DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE

DIAGNOSTICUL INFECIILOR VIRALE

Argumente: clinice (sdr. clinic, debut, evoluie, patologia asociat) epidemiologice (vrsta, sex etc.) laborator

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE

Indicaii: Alegerea terapiei etiotrope Monitorizarea eficienei terapiei Adoptarea msurilor de profilaxie i combatere n focar a unor boli contagioase Supravegherea epidemiologic a unor boli infecioase

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE

Nejustificat (tardiv, fr consecine terapeutice)? Inaccesibil (infrastructur complex,

personal nalt calificat)?

Costisitor ?

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE

n prezent: Justificat i necesar (metode de diagnostic
rapid, antivirale eficiente)

Accesibil (cel puin pentru anumite metode) Cost / eficien

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE Indicaii:

Iniierea i monitorizarea terapiei antivirale (v. gripale, HSV1, HSV2, CMV, HIV, HBV, HCV) Stabilirea conduitei terapeutice sau profilactice (herpes genital prepartum, infecie cu v. rubeolic, HIV la gravid)

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE

Adoptarea msurilor de profilaxie i combatere n focar a unor boli contagioase (HAV) Supravegherea epidemiologic i adoptarea msurilor de sntate public (triajul donatorilor de snge i organe, supravegherea epidemiilor gripale, SARS) Evidenierea unor infecii noi, virusuri noi sau a unor noi asocieri virus-boal

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE

Tipuri de laboratoare: Laboratoare clinice Institute de Sntate Public Centre de referin

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE

METODE NESPECIFICE METODE SPECIFICE

Metode directe
ex microscopic (ME, IF) evidenierea antigenelor virale evidenierea secvenelor ac. nucleic izolarea - identificarea ex. citologic (MO)

Metode indirecte
evidenierea anticorpilor specifici

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE - ETAPE

Cooperarea clinician medic de laborator! Alegerea celui mai potrivit test (contextul clinicoepidemiologic) Alegerea produsului patologic
Tipul (sdr. clinic, stadiul bolii) Momentul prelevrii Metoda de recoltare i transport

PRODUSE PATOLOGICE UTILIZATE N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

Sdr respiratorii: exsudat nazal, exsudat faringian, lichid de spltur nazal, sput Sdr digestive: materii fecale, tampon rectal Rash vezicular: lichid vezicular, produs de raclaj Infecii urinare: urin Infecii oculare: raclat conjunctival sau corneean, exsudat faringian Sdr meningian/ encefalitic: LCR, biopsie cerebral, materii fecale, saliv, esuturi Snge

MOMENTUL PRELEVRII N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

OPTIM primele 2 3 zile de la debutul bolii (diagnostic direct)!

PRELEVAREA N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

Tipul produsului patologic Expediere imediat Mediu de transport Refrigerare (+4 +8 C), nu congelare (-15 -20 C)

 Lichid amniotic: se aspira lichidul cu seringa si se injecteaza apoi intr-un tub steril. Scop: cultivare virusuri Sange periferic: se decontamineaza tegumentul. Se folosesc tuburi cu heparina sodic Scop: cultivare virusuri Biopsie cerebrala: probele se transporta in mediu de transport M4 Scop: cultivare, PCR pentru VHS Bronhoscopie: se recomanda aspirarea secretiilor prin camera interioara a bronhoscopului intr-un recipient steril cu 1 ml solutie salina. Se transporta imediat la laborator. Scop: cultivare virusuri

 Cervix: se foloseste speculum fara lubrifiant. Se indeparteaza excesul de mucus si puroi cu ajutorul tampoanelor de descarcare. Se introduce un tampon mic in endocervix si se roteste pentru 15 30 secunde. Se evita atingerea peretilor vaginali cu tamponul. Se comprima usor cervixul intre lamele speculului si se exprima puroiul eventual existent. Se introduce tamponul intr-un tub de colectie. Daca sunt prezente leziuni, acestea se comprima cu un alt tampon, care se introduce intr-un mediu de transport M4. Scop: cultivare virusuri si PCR

 Cornee: raclajul corneean este realizat de catre medic. Este indicat a se introduce raclatul in mediu de transport M4 Cultivare VHS LCR: se decontamineaza pielea. Se realizeaza punctie lombara, ventriculara sau suboccipitala. Se strimite LCR intr-un tub steril cu capac insurubat. Nu se foloseste mediu M4. Se transporta in laborator imediat dupa prelevare. Cultivare virus si PCR pentru Herpes Simplex Virus Ureche interna: se curata canalul extern cu antiseptic cu actiune medie. Se preleva puroiul aseptic. Cultivare virus Ochi (extern): se indeparteaza machiajul. Se antiseptizeaza tegumentul din jurul ochilor cu antiseptic slab. Se trece de 2 ori un tampon umed la nivelul conjunctivei. Evitati atingerea pleoapelor. Se foloseste mediu de transport M4. Cultivare virus

 Leziuni herpetice: se sterge viguros baza unei vezicule deschise cu un tampon, se trimite produsul in mediu de transport M4. Cultivare VHS, PCR Biopsie pulmonara: se decontamineaza tegumentul. Se efectueaza doar de catre specialist. Se trimite produsul la laborator in mediu de transport M4. Cultivare virus Spalatura nasala / aspirat nasal: capul pacientului este indicat a fi inclinat sub un unghi de 70. Se aspira in seringa 1 ml solutie salina. Se introduce lichidul in narine. Se colecteaza lichidul si se reintroduce de cateva ori. La final se colecteaza lichidul de spalatura intr-un tub steril insurubat. Se trimite imediat la laborator. Detectarea rapida de virus gripal este posibila in sezon epidemic. Cultivare virus gripal, virus respirator sincitial.

 Nasofaringe: se introduce un tampon subtire, in nasofaringe, in cavitatea nasala. Se tine tamponul aproape de septul nasal. Se roteste tamponul si se retrage. Se transporta imediat la laborator. Se foloseste mediu de transport M4. Cultivare virus; detectare VRS Lichid pericardic, pleural, peritoneal: se decontamineaza tegumentul. Se recomanda aspirarea sterila a cativa ml intr-o seringa. Se introduce lichidul intr-un recipient steril, cu capac. Cultivare virus Rash: se curata suprafata cu alcool 70%. Se instileaza o cantitate mica de solutie salina si apoi se aspira intr-un tub steril. Se foloseste mediu de transport M4. Pentru rash vezicular se cur viguros cu un tampon baza veziculelor proaspete. Cultivare virus si IF directa pentru V Varicella Zoster

 Tampon rectal: in timpul proctoscopiei sau sigmoidoscopiei se ating cu tamponul leziunile de la acest nivel. Se introduce tamponul in mediu de transport M4. Cultivare virus Lichid unt: se decontamineaza tegumentul si cateterul. Se aspira steril de la nivelul untului si se conditioneaza intrun recipient steril. Cultivare virus Materii fecale: se colecteaza in recipiente curate, uscate, cu capac. Daca se recolteaza in plosca, se evita contaminarea cu urina sau dezinfectante. Transportul nu trebuie sa depaseasca 1 ora. Cultivare virus. Detectie Rotavirus (e.g. LA).

 Faringe: tampon de la nivelul exudaului faringian sau al membranelor formate. Se sterg viguros criptele amigdaliene. Nu se atinge mucoasa bucala sau limba! Cultivare virus esut: se recolteaza de catre medic Cultivare virus Aspirat traheal: secretiile se transporta in container steril. Cultivare virus

 Secretie uretrala: se recolteaza la o ora dupa ultima mictiune. Se introduc tampoane subtiri de 2 4 cm in uretra si se rotesc timp de 3 5 secunde. Se depune tamponul intr-un tub colector. Pentru VHS se foloseste mediu de transport M4. PCR pentru VHS2; Cultivare VHS Urina de la nivelul cateterului: se dezinfecteaza tubul cu alcool. Se aspira urina cu o seringa sterila. Se transporta in container steril. Se refrigereaza imediat. Cultivare virus Urina suprapubiana / citoscopie: se realizeaza recoltarea de catre medic intr-un recipient steril; se refrigereaza imediat. Cultivare virus

 Vagin: se foloseste speculum cu lubrifiant. Se introduce un tampon steril in vagin. Mediu M4 pentru VHS. Cultivare VHS, PCR Vulva: nu se foloseste alcool pentru membranele mucoase. Tegumentul se antiseptizeaza. Se colecteaza cu tamponul sau se aspira cu seringa. Mediu M4 pentru VHS. Cultivare VHS, PCR

Diagnosticul direct
Examinarea direct a produselor patologice
Detectarea de antigene: Evidentiere de virus / ME si IEM imunofluorescen (IF), teste imunenozimatice (ELISA enzime linked immunosorbent assay); latex aglutinarea (LA); Detectarea genomului PCR si RT-PCR

Diagnosticul direct
In examinarea direct, produsele patologice sunt examinate pentru evidenierea: virusului; antigenelor virale; a genomului; modificrilor histopatologice induse de ctre infecia viral.

Diagnosticul direct
Avantaje: examinarea direct este rapid, rezultatele fiind obinute n aceeai zi, mai ales n scopul instituirii chimioterapiei. Dezavantaje: costul ridicat al tehnicilor, personalul de laborator nalt calificat, fac din aceste metode apanajul laboratoarelor de cercetare sau special echipate. Tehnicile de biologie molecular au devenit, n ultimul timp, din ce n ce mai accesibile, iar sensibilitatea i specificitatea lor, dublat de automatizarea metodei, depesc aceste inconveniente.

Diagnosticul direct
Scderea preului de cost per determinare reprezint soluia de viitor pentru extinderea lor pe scar mai larg. Prin dezvoltarea tehnologiilor tip DNA chip se vor putea detecta virusuri direct n produsul patologic (PP), cu posibilitatea cuantificrii lor, n vederea monitorizrii terapiei antivirale.

Metode
Microscopia electronic (ME) pentru evidenierea morfologiei i dimensiunilor virusurilor i identificarea acestora utiliznd imunoelectronmicroscopia (IME). Microscopia optic: modificri histopatolgice i evidenierea de incluzii. Detectarea genomului viral: hibridizarea i reacia de amplificare genic (PCR polymerase chain reaction).

Izolarea virusurilor
Culturi de celule: evidenierea efectului citopatic (ECP) produs de ctre virusuri citopatogene; identificarea virusului izolat prin IF, reacia de neutralizare (RN), testul de hemadsorbie, RIA, etc. Izolarea pe ou embrionate n dezvoltare: evidenierea de pocksuri la nivelul membranei chorioalantoidiene (MCA), urmat de identificarea prin RIH. Izolarea pe animale de laborator determin decesul sau reproducerea bolii la animal, urmat de obinerea de seciuni histologice i examinarea lor prin MO pentru evidenierea unor leziuni caracteristice i identificarea de antigene prin RN, RIH, etc.

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC

Microscopia electronic (ME) sensibilitate redus (106-7 virioni/ml) personal specializat i infrastructur complex cost ridicat utilizare limitat

Microscopia electronic (ME)

presupune un laborator dotat cu ME cu putere de mrire ntre 20000-40000X sau 50000-60000X. Pe lng dezavantajele legate de echipamentul scump, al necesitii de personal nalt calificat i al costurilor ridicate pentru reactivi i ntreinerea ME, tehnica are i dezavantajul unei sensibiliti reduse, deoarece limita de detecie presupune prezena virusului n PP n cantitate de aproximativ 106 particule virale/ml.

Microscopia electronic (ME)

Avantaje: rapiditatea detectrii virusurilor i utilitatea descrierii morfologiei virusurilor; uneori reprezint singura metod de diagnostic, aa cum sa ntmplat n cazul descrierii coronavirusului recunoscut, ulterior, ca agent etiologic al SARS (sindromul acut respirator sever). Dezavantaje: sensibilitatea redus, cost ridicat, similitudini morfologice ntre diferite virusuri, imposibilitatea identificrii serotipului.

Microscopia electronic (ME)

Produse patologice utile pentru detecia de virus: materii fecale (MF) pentru rotavirusuri, adenovirusuri, virusul Norwalk i virusurile Norwalk-like, astrovirusuri, calicivirusuri; lichid vezicular pentru VHS i VVZ; produs din leziunile cutanate pentru papillomavirusuri, virusul orf, moluscum contagiosum.

Picornavirusuri

IME
Creste sensibilitatea si specificitatea ME Variante ale IME: IEM clasic: proba este tratat, anterior examinrii la ME cu un ser specific cu Ac monoclonali, anti-virus presupus prezent n PP. Particulele virale, prezente n probe vor aglutina i n final, se vor agrega, datorit specificitii reaciei AgAc; IEM n faz solid: grila ME, (sau alt suport), va fi coafat cu Ac monoclonali; particulele virale, prezente n PP vor fi adsorbite la suprafaa grilei prin intermediul Ac-lor.

Microscopia optic:
Evidentiaza modificri histopatolgice i evidenierea de incluzii
Incluziile cu diferite localizri: intranucleare i/sau intracitoplasmatice, eozinofile sau bazofile, cu variate forme rotunde, alungite, piriforme, etc. reprezint doar un reper orientativ i nu unul patognomonic.

Infectii cu VHS (incluzii IN)

Leziuni determinate de VHS. Sageata verde indica incluzii IN, cea albastra , celule keratinizate, iar cea rosie, celule binucleate, cu incluzii iN.

Sageata rosie - incluzii IN, albastra, degenerarea celulelor cu balonizare (aspect generat de VHS, keratinocite, multinucleate).

VVZ incluzii IN

V. rabic incluzii IC (bazofile) Coloratie HE

Incluzii Babes-Negri granule albastru-inchis la nivelul incluziilor (coloratie Sellers)

VRS sincitii si incluzii eozinofile i.c.

Infectie HIV celule nervoase Incluzii Cowdry A, IN si IC eozinofile (coloratie HE)

joi

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC

Detecia i identificarea antigenelor virale imunofluorescen imunohistochimie metode imunoenzimatice latexaglutinare reacii de neutralizare, fixare a complementului, inhibare a hemaglutinrii

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENA

Anticorpi marcai cu fluorocrom Detecia i identificarea antigenelor de la nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi de celule)

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENA

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

Detecia i identificarea antigenelor virale de la nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi de celule) Anticorpi marcai cu peroxidaz Examinare la microscopul optic Dezavantaj peroxidaza endogen, prezent n numeroase esuturi, poate genera reactii fals pozitive

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

Rabie - imunohistochimie

Incluzii IN Cowdry A se vad uneori; Imunohistochimie, utilizand Ac monoclonali anti- VHS: semnal (+) IN si IC (stanga coloratie Papanicolau si dreapta: IHC, dupa recolorare)

METODE INDIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC

Evidenierea anticorpilor specifici
metode imunoenzimatice (ELISA) latexaglutinare (LA) reacia de fixare a complementului (RFC) / evidentiaza Ac specifici de grup (exceptii / VSR, paragripal tip 3) reacia de inhibare a hemaglutinrii (RIH)

Sensibilitate, specificitate, complexitate i costuri funcie de metoda utilizat Criterii de semnificaie a prezenei Ac

Criterii de semnificaie a prezenei Ac

2 probe de ser (ideal) dinamica semnificativ seroconversia 1 prob unic titrul semnificativ clasa de Ac (IgM versus IgG)

METODE IMUNOENZIMATICE N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

Aplicaii extrem de variate Diverse variante (directe, indirecte, competitive, sandwich) Detecia i identificarea antigenelor (virioni, antigene virale solubile, celule infectate) si a anticorpilor Sensibilitate foarte bun Specificitate funcie de afinitatea anticorpilor Accesibilitate Cost redus

Teste pe membrana

Teste pe membrana (HIV si VHC)

Teste pe membrana
Pentru laboratoare putin dotate NU NECESITA PERSONAL SPECIALIZAT In zone unde prevalenta infectiei respective este redusa SE CONFIRMA OBLIGATOR PRIN ELISA

ELISA- principiu
Evidenierea complexului Ag-Ac cu ajutorul unui element cunoscut (Ac sau Ag) marcat cu o enzim Reacia de culoare, prin adugarea unui substrat specific (pentru enzima utilizat)

Placa ELISA (12/8)

ELISA - metoda
Ag partial purificat, inactivat este adsorbit pe suport

Se adauga ser (poate contine Ac se cupleaza de Ag)

ELISA - metoda
Ac anti Ig umana, cuplati cu enzima (conjugat)

Cromogenul (substratul) va schimba culoarea reactiei daca se formeaza complexul Ag-Ac-Conjugat

ELISA ser reactiv

ELISA ser nereactiv

ELISA

Positive Control

Negative Control

Patient A

Patient B

Patient C

Assay Control

1.689

0.153

O.055

0.412

1.999

0.123

ELISA indirect

ELISA indirect

ELISA

ELISA direct (detectare de Ag)

ELISA

ELISA competitiv
competiia se realizeaz direct n prezena de Ac dirijai mpotriva Ag insolubilizat, prin adsorbia pe faza solid. este posibil s adugm reactivii n etape: n prima etap, Ag-ul de dozat se adaug peste Ac insolubilizai pe faza

ELISA competitiv

ELISA
Nu se lucreaza probe hemolizate, contaminate! Pastrarea serului cel mult 5 zile la frigider (ideal, maxim 3 zile). Nu se ingheata proba repetat!

Rezultate fals pozitive: impun repetarea probei pe 2 godeuri (mai ales in cazul probelor indeterminate; AS = CO).

Surse de eroare n dozarea antigenelor:

rezultatele fals pozitive pot fi determinate de: * fixarea nespecfic a imunoglobulinelor de ctre receptori Fc membranari sau de ctre factorul reumatoid (FR) prezeni n ser sau alte lichide biologice; * reacii heterospecifice determinate de utilizarea anticorpilor anti-antigene heterologe, anti-gazd sau anti-membrane ale gazdei sau de prezena de antigene n prob (bacterii, levuri, ciuperci, proteine);

Surse de eroare n dozarea antigenelor:

* proasta conservare a serurilor ce duce la alterarea imunoglobulinelor n prob; * folosirea unui conjugat la titru sau cu o aviditate insuficient.

Surse de eroare n dozarea antigenelor:

Rezultate fals negative Aviditate scazuta a Ac adsorbiti pe suport Conjugat nelegat (incubare insuficienta, spalare in exces, etc)

ELISA
Conduita: repetarea pe aceeasi proba sau/si pe o noua proba de ser (recoltat imediat sau/si la 2-3 luni interval). Se prefera repetarea pe truse de la producatori diferiti. Atentie: pacienti cu boli autoimune, sub tratament cu cortosterioizi, hemodializati, etc.

ELISA
Rezultate fals negative: ser recoltat anterior perioadei de seroconversie Ac complexati/legai cu Ag sensibilitate redusa a trusei Ac antiHIV2 nu sunt recunoscuti de truse pentru HIV1 imunsupresie

Evoluia rspunsului imun n infecia cu HIV

ELISA schematic (indirect)

ELISA Ag p 24 (HIV)

Sandwich ELISA (Ac-Ag-Ac)

IgG-Capture EIA
Serum (1/100)

Goat-anti-Human -IgG Capture Antibody

Biotin-Labeled Ag

TMB Substrate

Strepavidin Peroxidase

ELISA
Rezultate fals pozitive Confirmarea printr-un test principial diferit (WB, IF).

HIV WB

WB - principiu
Ag virale fixate pe un suport (membran), reacioneaz specific cu Ac din ser Marcaj imunoenzimatic Legarea reactivilor ca in ELISA de tip indirect

WB
Avantaje: evidentiaza categorii de Ac este mai specifica permite aprecieri prognostice (ex. aparitia/versus disparitia Anti- p24).

WB
Dezavantaje: timp mai mare de executie presupune dotari suplimentare personal super-calificat uneori presupune interpretari subiective cost ridicat

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC LATEX AGLUTINARE

Anticorpi fixai pe particule de latex identific antigene (reciproca este valabil, pentru evidenierea de Ac) Metod simpl, rapida i accesibil Sensibilitate i specificitate relativ reduse Ex: antigenul rotaviral in materii fecale

LA

METODE DE BIOLOGIE MOLECULAR N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

Detecia i identificarea unor secvene specifice de acizi nucleici Diverse variante
Hibridizarea acizilor nucleici neamplificai Amplificarea semnalului (bDNA) Amplificarea secvenei (PCR, RT-PCR, NASBA)

Sensibilitate i specificitate foarte bune Accesibilitate restrns Cost ridicat, dar cu raport cost/beneficii favorabil

PCR

PCR evidenierea fragmentului amplificat

Detectarea calitativ a acizilor nucleici virali

Cand metodele convenionale sunt greu de utilizat: virusurile care se cultiv dificil (VHB, VHC, papillomavirusul uman, HIV i parvovirusul B19); datorit riscului crescut de infeciozitate (HIV); cnd serologia nu este evident (ex. n cazul pacienilor imunocompromii- virusul citomegalic); diagnosticul infeciilor virale congenitale i perinatale (HIV, VHC); virusul este prezent n concentraii foarte joase: screeningul sngelui i al produselor sanguine (VHB, VHC, HIV);

Produse patologice
testarea fluidelor organismelor care n mod normal sunt sterile - LCR (VHS, VVZ, VCM); - lichidul amniotic (VVZ, VCM, parvovirusul B19, virusul rubeolei); - fluidele oculare (VVZ, VCM).

PCR
- Au fost folosite variate metode pentru aceste scopuri, inclusiv PCR i hibridizarea, cu scopul de a putea evidenia concentraii sczute de genom viral n probe.

Secvenierea acidului nucleic viral

Odat ce genomul viral a fost detectat, secvenierea genomului poate evalua relaiile dintre dou sau mai multe izolate virale, n cazurile n care este posibil coinfecia (VHB VHC) sau poate ghida terapia antiviral. n testarea rezistenei la antitretrovirale a HIV se determin secvenierea RT i a proteazelor i se compar expresia schimbrilor aminoacizilor cu tulpina iniial de virus. Testarea sensibilitii HIV la antiretrovirale are un potenial limitat datorit beneficiului clinic redus, costurilor ridicate, dificultilor de interpretare.

Secvenierea acidului nucleic viral

Aplicaii: alegerea terapiei de prim intenie, adaptarea terapiei, profilaxia post expunere i prevenia transmiterii verticale. Ex. terapia HIV i VHC. rspunsul la IFN n infeciile cu VHC depinde de genotipul viral: genotipurile 2 i 3 rspund mai bine dect genotipul 1; cteva variante de VHB cu sensibilitate redus la Lamivudin sunt asociate cu prezena unui singur nucleotid la nivelul genei care codifica sinteza polimerazei.

Cuantificarea acidului nucleic viral

Cuantificarea ncrcturii virale este important n virusologia clinic datorit utilitii sale ca: - indicator al prognosticului; - al rspunsului la terapia antiviral; - al riscului transmiterii infeciei.

Evaluarea prognosticului:
A fost bine stabilit pentru HIV. Sa demonstrat c nivelul plasmatic al ARN ului viral corelat cu stagiul bolii i cu un nivel sczut al HIV1 n plasm se asociaz cu o lung perioad asimptomatic. Incrctura viral crescut dup seroconversie poate preceda progresia spre SIDA.

Evaluarea prognosticului:
Msurarea ncrcturii virale pentru VCM este util n cazurile post transplant, aceast metod dovedinduse mult mai eficient dect determinarea calitativ. Incrctura viral pentru VCM este un factor predictiv independent n supravieuire, n cazul SIDA avansat. Creterea VEB n plasm i n limfocitele din sngele periferic poate precede apariia unor tulburri limfoproliferative post transplant.

Evaluarea rspunsului terapeutic:

este cel mai bine cunoscut n cazul infeciei cu HIV, caz n care scopul terapiei este de a reduce nivelul plasmatic al HIV1 ct mai mult posibil exist controverse n acest sens; - s-a sugerat c pacienii cu nivelul plasmatic al HIV1 ntre 30.000 i 50.000 cpii / ml ar trebui s primeasc terapie antiretroviral indiferent de stadiul clinic, - n timp ce pentru pacienii care au concentraii ntre 5000 30000 cpii / ml trebuie s se aib n vedere i stadiul clinic i numrul CD4 pentru iniierea terapiei antiretrovirale.

Evaluarea rspunsului terapeutic:

Terapia antiretroviral este eficient dac s a redus nivelul plasmatic al HIV1 cu cel puin 0,5 log10. Revenirea nivelului ARN ului plasmatic pn la valori egale cu cele dinaintea terapiei, ar trebui s trezeasc suspiciuni cu privire la dezvoltarea rezistenei.

Evaluarea rspunsului terapeutic:

n cazul HVB, n care un nivel crescut de ADN nainte de iniierea tratamentului este asociat cu un rspuns slab la IFN, cuantificarea ADN/ VHB a fost utilizat pentru a preconiza rspunsul terapeutic i pentru a monitoriza rspunsul la terapia antiviral. La fel i n cazul infeciilor cu VHC, nivelul ridicat al viremiei, naintea iniierii terapiei antivirale este asociat cu un rspuns terapeutic redus (s-a demonstrat c acesta apare indiferent de genotip). Este nc neclar care este raportul dintre genotipul VHC i nivelul viremiei.

Evaluarea riscului transmiterii virale:

cuantificarea genomului viral pentru a evalua riscul transmiterii virale nu este frecvent utilizat n prezent, dar poate deveni mult mai important n viitor; este general acceptat c riscul transmiterii virale este corelat cu nivelurile crescute de virus n diverse fluide ale organismului; transmiterea VHC de la mam la copil este mai frecvent atunci cnd nivelul ARN / VHC al mamei n snge este mai mare dect 108 cpii / ml (practic risc = 0 la 103 cpii / ml ). Transmiterea se face frecvent n timpul nateriii; frecvena ratei transmiterilor este mai mic n cazul naterilor prin cezarian dect n cazul naterilor pe cale natural.

Evaluarea riscului transmiterii virale:

n ceea ce privete transmiterea mama-fat n cazul HIV1, s-a demonstrat, dei inconstant, c nivelurile ridicate ale ARN / HIV n plasma mamei cresc riscul infeciilor fetale. Scderea riscului transmiterilor se poate face eficient prin Zidovudin. O meta analiz recent ce a inclus 15 studii de cohort sugereaz c naterea prin cezarian reduce riscul transmiterii HIV pe cale vertical, indiferent de utilizarea Zidovudinei. Nivelurile crescute de HIV1 apar mai frecvent n timpul relaiilor heterosexuale.

Metode cantitative

Real Time pCR (LP cu demonstratii practice)

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - CULTIVARE

Metod standard permite
stabilirea semnificaiei izolatului testarea sensibilitii la antivirale izolarea unor virusuri noi

laborioas, necesit infrastructur complex i personal calificat accesibilitate redus i costuri mari

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - CULTIVARE

Prelucrarea produsului patologic Medii de cultur celulare
culturi de celule (primare, diploide, linii celulare) ou embrionate animale de laborator

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - CULTIVARE

Evidenierea replicrii virale
efect citopatic incluzii hemadsorbie hemaglutinare imunofluorescen, metode imunoenzimatice transformare malign interferen

CULTIVAREA VIRUSURILOR EFECT CITOPATIC - sincitii

Virus urlian : CC- sincitii (se confunda cu cele ale VRS diferentiere prin testul de hemadsobtie)

CULTIVAREA VIRUSURILOR INCLUZII VIRALE