2013

Determinarea
substanelor amare din
hamei prin metoda
HPLC
UNIVERSITATEA LUCIAN BLAGA
Introducere
Hameiul se utilizeaz pentru a da gust amar i arom berii. n compozitia
conurilor plantei de hamei feminin sunt substane, n general, descrise ca si -
acizii . Predominanti sunt -acizi (humulon, cohumulone, i adhumulone) sunt
precursori de compui amari care echilibreaza dulceaa din orz transformat n mal.
-acizii corespunztori (lupulone, colupulone, i adlupulone) contribuie n mod
semnificativ mai puin la gustul amar dect -acizi.
Este important pentru producatorii de bere, nu numai pentru a nelege
caracterul de diferite soiuri de hamei (Cascade, Hallertauer, Fuggles, Saaz, etc),
adugai la prepararea de bere, dar, de asemenea, pentru a prezice amrciunea
finala al unui lot de bere. Amrciunea berii depinde n primul rnd de concentraia
de -acizi coninute n hamei, cantitatea de hamei folosit i durata de timp n care
hameiul trebuie fiert. In acest experiment vom folosi cromatografia lichid de
nalt performan (HPLC) pentru determinarea concentraiilor- i -acizi in
probele de hamei. Standardele externe vor fi preparate dintr-un extract utilizat n
mod obinuit n industria de fabricare a berii. Cunoscut ca extract de calibrare
International, sau ICE-3, acesta este de la o tulpina specifica de hamei numit
Hallertau Perle. Un alt standard va fi folosit pentru a masura cantitatea de izo--
acizi, cunoscut ca standard de calibrare International, sau ICS-I3.
Materiale si aparate
Sistemul HPLC
Coloana pentru faza inversa: 4.6 * 150 mm, (3.5 m, 80 ) Agilent Zorbax Extend C-
18 setat la 40C
Faza Mobila: 85% Metanol / 15% ap, se aciduleaz cu 0,1% v / v acid
trifluoracetic (filtrat i degazat)
Debit: 1,4 ml / min.
Detector UV: 326 nm (-acizi) i 270 nm (pentru izo--acizi)
Injectare. Volum: 50 L
Extragerea cu solvent: 85% Metanol / 15% ap, se aciduleaz cu 0,1% v / v acid
trifluoracetic
Solveni EBC 7,7: eter dietilic (grad de solvent), metanol, HCI apos 0,1 M
Altele: 0,45 m filtre de nailon pentru seringi, baloane volumetrice 50 ml (5), balon
volumetric 25 ml, pahare (100 ml, 250 ml), agitator magnetic, filtru din hartie cu
porozitate medie (Whatman nr 4.), Sistem de filtrare n vid.
ATENTIE!!!
Metanolul este inflamabil i toxic! Eterul dietil este extrem de inflamabil!
Utilizai cu pruden atunci cnd distribuiti acesti solveni, nu le expuneti surselor
de aprindere.Orice scurgere se va curata imediat. Deeurile de metanolic HPLC i
surplusul de eter dietil trebuie aruncate n containerul de deeuri non-halogenate
lichid organice. Orice deeuri apoase din extracia trebuie aruncate n containerul de
deseurilor lichide.

Mod de lucru
Se vor folosi una dintre urmtoarele exemplare de hamei comercial:
Northern Brewer, Cehia Saaz, Super Galena, Cascade, sau Tettnang.
Etape:
1. Se zdrobeste hameiul intr-un mojar cu pistil. Se cntrete o prob de 0,25 g de
hamei i se introduce ntr-un balon de 50 ml Erlenmeyer.
2a. Se adaug aproximativ 20 ml de solvent de extracie. Se agit soluia timp de o
or la temperatura camerei utiliznd un agitator magnetic.
2b. Se obine un al doilea eantion cntrit cu precizie din acelasi hamei i se
adaug ntr-un balon Erlenmeyer de 25 ml i se adaug 7,7 EBD solveni: 5 ml de
dietil eter, 1 ml de metanol i 1 ml de 0,1 M HCI. Se agit amestecul timp de o or
la temperatura camerei utiliznd un agitator magnetic.
3. Pentru fiecare din amestecurile de mai sus, se filtreaz sub vid ntregul amestec
cu ajutorul unei plnii Hirsh cu filtre de porozitate medie hrtie (Whatman, No. 4),
i se colecteaz tot filtratul.Se asigura trecerea cantitativa a solidelor i soluiilor
din fiecare balon n plnie, prin cltire cu 2-3 ml de extracie cu solvent.
4. Folosind o pipet de unic folosin din polietilen, se spal solidul de pe hrtia
de filtru cu circa 10 ml de solvent de extracie, n creteri de 2-ml.
5. Se transfer cantitativ filtratul ntr-un balon cotat de 50 ml i se dilueaz pana la
semn folosind solvent de extracie.
6. Folosind un filtru de nailon de 0,45 m pentru sering, adugai ~ 1,5 ml de
soluie filtrat de la etapa precedent direct ntr-un flacon de autoprelevare.
7. Se injecteaz probele filtrate n HPLC n conformitate cu instruciunile furnizate
de instructor de laborator. Se obine cromatograma pentru fiecare prob.

Analiza datelor
Un set de cinci standarde au fost pregtite i folosite pentru calibrarea
aparatului. Au fost obtinute prin diluarea a 50 ml solutie cunoscuta, continand un
amestec ICE-3 standard de - i -acizii i un amestec etalon ICS-I3 de izo--
acizi. Cinci concentraii ale amestecurilor au fost preparate prin adugarea, 0,500
ml, 0,750 ml, 1,50 ml, 3,00 ml si apoi 6,00 ml din soluia cunoscuta intr-un balon
balon cotat de 10,00 ml i diluarea pana la semn, folosind solventul de extracie.
Utilizand informaiile furnizate de standardul ICE-3, se determina
concentraiile de -i -acizi in mg / ml pentru fiecare din standardele de calibrare
(cohumulone, humulon + adhumulone, colupulone, i adlupulone + lupulone).
De asemenea, n acelai fel, se calculeaz concentraia total a izo--acizi pentru
fiecare standarde de calibrare. Greutatea de izo--acizi combinati este prevzut n
informaiile pe standardul ICS-I3.
Se utilizeaza zonele de vrf din datele pentru standardele de calibrare pentru
a crea un tabel care arat retentia maxima, concentratia in timp. Exist patru
vrfuri majore n cromatograma standard care sunt datorate a ase -i -acizi. n
aceste condiii de separare cohumulone elueaz primele, urmat de un vrf format
din co-elutie humulon i adhumulone, apoi colupulone, i n final co-elutie
lupulone i adlupulone. Folosind zonele de vrf din cromatogramele standard se
creaza curbele de calibrare (zona de vrf vs concentraie n mg / ml): cohumulone,
adhumulone + humulon, colupulone, i adlupulone + lupulone.








Din cromatograma probei de hamei se determina concentraiile (sau
concentraiile combinate pentru adhumulone + humulon i adlupulone +
lupulone) n mg / ml de -i -acizii din extractele de hamei cu ajutorul
curbelor de calibrare corespunztoare. Apoi se calculeaz cantitatea in % a -
i -acizii din hamei pentru probele originale. Se insumeaza concentraiile de
-acizi (cohumulone plus adhumulone + humulon) i -acizii (colupulone
plus adlupulone + lupulone), si se raporteaza la totalul concentratiilor de -
acid la totalul de acid (% g / g) pentru probele de hamei .













Bibliografie

1. Travis M. Danenhower, Leyna J. Force, Kenneth J. Petersen,
and Thomas A. Betts*: Journal of Chemical Education, 85(7),
2008, 954-955.
2. Analytica-EBC, by European Brewers Convention, 2005.