul (50,22 54,68%), camfenul (7,83-9,38%) i -mircenul (5,67-7,16%), urmai de 3-octanona (3,76-6,17%), , limonenul (4,87-5,27%), eucaliptolul (4,49-6,10%), o-cimen (3,44 4,52%). Se poate observa c odat cu creterea temperaturii de incubare de la 40oC la 85oC se modific i compuii majoritari ai probelor de frunze uscate de rozmarin, -pinenul fiind acum cuantificat ca i compus minoritar. Totui n compoziia frunzelor uscate de rozmarin a fost identificat att 3-octana ct i 3-octanolul, considerai de noi ca fiind compui marker pentru rozmarinul provenit din sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca. Analiznd prin aceeai metod probele de ulei volatil de rozmarin, au fost separai 35-40 de compui, comparativ cu cei 26-29 de compui extrai i separai din frunzele uscate de rozmarin. Principalii constitueni ai celor patru probe de ulei volatil de

rozmarin analizate sunt: -pinenul (31,7034,70%), camforul (16,2217,12%) i eucaliptolul (9,0011,36 %) urmai de camfen (5,476,98 %), 3-octanona (4,01-6,56%), borneol (4,175,18%), limonen (4,474,83%) i -mircen (3,443,95%). Cantitatea cea

XIII

mai mare de 3-octanon la fel ca n cazul analizei GC-MS a fost regsit n proba cea mai tnr, R2007-oct08. mpreun cu 3-octanona a fost identificat i 3-octanolul, raportul dintre aceti doi compui marker fiind ns mai mare dect cel regsit n analiza GCMS a probelor de ulei volatile de rozmarin. Totodat trebuie remarcat faptul c utiliznd tehnica HS/GC-MS, raportul dintre cei trei compui majoritari -pinen:camfor:eucaliptol rmne de aproximativ 2:1:0,6, la fel ca i n cazul analizei GC-MS a probelor de ulei volatil. De asemenea, raportul dintre eucaliptol i limonen se ncadreaz i el ntre valorile obinute la analiza GC-MS (1,7-2,7).

I.2.3. Rezultate i discuii privind analiza ITEX/GC-MS a compuilor volatili din rozmarin

Primul parametru, a crui influen, asupra extraciei compuilor volatili din rozmarin, a fost studiat, este masa de prob supus analizei. Astfel, utiliznd metodele ITEXT60t30s20m0.5 i ITEXT60t30s20m1, a fost analizat n aceleai condiii o prob de frunze uscate de rozmarin R2007-oct08 cu masa de 0,5g i o prob cu masa de 1g. Pentru proba cu masa de 0,5g au fost separai 9 compui n timp ce pentru proba cu masa de 1g au fost separai 12 compui. Prin urmare, dublarea masei de prob nu are ca rezultat o cretere considerabil a numrului de compui separai. Totodat, n cazul probei de 1g concentraia -pinenului (49,97%) este aproape dubl fa de cazul probei de 0,5g. O concentraie ridicat de -pinen n faza de headspace poate duce la o acumulare a acestuia n fibra adsorbant care s conduc fie la saturarea detectorului, fie la mascarea unor constitueni minoritari prezeni n rozmarin. Influena timpului de incubare asupra extraciei compuilor volatili din proba R2007-oct08 se poate observa prin compararea rezultatelor obinute cu metodele ITEXT60t5s20m0.5, ITEXT60t10s20m0.5 i ITEXT60t30s20m0.5. Astfel, se poate constata c la o cretere semnificativ a timpului de incubare, de la 5 la 30 de minute, numrul de compui separai crete doar de la 7 la 9. Mai mult, ntre metoda cu timpul de incubare de 10 minute i cea cu timpul de incubare de 30 de minute nu exist nici o diferen n ceea ce privete numrul de compui separai (figura 5).

XIV

9.0

Numar compusi separati Number of separated compounds

8.5

8.0

7.5

7.0

10

15

20

25

30

Timp (min.) Time (min.)

Figura 5. Influena timpului de incubare asupra numrului de compui separai Un alt parametru, cu un rol important n optimizarea metodei ITEX/GC-MS a fost numrul de pompri din faza de headspace. n acest sens, temperatura de incubare (60oC), timpul de incubare (10 min) i masa de prob (0,5g) au fost pstrate constante, variinduse numrul de pompri efectuate de fibra adsorbant (metodele ITEXT60t10s20m0.5 i ITEXT60t10s30m0.5). Dac n cazul metodei n care s-au efectuat 20 de pompri din faza de headspace au fost separai 9 compui, pentru metoda n care s-au realizat 30 de pompri din faza de headspace au fost separai 14 constitueni. Prin urmare, realizndu-se un numr mai mare de pomprii, sunt concentrai, n materialul adsorbant al fibrei, compui a cror concentraie n faza de headspace este mai mic, precum cei patru noi compui identificai n cazul n care proba a fost analizat cu metoda

ITEXT60t10s30m0.5: -pinenul, -felandrenul, -terpinenul i -terpinenul. n ceea ce privete influena temperaturii de incubare asupra extraciei compuilor volatili din rozmarin, dup cum se poate observa din figura 6 odat cu creterea

temperaturii de incubare se volatilizeaz un numr tot mai mare de compui din rozmarin care sunt adsorbii n materialul adsorbant al fibrei. Astfel, chiar dac masa i timpul de incubare scad, o cretere a temperaturi de incubare duce la o cretere a numrului de compui separai. De exemplu, utiliznd metoda ITEXT40t40s20m1 au fost separai 11 compui, n timp ce utiliznd metoda ITEXT75t15s20m0.5 sau ITEXT95t15ms200.15 au fost separai 15 respectiv 24 de compui. Totui, se constat, c peste un anumit prag al temperaturii de incubare, creterea numrului de compui separai nu mai este att de mare.

XV

25

Numar compusi separati Number of separated compounds

20

15

10

5 30 40 50 60 70 80 90 100

Temperatura , oC (Temperature, oC)

Figura 6. Influena temperaturii de incubare asupra numrului de compui separai Variaia numrului de compui separai n funcie de metoda i tehnica de analiz este prezentat n figura 7. Dup cum se poate observa, pentru temperaturi mici de incubare, 30-40oC, tehnica ITEX ofer posibilitatea identificrii unui numr mai mare de compui volatili dect tehnica HS. Acest lucru se datoreaz tocmai posibilitii de

mbogire a fibrei adsorbante n compui care se gsesc n concentraie redus n faza de headspace a fiolei. Pe msur ce temperatura de incubare crete, 60-95oC, numrul de compui separai cu tehnica ITEX este mai mic dect cel obinut folosind tehnica HS. Totui, trebuie inut cont de faptul c numrul de pompri pentru metodele ITEX este de 20. Mrindu-se numrul de pompri, aa cum s-a menionat anterior, se pot evindeia noi constitueni volatili ai rozmarinului. Prin urmare, este necesar n continuare optimizarea tehnicii ITEX n vederea gsirii raportului optim ntre temperatura de incubare i numrul de pompri, pentru obinerea unei metode ct mai eficiente pentru determinarea constituenilor volatili ai rozmarinului.

XVI

28

28

24

30

23

25 20

19

15 12 13 11 8 8

15 10 5 0

Tem per 90 80 atu ra d 70 0 Incu e in 6 bati cub on t 50 are o 40 em per , C atu r e, o C

0 10

4 HS ITEX
30

Figura 7. Inluena metodei i tehnicii de analiz utilizate asupra numrului de compui volatili separai

II. EVALUAREA COMPOZIIEI ULEIULUI VOLATIL DE HAMEI PRIN OPTIMIZAREA UNOR TEHNICI DE TIP GC

II.1. MATERIAL I METODE

II.1.1. Probele de hamei

Pentru determinarea variabilitii compoziionale a uleiului volatil de hamei n funcie de soi i de modulul de procesare a conului de hamei, s-au ales patru soiuri de hamei, dou aromate (Huller Bitterer i Perle) i dou amare (Magnum i Brewers Gold), cultivate n arealul pedo-climatic al Sighioarei, o zon cu tradiie n cultura hameiului, n fermele Saschiz i Seleu, judeul Mure. Din fiecare din aceste patru soiuri de hamei au fost prelevate trei tipuri de probe: hamei floare (conuri de hamei ajunse la maturitatea tehnologic care dup recoltare au fost uscate timp de 48 de ore la temperatura camerei), hamei uscat (hamei floare uscat n instalaiile fermelor Saschiz i Seleu) i hamei pelei tip 90, obinui n instalaia de peletizare de la ferma Seleu.

XVII

Numar compusi separati Number of separa ted compounds

II.1.2. Metode de analiz

II.1.2.1. Extracia uleiului volatil Extracia uleiului volatil din probele de hamei s-a realizat prin hidrodistilare, dup cum urmeaz: o cantitate de aproximativ 50 g conuri, respectiv pelei de hamei mcinai au fost introduse mpreun cu 700 ml ap distilat n balonul de distilare al instalaiei de dozare a uleiurilor volatile din produse vegetale. n balonul de distilare au fost adugate i cteva bile de sticl n vederea omogenizrii fierberii. Materialul vegetal a fost supus distilrii timp de 3h. La sfritul distilrii, uleiul volatil de hamei a fost colectat i msurat volumul obinut. Codificarea probelor de ulei volatil de hamei s-a fcut n modul urmtor: - BG-Feo - ulei volatil de hamei obinut din conuri de hamei floare, soiul Brewers Gold; - BG-Ueo - ulei volatil de hamei obinut din conuri uscate de hamei, soiul Brewers Gold; -BG-Peo - ulei volatil de hamei obinut din pelei de hamei, soiul Brewers Gold; - MG-Feo - ulei volatil de hamei obinut din conuri de hamei floare, soiul Magnum; - MG-Ueo - ulei volatil de hamei obinut din conuri uscate de hamei, soiul Magnum; - MG-Peo - ulei volatil de hamei obinut din pelei de hamei, soiul Magnum; - PR-Feo - ulei volatil de hamei obinut din conuri de hamei floare, soiul Perle; - PR-Ueo - ulei volatil de hamei obinut din conuri de hamei floare, soiul Perle; - PR-Peo - ulei volatil de hamei obinut din pelei de hamei, soiul Perle; - HB-Feo - ulei volatil de hamei obinut din conuri de hamei floare, soiul Huller Bitterer; - HB-Ueo - ulei volatil de hamei obinut din conuri de hamei floare, soiul Huller Bitterer; - HB-Peo - ulei volatil de hamei obinut din pelei de hamei, soiul Huller Bitterer. II.1.2.2. Analiza GC-MS a uleiurilor volatile de hamei Analiza probelor de hamei i de ulei esenial de hamei prin cele trei tehnici utilizate (GC-MS; HS/GC-MS i ITEX/GC-MS) s-a fcut cu ajutorul unui aparat GC-MS QP-2010 Schimadzu, echipat cu un autosampler AOC-5000 (CombiPAL). Coloana utilizat pentru separarea constituenilor uleiurilor volatile a fost o coloan capilar Alltech, USA, AT-5 de 30m cu diametrul intern de 0,25mm i grosimea filmului de 0,25m. Datele au fost achiziionate cu ajutorul softului aparatului, iar identificarea

XVIII

compuilor s-a realizat prin comparaea spectrelor de mas obinute cu cele din bibliotecile de date a softului (NIST147 i NIST27). Programele de temperatur testate pe coloana cromatografic n vederea obinerii unei separri ct mai bune a compuilor uleiului volatil de hamei, au fost urmtoarele: a) 60oC (3min) cu 1,5/min la 150oC (5min) b) 60oC (3min) cu 3/min la 150oC (10min) meoh2split100 meoh3split100

c) 60oC (3min) cu 2/min la 100oC; cu 5/min la 130oC; cu 3/min la 200oC (5min) meoh4split100 d) 60oC (3min) cu 3/min la 100oC; cu 2/min la 160oC (5min) e) 60oC (3min) cu 4/min la 100oC; cu 1/min la 150oC (5min) f) 60oC (3min) cu 4/min la 100oC; cu 0,5/min la 150oC (5min) g) 60oC (3min) cu 2/min la 100oC; cu 1/min la 150oC (5min) h) 60oC (3min) cu 3/min la 100oC; cu 0,2/min la 120oC (10min) i) 60oC (3min) cu 10/min la 100oC; cu 0,2/min la 120oC (10min) meoh5split100 meoh6split100 meoh7split100 meoh8split200 meoh9split100 meoh11split100

Ceilali parametrii ai metodelor de analiz a fost: temperatura injectorului 250.0oC; presiunea 93,1 kPa; debit coloan 1,5ml/min; viteza liniar 44,7 cm/s; detector MS; temperatura sursei ionice 250.0oC; temperatura de interfa 250.0oC; MS mode EI, intervalul de scanare 50-400u; viteza de scanare 769u/s.

II.1.2.3. Analiza HS/GC-MS a hameiului i uleiurilor volatile de hamei n ceea ce privete optimizarea metodei de extracie a compuilor volatili din peleii de hamei prin tehnica headspace, aceasta s-a realizat prin variaia masei de prob incubate, a temperaturii i timpului de incubare, dup cum urmeaz: a) m = 1g b) m = 0,25g c) m = 0,15g d) m = 0,15g e) m = 0,15g f) m = 0,15g g) m = 0,15g h) m = 0,15g T = 60oC T = 80oC T = 80oC T = 80oC T = 80oC T = 95oC T = 95oC T = 110oC t = 30 min t = 15 min t = 15 min t = 30 min t = 45 min t = 30 min t = 15 min t = 15 min HShT60t30m1 (HSh1) HShT80t15m0.25 (HSh2) HShT80t15m0.15 (HSh3) HShT80t30m0.15 (HSh4) HShT80t45m0.15 (HSh5) HShT95t30m0.15 (HSh6) HShT95t15m0.15 (HSh7) HShT110t15m0.15 (HSh8)

XIX

i) m = 0,15g

T = 150oC

t = 15 min

HShT150t15m0.15 (HSh9)

Din probele incubate s-a prelevat un volum de 250L care a fost injectat in injectorul gaz-cromatografului i supus analizei GC-MS.

II.1.2.4. Analiza ITEX/GC-MS a hameiului Utilizarea tehnicii ITEX a avut ca scop evidenierea unor compui volatili minoritari din hamei care n-au putut fi pui n eviden cu tehnica GC-MS sau HS/GCMS. Datorit posibilitii de a realiza mai multe pompri din faza de headspace a propbei incubate, tehnica ITEX ofer posibilitatea determinrii de compui care se afl n concentraii foarte mici n matricea de analizat, prin concentrarea acestora n materialul adsorbant al fibrei i apoi desorbia lor n injectorul gaz-cromatografului. Pentru optimizarea metodei de extracie ITEX a compuilor volatili din hamei s-au luat n studiu probele de pelei a probei PR-Pn dar i a celorlalte trei soiuri de hamei de analizate i prin tehnica HS/GC-MS. Masa probei de analiz luat n studiu a fost pstrat constant, variindu-se temperatura de incubare, timpul de incubare i numrul de pompri din faza de headspace a fiolei cu prob. Parametrii metodelor testate i codificarea acestora a fost urmtoarea: a) T = 60oC b) T = 60oC c) T = 60oC d) T = 80oC e) T = 95oC f) T = 110oC t = 5 min. t = 10 min. t = 15 min. t = 15 min. t = 15 min. t = 15 min. pompri = 20 pompri = 20 pompri = 30 pompri = 30 pompri = 30 pompri = 30 ITEXhT60t5s20 ITEXhT60t10s20 ITEXhT60t15s30 ITEXhT80t15s30 ITEXhT95t15s30 ITEXhT110t15s30

Fibra ITEX i ceilali parametrii ai metodelor de extracie ITEX au fost aceiai cu cei menionai n capitolul I.1.2.4. Dup incubare, 250 L din faza de headspace a fiolei cu prob au fost introdui n injectorul gaz-cromatografului i analizai folosind metoda meoh3split100MS.

XX

II.2. REZULTATE I DISCUII

II.2.1. Rezultate i discuii privind analiza GC-MS a uleiului volatil de hamei Separarea compuilor prezeni n uleiului volatil de hamei se realizeaz cel mai bine n cazul utilizrii metodei meoh3split100. De asemenea, timpul de analiz pentru metoda meoh3split100 este de 43 de minute (cel mai scurt timp de analiz), fa de 128 de minute n cazul meoh8split100, 68 de minute pentru meoh6split100 sau 57 pentru meoh4split100. Acest lucru este foarte important n economia unei analize, n zilele noastre tendina fiind de a se obine rezultate ct mai exacte ntr-un timp ct mai scurt i cu o prelucrare minim a probei de analizat. Metoda meoh3split100 a fost n continuare optimizat modificndu-se i intervalul de scanare de la 0,50 secunde la 0,20 secunde, viteza de scanare modificndu-se corespunztor de la 769 la 2000. Principalii constitueni ai uleiului volatil de hamei provenit de la soiurile aromate sunt: -mircenul (48,0369,23%), urmat de -cariofilen (12,05-35,10%), -cariofilen (5,59-9,52%). n concentraii apreciabile se regsesc i compui precum -selinenul, guaienul, alloaromadendrenul, -cadinenul sau -panasinenul. Pentru probele de ulei volatil extrase din soiurile amare de hamei, compuii majoritari au fost aceiai ca n cazul soiurilor aromate, concentraiile acestora variind dup cum urmeaz: -mircenul (42,95-67,99%), -cariofilenul (18,4141,89%), cariofilenul (6,8711,61%). n schimb concentraiile -selinenului, -guaienului, cadinenului, -muurolenului sunt mult mai mici fa de cele prezente n soiurile aromate, iar compui precum alloaromadendrenul, -panasinenul sau -elemenul nu au putut fi evideniai n soiurile amare. Prin urmare, aceti compui pot fi utilizai ca i compui marker n discriminarea soiurilor aromate de cele amare. n soiurile amare, i n special n soiul BG, a fost separat i identificat cu ajutorul librriilor de spectre, un nou compus, i anume -cis-ocimenul. De asemenea, n ceea ce privete compuii minoritari, soiurile amare sunt caracterizate de un coninut mai ridicat n -pinen i metil nerolat fa de soiurile aromate. n toate cazurile concentraia cea mai mic de mircen a fost regsit n probele de ulei volatil extrase din pelei, iar cea mai mare (cu excepia soiului HB) n probele de ulei

XXI

volatil extrase din conurile de hamei floare. Aceast variaie poate fi uor explicat n funcie de modul de prelucrare al conurilor de hamei. Astfel, datorit uscrii conurilor n instalaia de uscare sau peletizrii lor, are loc volatilizarea mircenului din conurile de hamei, n timp ce n cazul conurilor de hamei floare, uscrea lor s-a fcut la temperatura camerei timp de 48 de ore, i prin urmare volatilizarea mircenului nu are loc ntr-o aa de mare msur. Pierderea cea mai mare de mircen, n urma prelucrrii conului de hamei, a fost observat n cazul soiului Perle, cnd de la o concentraie de 68,72% n uleiul volatil extras din conurile floare s-a ajuns la o concentraie de 48,03% pentru uleiul volatil extras din pelei. Cel mai puin afectat soi, n ceea ce privete coninutul de -mircen, este soiul Brewers Gold, pentru care concentraia acestui compus scade de la 67,99% n uleiul volatil extras din conurile floare la doar 62,11% pentru uleiul volatil extras din pelei.

II.2.2. Rezultate i discuii privind analiza HS/GC-MS a compuilor volatili din hamei

II.2.2.1. Optimizarea metodei de analiz HS/GC-MS Avnd n vedere c principalul component al uleiului volatil de hamei, -mircenul, se afl ntr-o concentraie foarte mare (40-70%) n probele analizate prin tehnica GC-MS, pentru a putea vizualiza i ceilali compui volatili din proba de pelei de hamei, s-a recurs la variaia voltajului detectorului pe parcursul analizei. Astfel, n intervalul de timp 7,50 8,00 n care apare picul corespunztor -mircenului s-a micorat sensibilitatea detectorului i s-a mrit n afara acestui interval. Metoda meoh3split100 astfel modificat a fost codificat ca meoh3split100MS. Prin urmare, concentraia de -mircen rezultat nu este cea real, ns avnd n vedere c pentru toate metodele de extracie, cu excepia metodei HSh1 i HSh2, analiza GC-MS s-a realizat folosind aceeai metod (deci aceeai variaie a sensibilitii detectorului), datele obinute pot fi comparate unele cu altele. Pentru extracia compuilor volatili din peleii de hamei cu HSh1, respectiv HSh2, proba s-a analizat cu metoda meoh3split100, fr a varia sensibilitatea detectorului pe parcursul analizei. Dac se compar rezultatele obinute pentru aceeai mas de prob i temperatur de incubare, se constat c mrind timpul de incubare nu are loc o extracie mai bun.

XXII

Mai mult, pe msur ce crete perioada de incubare, numrul de compui separai scade. De exemplu, n cazul n care incubarea s-a fcut folosind metoda HSh3 (15 minute de incubare) sau HSh4 (proba incubat 30 de minute) s-au separat 20 de compui, n timp ce folosind metoda HSh5 n care proba a fost incubat timp de 45 de minute s-au separat doar 18 compui (figura 8). Acest lucru se poate datora faptului c mrind timpul de incubare peste un anumit prag n faza de headspace se acumuleaz compui care se gsesc ntr-o concentraie mai ridicat n hamei i a cror temperatur de volatilizare este mai apropiat de temperatura de incubare, picurile lor mascnd n acest fel picurile corespunztoare unor compui minoritari precum beta-cis-ocimen sau copaen.

20.0
Number of separated compounds

Numar compusi separati

19.5

19.0

18.5

18.0

15

20

25

30

35

40

45

Timpul de incubare (min.)

Incubation time (min.)

Figura 8. Influena timpului de incubare asupra numrului de compui separai Dintre cei trei parametrii variai (masa de prob, temperatura de incubare i timpul de incubare) cea mai mare influen asupra extraciei compuilor volatili din hamei o are temperatura de incubare (figura 9). Astfel, comparnd rezultatele obinute pentru cele nou metode de HS testate, cei mai muli compui sunt extrai din proba incubat la temperaturi ridicate (110oC, respectiv 150oC). n cazul n care 1g de proba de pelei este incubat la 60oC timp de 30 de minute sunt extrai i identificai 8 compui, n timp ce pentru o prob cu mas mai mic (0,25g), incubat un timp mai scurt (15min), dar la o temperatur mai mare (80oC) au fost identificai 12 compui. Pe msur ce incubarea se realizeaz la temperaturi mai ridicate, crete i numrul de compui separai. Astfel, la incubarea probei la 110oC s-au separat 33 de compui, n timp ce pentru probele incubate la 150oC numrul de compui separai crete considerabil ajungnd la 64. Nu este exclus

XXIII

ns faptul ca la temperaturi ridicate de incubare, cum este cea de 150oC, pe lng compuii volatili caracteristici hameiului s apar i compui de oxidare ai acestora.

Figura 9. Cromatograma HS/GC-MS pentru o prob de 0,15g PR-P, incubat timp de 15 minute la diferite temperaturi

II.2.2.2. Evaluarea comparativ a variabilitii aromei peletilor cu cea a uleiului volatil utiliznd tehnica HS/GC-MS Utiliznd metoda de extracie HShT110t15m0.15 (HSh8), s-au analizat comparativ probele de pelei (din ambalaj care a fost desfcut P i din amabalaj care a fost desfcut numai nainte de efectuarea analizei Pn ) i de ulei volatil extras din pelei (Peo), provenite de la cele patru soiuri de hamei: Perle, Huller Biterer, Brewers Gold i Magnum. n ceea ce privete coninutul de mircen din soiurile analizate, variaia acestuia n funcie de soi i de modalitatea de prelucrare a probei (pelei sau ulei volatil) este prezentat n figura 10. Dup cum se poate observa, cea mai mare concentraie de mircen s-a regsit n probele de pelei nedesfcui, urmat de probele de pelei i de cele de ulei volatil extras din pelei. Dac se analizeaz variaia concentraiei de -mircen n funcie de soi, cea mai mare concentraie a fost regsit la soiul Brewers Gold (BG), urmat de Perle, Huller Bitterer i Magnum, n aceeai ordine ca n cazul analizei GC-MS a uleiurilor volatile extrase din conuri de hamei floare, uscate i pelei.

XXIV

Figura 10. Variaia coninutului de -mircen n funcie de soi n probele de pelei i ulei volatil de hamei analizate prin HS/GC-MS cu metoda meoh3split100

n urma analizei HS/GC-MS, utilznd metoda meoh3split100MS, a probelor de hamei de tip Pn au fost separai 42 de compui volatili pentru proba aparinnd soiului Perle, 44 pentru soiul Huller Bitterer, 53 pentru soiul Brewers Gold i 38 pentru soiul Magnum. n cazul probelor de pelei desfcui (P) au fost separai 34 de compui volatili pentru soiul Perle, 50 pentru soiul Huller Bitterer, 43 pentru soiul Brewers Gold i 40 pentru soiul Magnum. Constituenii majoritari, pe lng mircen, identificai n ambele tipuri de probe de pelei, pentru toate cele patru soiuri analizate, au fost: - i -cariofilenul, -pinenul, limonenul, 2-metilbutilisobutirat i linaloolul. Alturi de acetia, n soiurile aromate s-au regsit ntr-o concentraie mai mare dect n cele amare copaenul, -muurolenul, selinenul, -guaienul, - i -cadinenul, germacren D. De remarcat este faptul c pentru soiurile aromate au fost separai i identificai, la fel ca i n cazul analizei GC-MS, compui care nu apar n cele amare. Astfel, aromadendrenul, -panasinenul, -elemenul au fost regsii doar n soiul Perle i Huller Bitterer, n timp ce alloaromadendrenul apare i n proba de Pn provenit de la soiul Brewers Gold. n schimb, coninutul n -cisocimen este mai ridicat la soiurile amare dect la cele aromate. Soiul Brewers Gold, spre deosebire de celelalte soiuri conine o cantitate mult mai mare de de metil nerolat (2,43%). n soiurile amare, apare n plus fa de cele aromate, la timpul de retenie 6,279, camfenul, ntr-o concentraie mai mare n probele de pelei desfcui dect n cele de
XXV

pelei nedesfcui (0,09-0,014% la Brewers Gold i 0,06-0,08% la Magnum). Pentru probele de pelei desfcui provenite de la soiul Huller Bitterer i Magnum, a fost evideniat isoamil-propionatul (1-butanol-3-metil-propionatul), un compus de oxidare. Tot din categoria compuilor de oxidare, fac parte i izobutil izobutiratul, 2-metil-butilisobutiratul, 2-pentanol propanoatul, acid propanoic 2-meti-3metil-butil ester, acid propanoic 2-metil heptil ester, 2-metil-butil-2-metil butanoatul, metil heptanoatul, acid octanoic metil ester, etc., compui care au fost separai i identificai n ambele tipuri de probe de pelei. Uleiurile volatile extrase din probele de pelei au fost analizate prin tehnica HS/GC-MS, folosind aceeai metod de analiz ca n cazul probelor de pelei. Pentru uleiul volatil extras din peleii din soiul Perle au fost identificai 67 de constitueni, 76 pentru soiul Huller Bitterer, 50 pentru soiul Brewers Gold i 53 pentru soiul Magnum. Principalii constitueni ai uleiurilor volatile, pe lng mircen sunt: cariofilenul, humulenul, limonenul, linaloolul, - i - cadinenul, -muurolenul, -guaienul, selinenul, -pinenul, copaenul, aceiai compui majoritari fiind indentificai i n probele de pelei, pe lng acetia n cantiti considerabile regsindu-se oxidul de cariofilen i compusul neidentificat de la timpul de retenie 34,520. La fel ca i n cazul probelor de pelei analizate, n soiurile aromate au fost identificai compui care nu se regsesc n compoziia uleiurilor volatile provenite de la soiurile amare, i anume: -panasinenul, elemenul i aromadendrenul. Concentraiile -muurolenului, germacren D, copaenului, guaienului, -selinenului, - i - cadinenului sunt de asemenea mai mari pentru uleiurile volatile provenite de la soiurile aromate dect pentru cele provenite din soiurile amare. Att n cazul probelor de pelei ct i n cazul probelor de ulei volatil, pentru soiul Brewers Gold cantitatea de metil nerolat este de 3 pna la 11 ori mai mare fa de probele provenite de la celelalte soiuri luate n studiu. Cea mai mare cantitate de metil nerolat (4,42%) a fost regsit n proba de BG-Pn, urmat de proba de ulei volatil, BG-Peo (3,89%) i proba BG-P (2,43%).

XXVI

II.2.3. Rezultate i discuii privind analiza ITEX/GC-MS a compuilor volatili din hamei

n ceea ce privete influena timpului de incubare asupra extraciei compuilor volatili, din datele obinute se poate observa c o cretere a timpului de incubare de la 5 la 10 i apoi la 15 minute nu are ca rezultat i creterea numrului de compui volatili separai. Astfel, utiliznd metoda ITEXhT60t5s20, din proba PR-Pn, au fost separai 22 de compui, n timp ce utiliznd metoda ITEXhT60t10s20, au fost separai 20 de compui, iar pentru metoda ITEXhT60t15s30 au fost separai doar 17 compui volatili (figura 11). Acest lucru poate fi explicat prin faptul c mrindu-se timpul de incubare, cantitatea de mircen i a altor compui uor volatili, extras n faza de headspace a fiolei de analiz, crete, n fibr fiind, prin urmare, adsorbit o cantitate mai mare din aceti compui, n timp ce compuii care se volatilizeaz mai greu la temperatura de 60oC nu mai pot fi detectai.
22

Numar compusi separati Number of separated compounds

21

20

19

18

17 4 6 8 10 12 14 16

Timp incubare (min.) Incubation time (min.)

Figura 11. Influena timpului de incubare asupra numrului de compui volatili separai n cazul temperaturii de incubare, datele obinute arat c pe msur ce temperatura de incubare crete, crete i numrul de compui volatili separai. Dac n cazul utilizrii metodei ITEXhT60t15s30 a fost separai 17 compui, n cazul incubrii probelor incubate la 80oC i 95oC au fost separai 31, respectiv 52 (figura 12). Temperatura de incubare a fost ridicat i la 110oC, fiind separai 78 de compui volatili, dar la aceast temperatur detectorul aparatului s-a saturat, datorit cantitii mari de cariofilen acumulat n faza de headspace i care apoi a fost adsorbit n fibr.

XXVII

80 70 60 50 40 30 20 10 60 70 80 90

Numar compusi separati Number of separated compounds

Temperatura de incubare ( C) o Incubation temperature ( C)

100

110

Figura 12. Influena temperaturii de incubare asupra numrului de compui volatili separai Dac se compar datele obinute prin tehnica HS cu cele obinute prin tehnica ITEX, se poate observa foarte clar c tehnica ITEX ofer o extracie mult mai eficient a compuilor volatili (figura 13).

78

80

60

52

50 40

33 29 20

31

30 20 10 0

17

8
110

Temp e Incub

100

ratur

90

re ( oC ation ) temp eratu re ( oC )

a de

80

incub a

70

60

HS ITEX

Figura 13. Inluena metodei i tehnicii de analiz utilizate asupra numrului de compui volatili separai Prin urmare, comparativ cu tehnica HS, tehnica ITEX ofer rezultate mai bune n ceea ce privete determinarea compoziiei volatile a hameiului. Este totui necesar optimizarea n continuare a metodei ITEX avnd n vedere c pe lng timpul i
XXVIII

Numar compusi separati Number of separated compounds

70

temperatura de incubare pot fi optimizai i ali parametrii care joac un rol important n extracia i separarea compuilor volatili, i anume: numrul de pompri, viteza de adsorbie i viteza de desorbie a compuilor din fibr, temperatura de desorbie, etc.

III. ANALIZA CHEMOMETRIC A DATELOR

III.1. EVALUAREA STATISTIC A DATELOR LA ANALIZA COMPUILOR VOLATILI DIN ROZMARIN

Datele obinute n urma determinrii, cu ajutorul tehnicii GC-MS i HS/GC-MS, a compoziiei uleiurilor volatile de rozmarin, au fost analizate folosind metode de statistic multivariant, metode numerice de interpolare, sau analiza corespondenelor. n figura 14 este reprezentat grafic variaia compoziiei uleiului volatil de rozmarin n funcie de vrst i de perioada de recoltare. Dup cum se poate observa, majoritatea compuilor separai au concentraia cuprins n intervalul 0-5%. De asemenea, concentraiile principalilor componeni ai uleiului volatil de rozmarin se pstreaz n aceleai intervale: -pinen (30-35%), camfor (13-18%) i eucaliptol (7-11%), indiferent de vrsta de plantei sau de perioada de recoltare a acesteia. Unele diferene n compoziia uleiului volatil de rozmarin apar ns la nivelul compuilor minoritari. Avnd n vedere c recoltarea probelor de frunze de rozmarin, folosite pentru extracia uleiului volatil, s-a fcut la un interval de 6 luni (august 2007, martie 2008 i octombrie 2008), utiliznd metode numerice de interpolare i analiza corespondenelor sa estimat compoziia chimic a uleiului volatil de rozmarin n lunile intermediare celor n care s-a fcut recoltarea, inndu-se cont de compoziia global a celor 12 probe de ulei volatil de rozmarin (figura 15).

XXIX

Figura 14. Variaia numrului de compui separai i a concentraiei acestora pentru probele de ulei volatil de rozmarin analizate

Figura 15. Evoluia n timp a compoziie chimice a uleiului volatil de rozmarin extras din proba R2004 Astfel, n ceea ce privete compuii majoritari, pentru -pinen i camfor s-a constat o cretere a concentraiei odat cu vrsta, n timp ce pentru concentraia de eucaliptol a nregistrat o scdere. n decursul unui an, cantitatea cea mai mare de camfor

XXX

s-a estimat a fi n lunile de primvar, martie-aprilie. 3-octanona, compusul marker al uleiului volatil de rozmarin studiat, prezint concentraia cea mai ridicat n planta tnr, scznd apoi treptat pe parcursul unui an.

III.2. EVALUAREA STATISTIC A DATELOR LA ANALIZA COMPUILOR VOLATILI DIN HAMEI

Unul din obiectivele tezei de doctorat a constat n determinarea compoziiei volatile a hameiului i utilizarea acesteia pentru discriminarea diferitelor soiuri de hamei. Pentru realizarea acestui obiectiv s-a recurs la analiza statistic a datelor obinute n urma determinrii compoziiei volatile a hameiului i uleiului volatil de hamei, prin statistica multivariat care conine tehnici dedicate analizrii seturilor complexe de date, obinute n urma studiilor experimentale n care sunt urmrite, evaluate, msurate mai multe variabile. Complexitatea cercetrilor de acest tip este datorat nu att numrului mare de variabile, ct necesitii de a studia relaii simultane ntre mai multe variabile. Dendograma general pentru cele 12 tipuri de probe de ulei volatil, cte 3 din fiecare soi, este prezentat n figura 16, obinndu-se trei clustere. Primul cluster cuprinde probele de ulei volatil de hamei provenite de la cele dou soiuri aromate, i anume: PRFeo, PR-Ueo, PR-Peo, HB-Feo, HB-Ueo i HB-Peo. Al doilea cluster cuprinde probele provenite de la soiul Brewers Gold (BG-Feo, BG-Ueo i BG-Peo) i proba MG-Feo de la soiul Magnum, iar cel de al treilea cluster cuprinde probele de ulei volatil extrase din conurile uscate i din pelei din soiul Magnum. O diferen semnificativ se observ ntre probele de hamei floare sau uscat i cele de hamei peletizat, prin creterea distanei euclidiene dintre soiuri, ceea ce presupune modificarea markerilor de calitate n timpul prelucrrii.

XXXI

Figura 16. Dendograma obinut prin Cluster Analysis pentru uleiurile volatile de hamei analizate prin tehnica GC-MS Datele obinute prin tehnica HS/GC-MS a probelor de pelei (Pn i P) i ulei volatil (Peo) incubate la 110oC au fost de asemenea supuse analizei statistice. Metoda pstreaz clasificarea fcut pentru probele de ulei volatil analizate prin GC-MS, obinndu-se i n acest caz un grup de similitudine format din soiurile aromate Perle i Huller Bitterer. Un aspect foarte important care trebuie menionat este faptul c att n cazul n care s-a luat pentru analiza statistic compoziia uleiului volatil extras din din pelei ct i n cazul n care s-a folosit compoziia volatil a probelor ca atare de pelei incubate, s-a obinut aceeai clasificare.

CONCLUZII

n raport cu obiectivele studiului de fa se pot evidenia urmtoarele concluzii generale: In analiza compuilor volatili din rozmarin: 1. S-au optimizat trei metode de analiz a compoziiei uleiurilor volatile din rozmarin, bazate pe tehnicile GC-MS, HS/GC-MS i ITEX/GC-MS; 2. Componenii principali ai probelor de ulei volatil de rozmarin analizate cu metoda GC-MS optimizat sunt: -pinenul, camforul i eucaliptolul, urmai de camfen, 3octanona, -mircen, limonen, borneol, o-cimen;

XXXII

3. n urma analizei uleiului volatil de rozmarin, s-au identificat patru markeri ce pot fi utilizai n autentificarea uleiului volatil de rozmarin provenit din sera Departamentului de Fitotehnie a USAMV Cluj : a. Raportul dintre cei trei compui principali ai uleiului de rozmarin: -pinen, camfor, eucaliptol este de aproximativ 2:1:0,6 b. Prezena 3-octanonei mpreun cu cea a 3-octanolului c. O concentraie de 3-octanon cuprins ntre 3-7% d. Un coninut ridicat n -pinen, cuprins ntre 30-35% 4. Prin incubarea probelor de frunze uscate i verzi de rozmarin i ulei volatil de rozmarin la 40oC s-au determinat principalii compui volatili responsabili de mirosul caracteristic rozmarinului perceput de om, i anume: -pinenul, camfenul, -pinenul, -mircenul, eucaliptolul, 3-octanona i camforul; 5. 3-octanona, compusul marker al rozmarinului cultivat n sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj, a fost identificat n toate probele de frunze uscate de rozmarin analizate prin tehnicile HS i ITEX; 6. Comparativ cu tehnica HS, la temperaturi mici de incubare (30-40oC), tehnica ITEX ofer posibilitatea identificrii/evidenierii unui numr mai mare de compui volatili minoritari. La temperaturi mai mari de incubare (60-95oC), cu ajutorul tehnicii HS a fost separat un numr de compui volatili mai mare dect cel separat utiliznd tehnica ITEX. ns prin mrirea numrului de pompri din faza de headspace, numrul de compui separai/identificai prin tehnica ITEX l depete pe cel obinut cu tehnica HS. Prin urmare, tehnica ITEX ofer posibilitatea unei determinri mai exacte a compoziiei volatile a rozmarinului. 7. Utiliznd metode statistice avansate, s-a realizat o predicie a evoluiei chimice a uleiului volatil de rozmarin n funcie de vrst i perioada de recoltare. In analiza compuilor volatili din hamei: 1. S-a realizat optimizarea unor metode GC-MS, HS/GC-MS i ITEX/GC-MS de analiz a hameiului i uleiurilor volatile de hamei. 2. n urma analizei HS/GC-MS a probelor de pelei i de ulei volatil provenite de la patru soiuri de hamei cultivate n Romnia, principalii constitueni volatili

XXXIII

identificai, att n probele provenite de la soiurile amare ct i n cele provenite de la soiurile aromate au fost: mircenul, cariofilenul, humulenul, limonenul, linaloolul, - i - cadinenul, -muurolenul, -guaienul, -selinenul, -pinenul, copaenul. n cazul uleiurilor volatile de hamei, pe lng aceti compui mai apare i oxidul de cariofilen. 3. n probele provenite de la soiurile aromate (pelei, respectiv ulei volatil) au fost identificai compui care nu se regsesc n probele provenite de la soiurile amare, i anume: -panasinenul, -elemenul i aromadendrenul care pot fi utilizai ca i compui marker n dicriminarea soiurilor aromate de cele amare. 4. Compui precum -muurolenul, germacren D, copaenul, -guaienul, -selinenul, - i - cadinenul se afl tr-o concentraie mai mare n probele (pelei respectiv ulei volatil) provenite de la soiurile aromate dect n cele provenite de la soiurile amare. 5. n schimb, -cis-ocimenul se regsete ntr-o concentraie mai mare n soiurile amare dect n cele aromate. 6. Toate probele de Brewers Gold au fost caracterizate de o concentraie ridicat de metil nerolat, de trei ori sau chiar mult mai mare fa de cantitatea regsit n celelalte soiuri. 7. S-a constat o variaie a coninutului de -mircen n funcie de modul de prelucrare a conului. Asfel, cea mai mare concentraie a fost regsit n probele de ulei volatil extras din conuri floare, urmat de cele extrase din conuri uscate i cele extrase din pelei. 8. Comparativ cu tehnica HS, tehnica ITEX ofer rezultate mai bune n ceea ce privete determinarea compoziiei volatile a hameiului, este totui necesar optimizarea n continuare a metodei ITEX 9. Folosind analiza clusterelor s-a realizat o clasificare a soiurilor pe baza compoziiei volatile a hameiului i uleiului volatil de hamei. Metoda propus poate fi utilizat n autentificarea soiurilor de hamei.

XXXIV

BIBLIOGRAFIE SELECTIV 1. Atti-Santos, Ana Cristina, M. Rossato, G. Fernandez Pauletti, Luciana Duarte Rota, J. C. Rech, Marcia Regina Pansera, Fabiana Agostini, Luciana Atti-Serafini, P. Moyna, 2005, Physico-chemical evaluation of Rosmarinus officinalis L. essential oil, Brazilian Archives Biology Technol., 48 (6), 1035-1039 2. Bernotiene, G., O. Nivinskiene, R. Butkiene, D. Mockute, 2004, Chemical composion of essential oils of hop (Humulus lupulus L.) growing wild in Ausktaitjia, Chemjia, 2, 31-36 3. Bicchi, C., Chiara Cordero, Erica Liberto, Barbara Sgorbini, Patrizia Rubiolo, 2008, Headspace sampling of volatile fraction of vegetable matrices, J. Chromatogr. A, 1184, 220-233 4. Jorge, Katia, L. C. Trugo, 2003, Discrimination of different hop varieties using headspace gas-chromatographic data, J. Braz. Chem. Soc., 14 (3), 411- 415 5. Kovacevic, M., Milica Kac, 2002, Determination and verification of hop varieties by analysis of essential oils, Food Chem., 77, 489-494 6. Lo Presti, Maria, S. Ragusa, Alessandra Trozzi, Paola Dugo, F. Visinoni, Alessia Fazio, G. Dugo, L. Mondello, 2005, A comparison between different techniques for the isolation of rosemary essential oil, J. Sep. Sci., 28, 273-280 7. Oprean, R., M. Tamas, R. Sandulescu, L. Roman, 1998, Essential oils analysis. I. Evaluation of essential oils composition using both GC and MS fingerprint, J. Pharmaceutical Biomed. Anal., 18, 651-657 8. Pintore, G., Marianna Usai, P. Bradesi, Claudia Juliano, G. Boatto, F. Tomi, M. Chessa, R. Cerri, J. Casanova, 2002, Chemical composition and antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis L. Oils from Sardinia and Corsica, Flavour Fragr. J., 17, 15-19 9. Radoias, G., A. Bosilcov, I. Btiu, 2005, Odorante naturale n parfumeria modern, Ed. Casa Crii de tiin, Cluj-Napoca
10. Roberts, M. T., J.-P. Dufour, A. C. Lewis, 2004, Application of comprehensive

multidimensional gas-chromatography combined with time-of-flight mass spectrometry (GC x GC-TOFMS) for high resolution analysis of hop essential oil, J. Sep. Sci., 27, 473-478

XXXV