Analiza biocompatibilitatii

celule biomateriale
implantabile
Dr. Elena Iulia Oprita
Laborator de testare a
biocompatibilitatii biomaterialelor
Notiuni introductive
Biomaterial - termen folosit pentru materiale
naturale sau sintetice, folosite in scopul
reproducerii functiei tesuturilor.
- Este un substrat inert din punct de vedere
sistemic si farmacologic destinat sa
interactioneze cu sistemele biologice
pentru a directiona, intensifica sau inlocui
functiile diferitelor tesuturi din organismul
uman.

Biomaterialele pot fi clasificate avand in
vedere urmatoarele criterii:
d.p.d.v al originii lor: naturale,
sintetice si hibride;
d.p.d.v al compozitiei chimice:
metalice, ceramice, polimerice si
compozite;
d.p.d.v al reactiilor de interfata:
biotoxice, bioinerte, bioactive si
bioresorbabile;

Biocompatibilitate - termenul este
folosit pentru a defini capacitatea unui
material de a determina un raspuns
corespunzator al tesutului gazda in
cazul unei aplicatii specifice
- reprezinta capacitatea unui
material care este in contact cu tesutul
viu de a nu cauza efecte toxice si
daunatoare.

Citotoxicitate calitatea unui biomaterial de a fi
toxic pentru celule
Clasificarea biomaterialelor
- necitotoxice
- usor citotoxice
- moderat citotoxice
- sever citotoxice
Teste de citotoxicitate in vitro
- teste pe culturi celulare
Teste de citotoxicitate in vivo
- teste pe animale de laborator: soareci,
sobolani, iepuri

Metoda culturilor celulare
Biocompatibilitatea materialelor poate fi testat
ntr-un mod simplu analiznd dac ele sunt
substrate adecvate pentru creterea culturilor
celulare.
Folosind culturile celulare pentru testarea
biocompatibilitii este posibil realizarea unei
selecii preliminare pentru a elimina materialele
care au efecte directe, duntoare.
O serie de sisteme de culturi celulare sunt folosite
n mod frecvent pentru studierea citotoxicitii in
vitro.
Testarea biocompatibilitatii in vitro
Cultura primar este un izolat proaspt de celule
care este cultivat in vitro.

Culturile de celule primare pot fi obinute din
fragmente de esuturi (os, cartilaj sau piele) sau
din suspensii de celule individuale obinute prin
tratarea esuturilor cu enzime proteolitice
(cartilaj sau tesut adipos).

Liniile celulare continue sunt derivate din culturile
celulare primare care s-au adaptat creterii in
vitro.

Metode de testare a citotoxicitatii in vitro
Teste stabilite si standardizate EN ISO 109935
Evaluarea biologica a dispozitivelor medicale.
Partea 5: Teste pentru citotoxicitatea in vitro

Metoda contactului direct
Metoda contactului indirect (extractului)

Metoda contactului direct
Linii celulare stabilizate
80% confluenta
Proba acopera aproximativ
10% din stratul celular
Se folosesc: materialul de
testat (proba), un martor de
cultura si 2 martori (pozitiv si
negativ)
Se testeaza citotoxicitatea la
24 si 48 ore.

- martorul de cultura cultura de celule
simpla;
- martorul pozitiv orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii
influenteaza in mod negativ viabilitatea si
morfologia celulara;
- martorul negativ - orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii nu are
nici o influenta asupra celulelor

Scala de citotoxicitate (%)
80% - 100% - necitotoxic
50% 80% - usor citotoxic
30% 50% - moderat citotoxic
< 30% - sever citotoxic
Metoda contactului indirect
(extractului)
Obtinerea extractului materialul de
testat mentinut in mediul de cultura
24h, 37C.
Se folosesc dilutii;
Se testeaza citotoxicitatea la 24, 48 si
72 ore.
- Blank mediul de extractie care nu contine
materialul de testat;
- martorul de cultura cultura de celule
simpla;
- martorul pozitiv orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii
influenteaza in mod negativ viabilitatea si
morfologia celulara;
- martorul negativ - orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii nu are
nici o influenta asupra celulelor

Metode de testare a biocompatibilitatii
in vitro
Metode de testare a viabilitatii si proliferarii celulare

Metode de analiza a morfologiei si ultrastructurii celulare

Metode de determinare a sintezei de proteine
Metode calitative
Tehnici de microscopie

Metode cantitative
- Tehnici de dozare a proteinelor
- Reducerea sarurilor de tetrazoliu
- Cuantificarea sintezei de ADN
Metode de testare a viabilitatii si
proliferarii celulare
Coloranti vitali folositi pentru a identifica pe baza
permeabilitatii membranei celulare
celulele vii, lezate sau moarte
Metode de testare a viabilitatii celulare
Colorarea celulelor vii/moarte in functie de colorantul folosit
- Albastru Tripan si Iodura de propidiu sunt coloranti
exclusi de celulele viabile, coloreaza celulele moarte.
- Rosu Neutru si Crystal Violet detecteaza liza
celulara, coloreaza celulele vii care adera la placile de cultura.

Crystal Violet detecteaza liza celulara, coloreaza celulele vii
care adera la placile de cultura. Celulele lizate se desprind
de suprafata placilor de cultura si nu sunt colorate


Eliberarea de catre celule in mediul de cultura a diferitelor
enzime sau mediatori chimici poate fi afectata de
expunerea la diferite biomateriale, ex: enzima lactat
dehidrogenaza (LDH) este un marker pentru toxicitatea
celulara in testarea biocompatibilitatii.
LDH enzima citoplasmatica ce catalizeaza reactia de
conversie a acidului lactic in acid piruvic. Prezenta enzimei
LDH in mediul d ecultura a celuleor este un indicator al
degradarii membranei celulare.
Metoda excluderii cu Albastru Tripan
Hemocitometru

Metode de testare a proliferarii celulare
Principalele metode de analiza a proliferarii celulare:
- reducerea sarurilor de tetrazoliu (metoda MTT)
- absorbtia Rosu neutru
- masurarea sintezei de ADN


Metoda MTT
Spectrofotometria reprezinta o tehnica de determinare a
absorbtiei radiatiilor luminoase cu o anumita lungime de unda, de
catre o anumita substanta prezenta intr-o solutie.
Metoda spectrofotometrica bazata pe reducerea sarii de tetrazoliu
(3-(4,5 dimetilthyazol-2-yl)-2,5-diphenyl tethrazolium bromide)
(MTT) de culoare galbena la cristale de formazan de culoare
albastru-violet sub actiunea enzimelor mitocondriale (NADPH
reductaze) din celulele active metabolic. Cantitatea de formazan
generata este direct proportionala cu numarul de celule viabile.
Metoda este folosita pentru masurarea citotoxicitatii in vitro
induse de un biomaterial.
MTT este adaugat direct in mediul de cultura al celulelor si dupa o
perioada de incubare (3h), mediul este alcool izopropilic pentru
solubilizarea cristalelor de formazan. Probele rezultate sunt citite
la un spectrofotometru, iar rezultatele obtinute vor fi prezentate
sub forma unui grafic.

0
20
40
60
80
100
120
24h 48h
V
i
a
b
i
l
i
t
a
t
e

c
e
l
u
l
a
r
a

(
%
)

Timp (ore)
beta-TCP
0,5 mg
1 mg
5 mg
10 mg
Metode de analiza a morfologiei si
ultrastructurii celulare
Microscopie optica
Microscopie in contrast de faza
Microscopie electronica de transmisie (TEM)
Microscopie electronica de baleiaj (SEM)
Microscopie de fluorescenta
Microscopie confocala
Microscopie optica
Coloratia Hematoxilina - Eozina
Metoda coloraiei cu hematoxilin - eozin folosete succesiv un
colorant nuclear, bazic, hematoxilina i un colorant citoplasmatic,
acid, eozina.
Rezultatele acestei colorrii sunt:
nucleii apar colorai cu albastru violet cu hematoxilin (principalii
constitueni chimici ai nucleului, ADN i ARN, posed radicali
fosfat acizi ce reprezint locuri de ataare pentru colorantul bazic
hematoxilina);
citoplasma se coloreaz n roz cu eozina (cele mai multe proteine
citoplasmatice se comport la pH-ul respectiv ca baze, expunnd
gruprile NH+3, care reprezint locul de ataare pentru
colorantul acid eozina).
Fibroblaste dermale dupa 6 zile Fibroblaste dermale dupa 13 zile
de cultivare in suporturi compozite de cultivare in suporturi compozite
COL/TCP COL/TCP



Metoda contactului direct
Testarea buretelui Colagen/Condroitin sulfat
Martor de cultura Controlul negativ
Control pozitiv Proba
Metoda contactului indirect (extractului)
Microscopie in contrast de faza
Avantajul major ale microscopiei in contrast de faz este
acela c celulele vii pot fi examinate n starea lor natural,
fr ca, n prealabil, s fie omorte, marcate cu colorani i
fixate n prob. Dinamica proceselor biologice aflate n
desfurare poate fi observat i nregistrat n condiii
foarte bune de claritate i contrast.
Osteoblaste umane cultivate 14
zile pe particule macroporoase

Cultura primara osteoblaste de
sobolan dupa 3 zile de cultivare
Microscopie electronica de transmisie
(TEM)
Filopodii celulare (osteoblat) care
realizeaza contacte stranse cu
suportul (burete COL/TCP)
Celul de tip osteoblast
uman (O) cultivat 6 zile
cu Biostite (burete
colagen S)
Microscopie electronica de baleiaj
(SEM)
Imagini SEM ale
osteoblastelor de
sobolan cultivate n
suport calciu-
fosfat/chitosan.
Infiltrarea celulei n
macroporul suportului
calciu-fosfat/chitosan;
Fixarea celular la baza
porului (sgei);
Celul n interiorul porului;
Interacii celul - celul n
interiorul porului (sgei)
Spre deosebire de TEM, SEM furnizeaza imagini tridimensionale ale
suprafetelor probelor cercetate
Microscopia de fluorescenta
In mod natural, componentele celulare manifesta
fluorescenta, insa prea slaba pentru a putea fi observata
corespunzator la microscop.
In general, preparatul este marcat (colorat) specific cu
compusi fluorescenti (florocromi) care prezinta o afinitate
scazuta, nespecifica pentru moleculele biologice, dar ele
pot fi cuplate chimic cu anticorpi purificati specifici pentru
orice macromolecula dorita.
Un complex fluorocrom anticorp cand este adaugat la
culturile celulare se va lega la anticorpii selectati care apoi
lumineaza sub actiunea lungimii de unda excitate.

Testul Live/Dead
Celule stem mezenchimale cultivate in gel de colagen
Se bazeaza pe colorarea simultana a celulelor vii si moarte prin doi
flurocromi: Etidiu si Calceina.
Calceina coloreaza citoplasma celulelor vii in verde, iar ethidiu nucleul
celulelor moarte in rosu.

Analiza viabilitatii osteoblastelor umane cultivate in suport
COL-TCP prin marcare fluorescenta cu DAPI
DAPI - fluorocrom care
coloreaza in albastru
nucleul celulelor vii.
Sinteza markerilor specifici celulari
Celule stem mezenchimale
umane injectate in burete
COL/TCP pozitive pentru
osteocalcin (marker specific
pentru diferentiere osoasa).
Culturi de celule stem
mezenchimale exprima
VCAM-1 (marker
specific pentru celule
stem mezenchimale)

Microscopie confocala
Metoda avansata pentru analiza interactiilor celulare cu biomaterialele

Ofera mai multe avantaje comparativ cu tehnicile histologice si SEM
prin diminuarea timpului de analiza, probele nu necesita o pregatirea
excesiva ca in cazul celor doua

Poate fi folosita pentru a analiza morfologia celulelor si distributia in
interiorul unor suporturi implantabile, a studia adeziunile focale, a
analiza localizarea intracelulara a diferitelor componente celulare si a
citoscheletului.



Citoscheletul este un sistem de filamente
sau de fibre microscopice, ntlnit n
citoplasma celulelor eucariote, care
organizeaz celelalte componente ale
celulei, menine forma celular i este
responsabil cu locomoia celulei i cu
micarea organitelor intracelulare.
Citoscheletul este compus din trei tipuri
principale de filamente: filamente de actin,
microtubuli i filamente intermediare.
Morfologia celulara si
organizarea
citoscheletului
osteoblastelor
dupa 18h de cultivare pe
suprafete de Al (A); Nb
(B); Ti (C); V (D)

Celule vii (culoare verde) si celule moarte (nucleul
rosu) cultivate in suportul compozit COL/TCP
Testarea biocompatibilitatii in vivo

Interfata biomaterial-
mediul biologic/celule
este stratul care
separa doua faze
condensate (de obicei
de dimensiuni
moleculare).

Testarea in vivo a buretilor de COL/TCP
Testarea biocompatibilitatii in vivo
Urmareste:

Reactia inflamatorie
Reactia imuna
Reactia mitogena
Formarea tumorilor
Reactia toxica