Curs 3 Efectul factorilor de retenie i selectivitate asupra rezoluiei cromatografice Este foarte util a se dezvolta o relaie matematic ntre

rezoluia unei coloane i factorii de retenie, kA i kB, a factorului de selectivitate N, care alctuiesc o coloan cromatografic n cazul a doi solui. Considernd c cei doi solui, A i B au timpi de retenie apropiai unul de cellalt, se poate aproxima c: WA = WB W ec poate fi scrisa ca vezi pe slide 74 Formele simplificate ale ecuaiilor 1.21 i 1.22 sunt uneori ntlnite n condiiile n care acestea se aplic unor perechi de solui ale cror constante de distribuie sunt aproape similare Efectul rezoluiei asupra timpului de retenie nainte de a considera n detaliu semnificaia ecuaiilor derivate mai sus, este util s se dezvolte o ecuaie care s prezinte caracteristicile de performan a unei coloane, adic timpul necesar pentru o complet separare a solutului A de solutul B. n mod clar, ceea ce este dorit n cromatografie este o rezoluie posibil nalt n cel mai scurt timp posibil. Din nefericire, aceste dou proprieti nu pot fi maximalizate n aceleai condiii, motiv pentru care totdeauna trebuie gsit un compromis. Timpul pentru desvrirea separrii este determnat de viteza vB a solutului care se mic mai lent este dat de ecuaia 2. Aceasta este: vezi slide 77

Variabilele care afecteaz performanele unei coloane cromatografice Ecuaiile alturate sunt semnificative deoarece servesc drept ghid n alegerea condiiilor care sunt potrivite pentru a fi urmate de utilizatorul cromatografiei pentru a atinge ntr-un timp determinat scopul propus cu rezultate clare. n cercetarea condiiilor optime pentru o separare dorit trebuie avut n vedere c k' i N (sau H) pot fi ajustai mai mult sau mai puin independent. fazei mobile. Utilizarea unui alt tip de mpachetare a coloanei reprezint o modalitate mai puin convenabil. Dup cum s-a artat, este posibil a se modifica N prin schimbarea lungimii coloanei ori de a modifica H prin modificarea vitezei de curgere a fazei mobile, a mrimii dimensiunilor particulelor de mpachetare, a vscozitii fazei mobile (prin modificarea DM sau DS), i a grosimii filmului de lichid adsorbit coninut n faza staionar . Variaia n numrul de talere, N O cale evident de cretere a rezoluiei o reprezint creterea numrului de talere din coloan (ecuaia 1.21). Totui urmnd aceast cale, metoda este mai puin economic din punct de vedere al timpului necesar pentru a finaliza separarea n afara cazului n care creterea n N este realizat mai degrab prin reducerea n H dect prin lungirea coloanei. Variaia n nlimea talerului, H O mbuntire semnificativ a rezoluiei poate fi realizat fr nici un cost de timp suplimentar dac nlimea talerului se reduce. Se poate nota c scderea mrimii particulelor de mpachetare a coloanei conduce la o mbuntire marcant a lui H.

Pentru faze mobile lichide, unde B/u este neglijabil, reducerea nlimii talerului poate fi de asemenea realizat prin reducerea vscozitii solventului, mrindu-se astfel coeficientul fazei mobile. Variaia n factorul de retenie Adesea, o separare poate fi mbuntit semnificativ prin manipularea factorului de retenie, kB. Creterea lui kB crete n general rezoluia (crescnd ns timpul de eluie). Pentru a determina domeniul optim al valorilor pentru kB, este necesar a scrie ecuaiile 1.21 i n forma:slide79

unde Q i Q' conin restul de termeni ai celor dou ecuaii. n mod uzual, cea mai simpl cale de cretere a rezoluiei de separare o reprezint optimizarea lui k'. Pentru faze mobile gazoase, k' poate deseori crescut prin creterea temperaturii. Pentru fazele mobile lichide, schimbarea compoziiei solventului permite deseori manipularea lui k' obinndu-se astfel separri superioare. Efectele dramatice produse prin schimbarea solventului sunt ilustrate prin exemplul prezentat n figura de mai jos. Se observ c o mic modificare a rapoartelor metanol/ap conduce de la separri cromatografice nesatisfctoare (a i b) la separri unde fiecare peak al oricrui component este bine separat (c i d). n multe scopuri, Cromatograma artat n (c) pare a fi cea mai bun dup cum arat raportul dintre rezoluia adecvat n intervalul de timp. Variaia n factorul de selectivitate k' i creterea lui N nu sunt suficiente pentru a produce o separare satisfctoare a doi solui, ntr-un timp rezonabil. Sub aceste circumstane, trebuie identificat o posibilitate de cretere a factorului de selectivitate k' ntr-un domeniu optim de 1-10. n acest context sunt posibile o serie de opiuni de lucru. Astfel, scderea oportunitii n perspectiva i avantajul (comoditii) aceste opiuni includ: (1) schimbarea compoziiei fazei mobile, inclusiv schimbarea pH ului; (2) schimbarea temperaturii coloanei; (3) schimbarea compoziiei fazei staionare; (4) utilizarea unor efecte specifice, chimice. Un exemplu de utilizare a opiunii (1) a fost raportat n cazul separrii anisolului (C6H5OCH3), de benzen. Cu o faz mobil coninnd un amestec metanol:ap 50%, k' pentru nlocuirea fazei apoase cu una care ca coninut 37% tetrahidrofuran a condus la k' de 3,9 i 4,7 -uri a fost semnificativ n primul caz, n cel de al doilea caz suprapunerea a fost neglijabil. Pentru separri care implic acizi sau baze ionizabile, modificarea pH -ului fazei k' ceea ce conduce la separri mai eficiente. simultan cu o meninere aproape constant a valorilor lui k' n domeniul optim este cea de alterare a compoziiei chimice a fazei staionare. Pentru aceasta, cele mai multe

laboratoare care realizeaz separri cromatografice frecvente posed mai multe coloane care pot fi interschimbabile cu un minim de efort. O cretere a temperaturii genereaz deseori o cretere n k' dar aceast operaiune -lichid ori cromatografiei lichid-solid. n opoziie, n cazul cromatografiei de schimb ionic, efectul temperaturii poate fi suficient n cazul explorrii acestei opiuni, nainte de schimbarea mpachetrii coloanei. n fine, o alt metod de cretere a rezoluiei este ncorporarea n faza staionar a unor specii care complexeaz sau interacioneaz cu unul sau mai muli componeni aflai n proba de separat. Un exemplu de utilizare a acestei opiuni o reprezint impregnarea cu sruri de argint a suportului adsorbent care conduce la o mbuntire a separrii olefinelor ca o consecin a formrii unor complexe ntre ionii de argint i compuii organici nesaturai. Trena cromatografic Formarea trenelor cromatografice reprezint o problem real i inevitabil la majoritatea separrilor n cromatografia lichid. Cercettorii din domeniu au depus eforturi n dezvoltarea unor noi materiale (suporturi cromatografice) i dei acestea reduc formarea trenelor, rareori s-a putut elimina acest fenomen. Procesul de formare a trenei cromatografice poate cauza att probleme cantitative ct i calitative n procedurile de cromatografie lichid, fiind important o monitorizare a formrii lor astfel nct s nu se compromit rezultatul analizei. Analiznd n detaliu o cromatogram se poate observa c aproape toate peak-urile cromatografice au o oarecare tren mai mult sau mai puin lung. Dei multe dintre coloanele de cromatografie lichid actuale sunt mai puin problematice dect predecesoarele lor, totui aceasta problem nu a fost nc eliminat. Se consider c un peak are trena sau ca este asimetric atunci cnd forma sa deviaz de la cea ideala, Gaussian. A doua jumtate eluat a peak-ului este mai larg dect prima, iar limea sa tinde sa se expandeze spre baza. Dei pot aprea cozi ale peak-urilor si in jumtatea frontala a acestora, acestea sunt totui rare in comparaie cu trenele. Deoarece trenele peakurilor pot influenta calitatea separrii este bine ca panta trenei sa fie cuantificata. Exista doua mecanisme de msurare universale a peak-urilor. Lucrtorii din industria farmaceutica folosesc factorul de trenare, USP Tf (Unided State Pharmacopeea Tail factor), conform formulei 1.26. unde a si b reprezint limea jumtii frontale si respectiv jumtii posterioare msurate la 5% din nlimea peak-ului (figura alturat). Majoritatea celorlali practicieni folosesc factorul de asimetrie (As). Particulele de silice care formeaz suportul solid sunt realizate din polimer de siliciu i oxigen. Ca i carbonul, siliciul este tetravalent, deci structura intern a lui cuprinde patru atomi de oxigen ataai la fiecare atom de siliciu n structura polimerului tridimensional. La suprafa, polimerul se termin cu grupri de silanol Figura de mai jos prezint diferitele configuraii posibile ale gruprilor silanolice.

Interacii posibile la suprafaa suportului de silice Practicienii descriu n mod curent suprafaa ca posednd grupri libere silanolice (a) dar sunt de altfel prezeni atomi de siliciu cu dou grupri hidroxil n configuraie geminal (b). Dac gruprile silanolice sunt poziionate una, alturi de alta, se pot realiza legturi de hidrogen cu o grupare adiacent (c). Gruprile libere de silanol sunt mai acide dect gruprile geminale ori asociate ele interacionnd mai puternic cu solui bazici avnd ca rezultat formarea unei trene deseori asociat cu separarea unor solui bazici. n alte cazuri, urme de metale (deseori fier ori aluminiu) pot fi prezente in matrixul de silicagel (d). Ionii metalici pot aciona ca situsuri schimbtoare de ioni sau, cnd gruprile silanol libere sunt adiacente, ei pot atrage electroni, care fac ca silanolul sa fie i mai acid (e). In trecut, coloanele mpachetate cu silice tip A conineau toate aceste forme de silanol prezentate n figur, totui, n ultimii ani s-a pus la punct tehnologii de obinere de suporturi de silice de puritate nalt (silicea de tip B), ce conine un numr redus de grupri silanol libere la suprafa i sunt lipsite de urme de metale, fiind astfel mai puin acide. Astfel de coloane ce conin silice de tip B au o tendin mult mai mic de a genera peak-uri cu tren. Reducerea formrii trenelor n coloane de tip.A, nseamn de obicei modificarea fazei mobile pentru a include componente ce concur la suprimarea trenei. Adugarea de trietilamin n faza mobil reprezint o metod curent n reducerea formrii trenelor cromatografice. Folosit la o concentraie de 20mM sau mai mare n faza mobil, trietilamina poate reduce semnificativ trenarea picurilor n coloane de tip A. n cazul utilizrii de silice de tip B trenarea peak-urilor reprezint o problem mult mai rar. n condiiile utilizrii exclusiv de coloane de tip B, rareori se adaug trietilamin la faza mobil. Ca regul general, pH -ul sczut al fazei mobile (pH < 3) acioneaz de asemenea ca un supresor al ionizrii silanolului, care mai departe conduce la reducerea formrii trenelor cromatografice.

Problema general a eluiei Figura alturat ilustreaz o cromatogram ipotetic a unui amestec de ase componeni separai teoretic n trei perechi de componente care au constante de distribuie i factori de retenie net diferii. n cromatograma (a), condiiile au fost ajustate astfel nct factorii de retenie pentru componentele 1 i 2 (k'1 i k'2 ) sunt n domeniul optim, de cuprins ntre 2 i 5. Factorii corespunztori pentru ai celorlalte componente sunt, totui, departe de valorile optime. Astfel, pentru peak-urile 5 i 6 care apar numai dup un interval de timp extrem de mare i de asemenea care sunt difuzate, este dificil de a fi identificate cu certitudine. Dup cum se observ n cromatograma (b), schimbarea condiiilor pentru optimizarea separrii componentelor 5 i 6, ngrmdesc peak-urile primelor patru componente n zone cu o rezoluie nesatisfctoare. Totui, n acest caz timpul de eluie este ideal.

n cromatograma (c) este prezentat un al treilea set de condiii n care valorile lui k' pentru componentele 3 i 4 au valori optime. Separarea celorlalte dou perechi, din nou, nu este complet satisfctoare. Fenomenul ilustrat n figur este ntlnit aproape permanent, din acest motiv s-a denumit problema general a eluiei. O soluie comun n rezolvarea acestei probleme este cea de schimbare a valorilor ale k' dup cum a fost prezentat mai nainte. Aceste modificri pot fi realizate ntr-o manier n trepte ori continu. Astfel, pentru amestecul prezentat n figur, condiiile de la nceput pot fi cele care conduc la cromatograma (a). Imediat dup eluia componentelor 1 i 2, este necesar schimbarea condiiilor astfel nct s se ajung la cele optime pentru separarea compuilor 3 i 4 (dup cum se observ n cromatograma c). Odat cu apariia peak-urilor acestor compui, eluia poate fi realizat n condiiile utilizate n cazul cromatogramei (b). Deseori, astfel de proceduri conduc la rezolvarea satisfctoare a peak-urilor tuturor componenilor din amestec ntr-un interval minim de timp. n cazul cromatografiei lichide, variaiile n k' sunt produse prin variaia n compoziie a fazei mobile n timpul eluiei (eluie n gradient sau programarea solventului). Pentru gaz cromatografie, creterea temperaturii (programarea temperaturii) servete la atingerea condiiilor optime necesare separrii. relaii de legtur (1)

relaii de legtur (2)

APLICAIILE CROMATOGRAFIEI Cromatografia a reprezentat i reprezint o prim metod de separare intim legat de specii moleculare nrudite chimic, ce poate fi utilizat n identificri calitative i determinri cantitative ale speciilor separate. n continuare vor fi prezentate caracteristicile generale ale cromatografiei, ca metod de realizare a unei analize. Analize calitative O cromatogram furnizeaz numai o singur parte de informaie cantitativ despre fiecare specie din prob, adic timpul su de retenie ori poziia pe faza staionar dup o anumit perioad de eluie. n plus, datele pot de asemenea s fie derivate din cromatograme proces implicnd faze mobile i staionare diferite ori diverse temperaturi de eluie. Pn acum cantitatea de informaii oferite de prin cromatografie sunt mici comparativ cu cea obinut prin tehnici precum IR, RMN sau spectrometria de mas. n plus, datele spectrale, lungime de und sau de frecven pot fi mult mai nalt specifice care pot reprezenta un omolog al cromatografiei (tR).Cele mai sus prezentate nu trebuiesc interpretate n sensul c metodele cromatografice i pierd din importan n cazul aplicaiilor calitative. ntr-adevr, cromatografia este o metod deseori utilizat n recunoaterea prezenei sau absenei unor componente din amestecuri care conin un numr limitat de specii posibile a cror identitate este cunoscut. De exemplu, 30 sau mai muli aminoacizi dintr-un hidrolizat proteic pot fi detectate cu un mare grad de certitudine prin metoda cromatografic. Totui pentru a confirma identitatea este necesar o investigaie chimic sau spectroscopic a compuilor izolai. Se poate nota c totui, o identificare pozitiv spectroscopic a speciei prezente ntr-un complex de compui ar fi imposibil fr o separare cromatografic anterioar. Astfel, cromatografia este deseori o metod precursoare n analizele spectroscopice calitative. Este important a se nota ns c o cromatogram nu poate conduce la o identificare pozitiv a speciilor prezente n probe, dar poate da indicaii sigure asupra absenei unei serii de compui din respectivul analit. Astfel dac proba nu produce un peak cu un timp de retenie asemntor unui standard analizat n aceleai condiii se poate spune c acel compus luat n analiz este absent (sau este prezent la concentraii sub limita de detecie a metodei). Analize cantitative Cromatografia i datoreaz n principal dezvoltarea din ultimii ani, n parte, vitezei sale, simplicitii i preului su relativ sczut, aplicabilitii aproape generalizate ca o metod de separare. Nu se poate totui afirma c ea va deveni general dect n condiiile n care ar fi utilizat la obinerea de informaii utile cantitative asupra speciilor separate. Este important totui a se discuta despre o serie de aspecte cantitative care se aplic la toate tipurile de cromatografie. Cromatografia cantitativ pe coloan se bazeaz pe compararea nlimii sau ariei peak-ului de analit i prin compararea acestuia cu unul sau mai multe standarde. n cazul cromatografiei planare, aria acoperit de speciile separate servete ca i un parametru analitic. Dac condiiile sunt corect controlate, aceti parametrii vor varia linear cu concentraia. Analize bazate pe nlimea peak-ului nlimea peak-ului cromatografic este obinut prin msurarea liniei de baz pe de o parte i a perpendicularei peak-ului, cobort prin vrf. Acest tip de msurare se realizeaz,ntr-un timp rezonabil i cu o precizie de msurare bun. Este important a se nota c,totui nlimile peak-urilor sunt invers proporionale cu limile lor. Astfel, acurateea rezultatelor obinute din msurarea nlimii este obinut numai dac nu apar variaii n condiiile de eluie a coloanei, care s nu altereze limea peak -ului n perioada de eluie a probei i a standardelor. Variabilele care trebuiesc urmrite cu grij sunt temperatura coloanei, viteza de curgere a eluentului prin coloan i viteza de ncrcare (injecie) a probei.

n plus, trebuie avut grij s se evite a suprancrcarea coloanei. Efectul injeciei probei este n mod particular critic n cazul primelor peak-uri ale cromatogramei. Injecia neadecvat a probei conduce la erorile relative de 5% pn la 10%. Analize bazate pe aria peak-ului Ariile peak-urilor sunt independente de efectele de mprtiere date de variabilele menionate mai sus. Din acest punct de vedere, totui, valorile ariilor sunt variabile analitice mult mai satisfctoare comparativ cu nlimile peak-urilor. Pe de alt parte, nlimile peakurilor sunt mult mai uor de msurat n cazul peak-urilor nguste. Majoritatea instrumentelor moderne sunt echipate cu integratoare electronice digitale care permit estimarea cu precizie a ariei peak-ului cromatografic. Dac asemenea instrumente nu sunt disponibile, se poate apela la metoda manual, metod simpl care permite o bun estimare a peak-urilor simetrice. Aceasta implic calcularea ariei prin nmulirea nlimii peak-ului cu valoarea limii determinat la jumtate din nlimea lui. Alte metode implic utilizarea unui planimetru sau decuparea peak-ului cromatografic i cntrirea lui, determinnd astfel greutatea lui n relaie cu o arie cunoscut de hrtie de nregistrare. n general, tehnicile de integrare manual conduc la erori de 2-5%, pe cnd integrrile digitale sunt de un ordin de magnitudine mai precise. Calibrri i standarde Cea mai sigur metod de analiz cromatografic cantitativ implic prepararea unei serii de standarde prin diluia unei soluii stoc ce posed o compoziie aproximativ asemntoare cu cea a probei necunoscute. Cromatogramele pentru standarde obinute astfel sunt apoi reprezentate n funcie de concentraia lor. Curba rezultat care obligatoriu trece prin origine este utilizat la determinrile de concentraie a compusului care se dozeaz. n mod frecvent se recurge la restandardizare pentru a obine rezultate cu o mai mare acuratee. Cea mai important surs de erori n analize efectuate prin metoda mai sus menionat este dat de incertitudinea legat de volumul probei; uneori, viteza de injecie, reprezint de asemenea un factor de eroare. n mod curent probele sunt mici (de aproximativ 1 l), iar incertitudinile legate de injectarea n condiii reproductive a unui volum cu o sering de aceleai mrime poate conduce la scderea cu procente semnificative a erorilor. Aceast situaie este des-ntlnit n cromatografia gaz-lichid, unde proba trebuie sa fie injectat ntrun dispozitiv special nclzit, unde fenomenul de evaporare care apare la nivelul acului seringii poate fi deosebit de crescut, conducnd astfel la variaii mari ale volumului injectat. Erorile volumului de prob pot fi reduse, cu probabil 1-2% din medie, prin utilizarea unei valve rotative. Metoda cu standard intern Precizia cea mai mare n cromatografia cantitativ este obinut prin utilizarea standardelor interne deoarece incertitudinile introduse prin injectarea probei sunt evitate. n aceast procedur, se msoar cu atenie o substan, denumit standard intern, care este introdus n fiecare standard sau prob, raportul dintre ariile (ori nlimea) peak -urilor analitului i a standardului intern servind drept parametru analitic. Pentru ca aceast metod sa aib succes, este ca peak-ul standardului intern s fie bine separat de peak-urile celorlalte componente din prob (Rs > 1,25); peak-ul standard trebuie, pe de alt parte, sa apar n apropierea peak-ului analitului. Cu un standard intern adecvat, se poate crete precizia fa de alte metode, utilizate frecvent. Metoda de normalizare a ariei O alt abordare care conduce la scderea incertitudinilor legate de injectarea probei este metoda de normalizare a ariei. n acest caz, este necesar eluia complet a tuturor componentelor probei. n metoda de normalizare, ariile tuturor peak-urilor sunt calculate, dup corecia tuturor acestor arii cu diferenele dintre rspunsul detectorului la tipurile diferite

de compui, n timp de concentraia analitului este determinat din raportul acestor arii la aria total a tuturor peak-urilor. Din nefericire, adesea nu este practic a aranja condiiile n aa fel ca toi compuii din amestec s fie eluai din coloan ntr-o perioad de timp rezonabil, motiv pentru care metoda de normalizare are aplicaii limitate. CROMATOGRAFIA DE PARTIIE Dintre toate tipurile de procedee cromatografice lichide, cromatografia de partiie este cea mai utilizat tehnic de separare. Dac n trecut cele mai multe aplicaii se adresau compuilor neionici, celor polari cu mas molecular moderat (de obicei mai mic de 3000) astzi dezvoltarea unor metode (procedee de derivatizare ori de tehnicile bazate pe perechi de ioni) au extins separrile prin partiie i la compui ionici. Cromatografia de partiie poate fi subdivizat n cromatografie lichid-lichid i cromatografie cu faz legat. Diferena ntre cele dou tehnici constau n metoda prin care faza staionar intr n interacie cu particulele suport, mpachetate. n cromatografia lichidlichid, faza lichid staionar este reinut pe suprafaa particulelor mpachetate prin adsorbie fizic. n schimb, n cazul cromatografiei de faz legat, faza staionar este legat chimic la suprafaa particulelor de suport. Primele tipuri de cromatografie de partiie au fost exclus iv de tip lichid-lichid; acum totui metoda cu faz legat a devenit predominant datorit multor dezavantaje ale sistemelor lichid-lichid. Unul dintre aceste dezavantaje l reprezint pierderea fazei staionare prin disoluia ei faza mobil, care astfel necesit reacoperirea periodic a particulelor suport. n plus, problemele de solubilitate ale fazei staionare interzic utilizarea fazei lichide mpachetate n cazul eluiei n gradient. Cromatografia de partiie cu faz legat Suporturile pentru majoritatea tehnicilor de cromatografie de partiie cu faz legat sunt preparate din silice rigid ori au o compoziie pe baz de silice. Aceste solide sunt formate din particule uniforme, poroase, cu consisten mecanic de gel, cu diametru de 3, 5, ori 10 m. Suprafaa acestora este format din silice total hidrolizat (proces realizat prin fierberea silicei n HCl, 0,1 M timp de una-dou zile, proces prin care rezult grupri silanol, chimic reactive, de forma: OH OH OH OH Structura suprafeei de silice. O O O
Si Si Si Si

n mod caracteristic, suprafeele de silice activat, conin aproximativ 8 moli/m 2 de grupri hidroxilice. O structur mult utilizat n cromatografia cu faz legat o reprezint siloxanii, compui rezultai prin reacia dintre suprafaa hidroxilat cu un organo clorosilan, dup reacia: Modalitatea de sintez a unui siloxan; R reprezint o grupare alchil ori o grupare alchil-substituit. Din cauza efectelor sterice suprafaa acoperit prin silanizare este limitat la cel mult 4 moli/m2 dup cum se observ n figura de mai jos. Gruprile Si-OH nereacionate conduc din pcate la o polarizare nedorit a suprafeei, care are ca efect apariia trenei peak-ului cromatografic, mai ales n cazul soluilor bazici. Scderea acestui efect se realizeaz prin dezactivare cu clortrimetilsilan, care, avnd o mas molecular mai mic, se poate lega la gruprile libere hidroxilice ale silanolului. TIPURI DE SUPORTURI UTILIZATE N CROMATOGRAFIA CU FAZ LEGAT

n funcie de polaritatea relativ a fazelor mobil i staionar, se pot distinge dou tipuri de cromatografii cu faz legat. Primele lucrri de cromatografie lichid s-au bazat pe faze staionare puternic polare precum apa ori trietilenglicolul, legate de particule de silice ori de alumin; n continuare, un solvent relativ nepolar precum hexanul ori iso-propil eterul, servesc apoi drept faz mobil. Fiind raportat prima, aceast tehnic cromatografic de partiie a fost denumit cromatografie cu faz normal. n cromatografia cu faz invers, faza staionar este nepolar, deseori o hidrocarbur, n timp ce faza mobil este relativ polar (ap, metanol, acetonitril, etc.). Relaiile dintre polaritate i timpii de eluie n cazul cromatografiei cu faz normal (a, b) i cea cu faz invers (c, d) n cazul a trei componeni. a) polaritate sczut a fazei mobile; b) polaritate medie fazei mobile; c) polaritate nalt a fazei mobile; d) polaritate medie fazei mobile. n cromatografia cu faz normal, componentul cel mai puin polar este eluat primul, deoarece, n sens relativ, este cel mai solubil n faza mobil; creterea polaritii fazei mobile va avea ca efect scderea timpului de eluie. n opoziie, n metoda cu faz invers, componentul cel mai polar apare primul, iar creterea polaritii fazei mobile crete timpul de eluie. Aceste relaii sunt ilustrate n de mai sus. Suporturile cromatografice cu faz legat sunt clasificate drept cu faz invers dac structura de suprafa a suportului are un caracter nepolar, i drept cu faz normal n condiiile n care suportul conine grupri funcionale polare. n cromatografia de nalt presiune cel puin trei sferturi din experimente se realizeaz pe coloane mpachetate cu faz invers. Structura gruprilor organice silil ale fazei staionare difer prin mrime, rigiditate planaritate i grad de nesaturare dup cum se observ n figura alturat. DEVELOPAREA N CROMATOGRAFIA DE PARTIIE Procesul de eluie a componentelor probei de pe suportul cromatografic de ctre faza mobil (solvent) este denumit developare. Aceast metod tinde a fi mai complex n cromatografia lichid dect n cea gazoas deoarece n faza mobil lichid componentele interacioneaz att cu faza staionar, ct i cu cea mobil, n contrast cu gaz cromatografia unde faza mobil se comport ca i un gaz ideal, necontribuind n procesul de separare; ea servete numai transportului componentelor probei prin faza staionar. n acest fel, n gazcromatografie, separrile nu sunt semnificativ afectate de ctre faza mobil, indiferent dac aceasta este reprezentat de heliu, azot, ori hidrogen. n contrast evident cu fenomenul ntlnit n cazul gaz-cromatografiei, succesul unei separri prin partiie lichid este adesea profund dependent de compoziia fazei mobile. SELECIA COLOANEI N SEPARRILE PRIN CROMATOGRAFIE DE PARTIIE Succesul cromatografiei cu faz mobil interactiv, necesit o balan optim a forelor intermoleculare care implic cei trei participani activi n procesul de separare: faza mobil, faza staionar i solutul. Aceste fore intermoleculare sunt descrise calitativ n termeni de polaritate relativ a fiecruia dintre cei trei reactani. Polaritile diverselor grupe funcionale cresc n ordinea: hidrocarburi < eteri < esteri < cetone < aldehide < amide < amine < alcooli. Apa este cel mai polar compus dintre toi compuii care conin gruprile funcionale prezentate mai sus. Deseori, n alegerea unei coloane pentru separri cromatografice de partiie, polaritatea fazei staionare este aproximativ aleas, n concordan cu cea a analitului, n timp ce faza mobil aleas pentru eluie prezint o diferen considerabil din punct de vedere al

polaritii. Aceast abordare este n general mai de succes dect cea n care polaritile solutului i a fazei mobile sunt alese diferit de faza staionar. n acest caz, faza staionar deseori nu poate competiiona eficient pentru componentele probei, timpii de retenie devenind prea scuri n aplicaiile practice. O alt extrem o reprezint situaia n care polaritile solutului i a fazei staionare sunt prea similare i total diferite de cea a fazei mobile. n aceast situaie timpii de eluie devin deosebit de mari. Se poate concluziona c polaritile solutului, fazei mobile i fazei staionare trebuiesc cunoscute i selectate cu grij pentru a conduce la o separare de partiie eficient, ntr-un interval de timp rezonabil. Din nefericire, teoriile interaciilor dintre faza mobil i cea staionar pentru oricare component sunt i imperfecte motiv pentru care acestea pot doar ghida analistul n alegerea fazei staionare pentru un tip general, dup care, este necesar a se realiza o serie de experimente preliminarii, de identificare a fazei optime pn la obinerea unei separri satisfctoare. Dac se constat c rezoluia tuturor componentelor ale amestecului este imposibil, se alege un alt tip de coloan. Selecia fazei mobile n cromatografia de partiie n prezentarea teoretic au fost descrise trei metode de cretere a rezoluiei de separare n cromatografia pe coloan, fiecare fiind bazat pe varierea unuia dintre cei trei parametrii (N, k', i ) prezentai n ecuaia 1.21. n cromatografia lichid, factorul de retenie, k', este experimental, cel mai uor de manipulat dintre toi aceti trei factori deoarece exist o dependen puternic ntre a acestei constante funcie de compoziia fazei mobile. Performanele optime ale factorului de retenie, k', trebuie s fie cuprinse ntr-un domeniu ideal cuprins ntre 2 i 5, totui, pentru amestecuri complexe acest domeniu este extins la 0,5 20 n scopul de a furniza timp suficient oricrui component din amestec s fie eluat. Uneori, ajustarea lui k' singur, nu este suficient pentru a produce o separare clar a peak-urilor, fr suprapunere; n acest caz trebuie s se recurg la variaia factorilor de selectivitate . n acest caz modul cel mai simplu de modificare a factorului de selectivitate l reprezint alterarea cu grij a compoziiei fazei mobile, pentru a pstra factorul de retenie, k' ntr-un domeniu rezonabil. Un alt mod alternativ de schimbare a factorului de selectivitate l reprezint alegerea unui suport cromatografic diferit.

EFECTUL TRIEI SOLVENTULUI ASUPRA FACTORILOR DE RETENIE Solvenii care interacioneaz puternic cu soluii sunt deseori numii solveni tari ori solveni polari. n scopul descrierii cantitative a polaritii solvenilor au fost introdui o serie de indeci. Dintre acetia, cel mai utilizat index n cromatografia de partiie l reprezint P', indexul de polaritate, introdus de ctre Snyder n 1978. Parametrul P' se bazeaz pe msurtori de solubilitate a substanei de interes n trei solveni: dioxan (un dipol proton acceptor slab), nitrometan (un dipol proton acceptor tare) i alcool etilic (un dipol proton donor foarte tare). Indexul de polaritate este o msur numeric a polaritii relative a unui numr divers de solveni. Tabelul 2.1 prezint o list de indeci de polaritate, alturi de alte proprieti fizico-chimice pentru un numr de solveni care sunt utilizai n cromatografia de partiie. Se poate nota c acest index poate varia de la 10,2 pentru solventul cel mai polar, apa, la -2 pentru compuii nalt nepolari de tipul fluoroalcanilor. Orice alt index de polaritate dorit se va ncadra ntre aceste limite, fiind realizat prin amestecul a doi solveni adecvai. n acest fel se obine indexul de polaritate P'AB a amestecului format din solvenii A i B. Acesta este dat de relaia:

P'AB = AP'A +B P'B unde P'A i P'B reprezint indecii de polaritate ai celor doi solveni, iar , fracia volumetric a fiecrui solvent. S-a artat anterior c cea mai simpl cale de cretere a rezoluiei cromatografice a dou specii o reprezint manipularea factorului de retenie k', care poate fi variat prin schimbarea indexului de polaritate a solventului. n cazul prezentat mai sus, ajustarea lui P' este realizat prin utilizarea unei faze mobile ce conine un amestec format din doi solveni. De obicei, o schimbare grosier cu dou uniti a indexului de polaritate P' conduce la o cretere de zece ori a factorului de retenie k'. n cazul separrii prin cromatografie de faz normal se poate scrie relaia: unde k'2 i k'1 reprezint valorile iniiale i finale pentru un solut, n timp ce P'1 i P'2 sunt valorile corespunztoare ale lui P'. n cazul coloanelor cromatografice cu faz invers relaia este: . APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI DE PARTIIE Suporturile cu faz invers cnd se utilizeaz n conjuncie cu solvenii foarte polari (deseori apoi), se apropie de sistemul ideal, universal, pentru cromatografia lichid. Datorit aplicabilitii mari, avantajoase i uoare, n condiiile n care factorul de retenie k' poate fi alterat prin modificarea fazelor apoase mobile, ele sunt frecvent aplicate naintea altor separri exploratorii n cazul utilizrii unor noi tipuri de probe. Formarea unor derivai ai probei n unele cazuri este util a se converti componenii probei n derivai naintea sau uneori cnd se ntreprinde o separare cromatografic. Acest tratament este de dorit n condiiile n care se dorete (1) reducerea polaritii speciilor astfel c se poate utiliza mai degrab cromatografia de partiie dect cea de adsorbie ori de schimb ionic, (2) creterea rspunsului detectorului i astfel creterea sensibilitii pentru toate ori pentru o serie de componente ale probei i (3) intensificarea selectiv a rspunsului la detector pentru o serie de componente ale probei. CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULAR Cromatografia de excluziune steric, denumit de asemenea cromatografie de gel premeaie sau gel filtrare reprezint o tehnic de separare de real folos n laborator, fiind aplicat n particular la separarea speciilor cu mas molecular mare. Suportul cromatografic mpachetat utilizat n cromatografia de excluziune steric este alctuit din particule mici, de aproximativ 10 m de silicat ori particule de polimeri care conin reele de pori uniformi ntrun solut i molecule de solvent difuzate n interiorul acestor pori. n interiorul porilor moleculele sunt efectiv blocate, fiind micate prin curgerea fazei mobile. Domeniul de timp de reziden n interiorul porilor depinde de mrimea efectiv a moleculelor de analit. Moleculele care sunt mai mari dect media mrimii porilor suportului cromatografic sunt excluse i astfel ele nu vor fi reinute, aceste specii fiind primele eluate. Moleculele care au un diametru semnificativ mai mic dect dimensiunile porilor pot penetra (permea) n labirintul de pori din interiorul suportului cromatografic, fiind astfel captate, pentru un timp mult mai ndelungat, fiind ultimele eluate. ntre cele dou extreme sunt moleculele intermediare a cror domeniu de permeare n pori depinde de diametrele lor. Fa de acest grup de molecule are loc fracionarea, fenomen direct legat de diametrul lor i n unele cazuri de forma molecular a lor. Se poate spune c separrile prin gel permeaie, de excluziune pe baza masei moleculare difer de alte procese de separare prin considerentul c nu exist interacii fizice sau chimice

ntre analit i faza staionar. Din aceast cauz, este necesar eliminarea oricrei interacii deoarece acestea conduc la scderea eficienei cromatografice. De asemenea trebuie notat c n cazul acestui proces de separare exist o limit superioar a timpului de retenie din cauza faptului c nici o specie de analit nu se reine mai mult dect cel care permeaz total faza staionar. De reinut c n cazul separrii biomoleculelor n sisteme apoase, cromatografia de excluziune de denumete cromatografie de gel filtrare, n timp ce separarea compuilor n sisteme neapoase este denumit cromatografie de gel permeaie. Metoda cromatografic de excluziune din gel (numit de asemenea cromatografie de sitare molecular) exploateaz masa molecular ca proprietatea fizic n scopul realizrii separrii. Astfel pot fi separate molecule din domeniul a 100 pn la cele de mai multe milioane de daltoni. Este clar c o tehnic prin care se separ molecule cu mas molecular cuprins ntre 10000 i 100000 este deosebit de popular printre cercettorii biochimiti. Gel cromatografia a avut i are o importan major n purificarea a miilor de proteine, acizi nucleici, enzime, polizaharide ori a altor biomolecule. n plus, tehnica poate fi aplicat la determinri de mase moleculare ori la analize cantitative ale interaciilor moleculare. Suporturi n cromatografia de gel filtrare Faza staionar este constituit din particule inerte care conin pori mici cu dimensiuni controlate. Examinarea microscopic a acestor particule arat un interior spongios. O soluie care conine molecule cu diferite mase moleculare este trecut prin coloan sub influena unui solvent n continu curgere. Moleculele de solut care sunt mai mari dect porii nu vor putea ptrunde n interiorul sferelor de gel din cauza mpiedicrilor sterice datorate dimensiunii acestora n comparaie cu spaiul din interiorul sferelor. Volumul coloanei care este accesibil moleculelor foarte mari este astfel semnificativ redus. Ca rezultat, ele nu vor fi ncetinite n curgerea lor prin coloan i vor fi eluate astfel ca o singur band (zon). Moleculele mici sunt capabile s difuzeze n i n afara sferelor de gel, fiind necesare volume mai mari de solvent pentru a fi eluate, astfel ele staionnd un timp ndelungat n interiorul sferelor, n consecin fiind ntrziat eluia lor din coloan. Moleculele cu dimensiuni intermediare migreaz prin coloan cu vitez cuprins ntre cea a moleculelor mari i cele mici. Astfel, ordinea de eluie a diverselor molecule de solut este oarecum n relaie direct cu dimensiunile lor moleculare. Au fost elaborate dou tipuri de suporturi pentru cromatografia de excluziune pe baza mrimii moleculelor: microsfere de polimer i particule ce au la baz silice, ambele avnd diametre cuprinse ntre 5 i 10 m. Ultimele au avantajul unei rigiditi crescute ceea ce conduce la o mpachetare mai uoar, permind utilizarea lor la presiuni crescute, stabilitate deosebit de mare, care permite utilizarea lor mpreun cu un mare numr de solveni, inclusiv cu apa, o echilibrare mai rapid ntr-un nou solvent i o stabilitate nalt la temperaturi ridicate. Cele mai timpurii separri efectuate prin tehnica de cromatografie de excluziune molecular s-au realizat pe copolimer reticulat de stiren-divinil benzen, similar n structur cu copolimerii sulfonici ai acestor copolimeri. Mrimea porilor acestor polimeri e controlat prin cantitatea de agent de reticulare, n spe de cantitatea de divinilbenzen utilizat n reacia de polimerizare. Drept consecin, au fot creai o serie de copolimeri cu diferite domenii ale porilor, sub form comercial. Dac la nceput gelurile de stiren-divinilbenzen erau hidrofobe, i astfel neutilizabile n prezena unei faze mobile apoase, astzi sunt disponibile geluri hidrofile, ceea ce face posibil utilizarea lor n solveni apoi pentru separarea unor molecule mari, hidrosolubile precum zaharurile. Aceste geluri hidrofile sunt derivai sulfonai ai divinibenzenului ori sunt poliacrilamidice. n acest moment sunt disponibile comercial suporturi de sticl poroas ori particulele de silice ce au domeniu de mrime al porilor cuprins ntre 40 i 2500 . n scopul reducerii

absorbiei nespecifice, suprafeele acestor particule sunt deseori modificate prin reacii cu substitueni organici. De exemplu, suprafaa unui suport hidrofil prezint structura urmtoare: Structura unui suport hidrofil, pe baz de silice n practica biochimic sunt utilizate cu preponderen geluri bazate pe patru tipuri de baz: dextran, poliacrilamid, agaroz i amestecuri de poliacrilamid cu dextran. Primele geluri dezvoltate au fost pe baz de dextran, un polizaharid natural reticulat cu epiclorhidrin, comercializat sub denumirea de Sephadex Dextranul este un polizaharid compus din resturi de glucoz legate prin legturi ( -1 6) i legturi -1,3 care confer legturi ramificate. El este biosintetizat de ctre o enzim produs de ctre bacteria Leuconostoc mesenteroides, tulpina B-512F. Dextranul este reticulat la multiplele sale extremiti printr-o reacie cu epiclorhidrin, ceea ce conduce la obinerea unor sfere de gel cu poroziti diferite. Numrul dat fiecrui tip de gel se refer la capacitatea de mbibare cu soluie apoas (water regain) multiplicat cu 10. Sephadex-ul este oferit n diverse mrimi ale particulelor denumite coarse, medium, fine i superfine. Gelurile pe baz de dextran nu pot fi preparate dect pentru limite de excluziune mai mici de 600000 daltoni, deoarece mica reticulare existent n structura lor nu este suficient pentru a preveni colapsul particulelor. n schimb, prin reticularea dextranului cu NN'- metilen bisacrilamid, este posibil utilizarea acestor geluri la fracionri cu domenii mai mari. Aceste geluri sunt denumite Sephacryl. Gelurile pe baz de poliacrilamid sunt produse prin copolimerizarea acrilamidei cu NN'- metilen bisacrilamid, ultimul fiind i agent de reticulare. Denumirea comercial a acestor geluri este Bio-Gel P. Mediile pe baz de Bio-Gel sunt media sunt disponibile n 10 limite de excluziune, n domeniul 1800 la 400000 daltoni. Gelurile pe baz de agaroz prezint avantajul unor deosebit de mari limite de excluziune. Agaroza, componentul polizaharidic neutru al agarului, este compus din uniti alternative de galactoz i anhidro-galactoz Agaroza este un material gelificant a cror mrime a porilor este mai mare dect cei ai dextranului reticulat ori ai poliacrilamidei. Agaroza este un polizaharid neutru, fracie de agar. Ea este compus din polimer linear de D-galactopiranoz legate -14 la 3,6 anhidroL-galactopiranoz, care este legat -13. n condiiile n care polizaharidul este dizolvat prin fierbere i apoi este rcit, el formeaz legturi de hidrogen inter - i intramoleculare. Mrimea porilor este controlat prin concentraia de agaroz. Structura gelului este stabilizat mai mult prin legturi de hidrogen dect prin legturi ncruciate covalente. Gelurile pe baz de agaroz sunt furnizate sub denumirea comercial de Bio-Gel A i Sepharose ori Superose. Sepharose CL este o Sepharose reticulat prin reacia dextranului cu 2,3-dibromopropanol n condiii alcaline, ceea ce conduce la obinerea unui gel de agaroz cu o stabilitate termic i chimic crescut. Un pas nainte n tehnologia de gel filtrare s-a realizat n momentul introducerii gelurilor compozite, prin grefarea unui polimer secundar pe un suport de gel preformat, precum de exemplu Sephacryl (figura de mai jos), unde reticularea se realizeaz ntre alil dextran i N,N'-metilen bisacrilamid ori mai recent, Superdex. Gelurile combinate de poliacrilamid i agaroz sunt furnizate sub denumirea comercial de Ultragel. Acestea sunt compuse din poliacrilamid reticulat n ochiurile creia se afl agaroz. Ca i n cazul Superdex, gelul de poliacrilamid confer un grad nalt de separare n timp ce agaroza menine rigiditatea gelului ceea ce conduce la marele avantaj al creterii vitezelor de curgere.

n definirea performanelor unui gel i a comportamentului unui solut este necesar cunoaterea unor proprieti fizice ale acestora. Limita de excluziune. Ea este definit ca masa molecular a celei mai mici molecule care nu poate difuza n interiorul volumului de matrix de gel. Toate moleculele mai mari dect aceast mas vor fi eluate rapid, ntr-o singur zon. Limita de excluziune a unui gel tipic, Sephadex G-50, este de 30000 Da. Toate moleculele din solut care posed mase moleculare mai mari de aceast valoare vor trece prin coloan direct, fr a fi reinute n porii sferelor de gel. Domeniul de fracionare. n cazul Sephadex G-50 domeniul de fracionare este cuprins ntre 1500 i 30000 Da. Moleculele de solut din acest domeniu, se vor separa oarecum ntr-o relaie linear, n funcie de masa lor molecular. Capacitatea de mbibare (water regain i bed volume). Mediile de gel cromatografie sunt oferite cel mai adesea n form deshidratate fiind umflate apoi n solvent, de obicei ap, nainte de utilizare. Cantitatea de ap necesar obinerii unui gram de gel este cunoscut sub denumirea de water regain. n cazul Sephadex G-50, aceast valoare este de 5 pentru 0,3 g. Aceast valoare nu include apa din jurul particulelor de gel i astfel nu poate fi utilizat la o estimare exact a volumului final al coloanei mpachetate de gel. Cele mai multe companii care comercializeaz astfel de produse furnizeaz, n plus la water regain, valoarea volumului particulelor, bed volume. Aceast valoare reprezint volumul final de gel n condiiile umflrii (mbibrii) a unui gram de gel uscat n ap. Pentru Sephadex G-50, bed volume-ul este de 9 pn la 11 ml/g gel uscat. n seria Sephadex-ului, denumit seria G, numerele G se refer la cantitatea de ap care este necesar pentru nmuierea gelului, avnd grade diferite de reticulare, deci diferite mrimi ale porilor. Sephadex G-10, cel mai reticulat dextran, posed un water regain de aproximativ 1 ml/g de gel uscat n timp ce Sephadex G-200, cel mai ieftin dextran reticulat are un water regain de aproximativ 20 ml/g de gel uscat. Forma i mrimea particulei de gel. n condiii ideale, particulele de gel sunt sferice, pentru a furniza un strat uniform de gel, cu o mare densitate a porilor. Mrimea particulelor este definit prin mrimea ochiurilor acesteia (mesh) ori prin diametrul sferei particulei. Gradul de rezolie oferit de viteza de curgere prin coloan depinde de dimensiunile particulelor de gel. Particulele cele mai mari (50 la100 mesh, 100 la 300 m) ofer viteze de curgere nalte dar o separare cromatografic cu rezoluie sczut. n caz opus se afl particulele de gel cu dimensiuni foarte mici ("superfine," 400 mesh, 10 la 40 m). Cele mai utilizate mrimi de particule reprezint un compromis ntre rezoluie i vitez de curgere fiind de 100 la 200 mesh (50 la 150 m). Volumul spaiului gol (void volume). Acesta reprezint spaiul total din jurul particulelor de gel ntr-o coloan mpachetat. Valoarea volumului spaiului gol se determin prin msurarea volumului de solvent necesar elurii unui solut care este complet exclus din matricea gelului. Cele mai multe coloane pot fi calibrate n scopul determinrii acestui parametru prin eluia a unui colorant, blue dextran 2000, care are o mas molecular medie de 2000000 daltoni. Volumul de eluie. Acest volum reprezint volumul de tampon de eluie necesar ndeprtrii unui anumit solut, particular, dintr-o coloan mpachetat.