Proteinele sunt molecule mari alcatuite din aminoacizi.

Structura si functia unei

anumite proteine sunt determinate de secventa aminoacizilor care la randul ei determina
conformatia tridimensionala.Forma finala este rezultatul legaturilor interne realizate intre
anumiti aminoacizi.Incepand din anul 1982 a fost licentiata producerea a peste 95 de proteine
terapeutice cu ajutorul celulelor bacteriene, fungice sau de mamifere cultivate in conditii
sterile, in instalatii industriale. Pentru ca pe langa personal de inalta calificare necesita
investitii mari in cladiri si echipamente se anticipeaza insa ca in viitorul apropiat capacitatile
de productie nu vor putea tine pasul cu cererea de asemenea produse.Un nou sistem
tehnologic se adauga insa metodelor de producere a medicamentelor devenite traditionale.
Este vorba de producerea unei game foarte variate de proteine terapeutice-anticorpi
componente ale sangelui uman hormoni si regulatori dai cresterii vaccinuri sau enzime dar si
de enzime destinate industriei si agriculturii de catre plante cultivate.
Comparativ cu sistemele traditionale folosirea plantelor pentru producerea
proteinelor recombinate prezinta mai multe avantaje certe: costul de productie mult mai mic;
posibilitatea modularii rapide a productiei, absenta patogenilor care afecteaza omul si nu in
ultimul rand faptul ca plantele pot asambla si impacheta proteine complexe foarte
corect.Succesul comercial al primelor proteine obtinute cu ajutorul plantelor- avidina si
betaglucuronidaza- care au preturi mult mai mici decat proteinele native, demonstreaza
potentialul acestui sistem de a concura pe piete deja stabilite.
Costurile de productie reduse sunt principalul avantaj al producerii proteinelor
recombinate in plante adecvat transformate.Se estimeaza ca proteinele recombinate pot fi
produse in plante transgenice cu costuri care reprezinta doar 2-10% din costurile producerii in
sisteme de fermenatie microbiana si numai 0,1% diin costurile producerii in culturi de celule
de mamifere.Avantajele economice ale acestui sistem de productie sunt evidente mai ales in
cazul proteinelor recombinate sintetizate si acumulate in cantitrati mari. Un bun exemplu in
acest sens este porumbul transgenic in care avidina reprezinta 20% din proteina solubila
totala. Un buschel de asememnea porumb contine tot atata avidina ca si o tona de oua, dar la
un pret cu 95% mai mic.Intr-o cultura de porumb transgenic care acopera suprafata de
4000mp se pot produce 1-5 kg de anticorpi, adica aproape tot atat cat intr-o fabrica de multe
milioane de dolari.
Deocamdata cele mai multe proteine recombinate produse au reprezentat insa
numai 0.1-1.0% din continutul total de proteina solubila al plantelor care le-au sintetizat. Dar
chiar si aceste niveluri sunt suficiente pentru a face din culturile plantelor un sistem de
productie competitiv. In general se apreciaza ca producerea proteinelor recombinate in plante
costa de1000 de ori mai putin decat producerea lor prin practicile traditionale.
Posibilitatea modularii rapide a productiei de proteine recombinate, prin
cresterea sau scaderea suprafetelor pe care se cultiva plantele transgenie cale le sintetizeaza
este un alt avantaj de ordin comercial. In acesta privinta cele mai putin performante sunt
sistemele fermentative si animalelel transgenice.
Costurile de productie a unei proteina recombinate depind in mod semnificativ
si de puritatea ceruta deoarece 85% din totalul cheltuielilor sunt reprezentate de costurile
procesului de purificare. Pentru ca metodele de purifica5re a proteinelor sunt acealeasi
indiferent de sistemul de productie utilizat si costurile procesarii sunt aceleasi atunci cand se
cere un nivel inalt al puritatii. In cazul folosirii plantelor transgenice costurile de productie
pot ramane insa uneori foarte mici din cauza ca uneloe tipuri de poteine pot fi utilizate sub
forma de material neprocesat sau numai partial procesat.D exemplu anticorpii pentru
imunizare pasiva pot fi administrati sub forma de paste aplicate local dupa o minima
purificare.De asemenea enzimele industriale cum sunt glucanaza si fitaza pot fi intoduse in
procesul indutrial pie prin n intermediul unui material vegetal dericvat din planta care le-a
produs fie sintetizate si acumulate chiar de planta care urmeza sa fie procesata. Pentru
proteinele farmaceutice care trebuie purificate pentru a fi utilizate au fost elaborate mai multe
strategii care urmaresc reducerea costurilor de procesare. Deoarece costurile procesarii sunt
invers proportionale cu concentratia produsului in materialul din care trebuie extras devine
cruciala productia de proteina per unitatea de biomasa vegetala. Exprimarea genei pentru
proteina recombinata in semintelle cerealelor este avantajoasa tocmai datorita faptului ca se
acumuleaza cantitati mari de produs intr-un volum reduis ceea ce reduce costurile procesarii.
Pe de alta parte daca extractia coonventionalka din seminte este prea scumpa se poate recurge
la o alta strategie de purificare. De exemplu in plantele oleaginoase proteina recombinata este
produsa intr-o forma fuzionata cu oleoina. Aceasta fosrma este extrasa din ulei printr-un
procedeu de extracie simplu, apoi proteina recombinat este separata de partenerul de fuziune
prin digestie cu o endoproteaza. Proteina recombinata poate fi produsa si in tesuturi
vegetative care o secreta in exudatele lor facand posibila colectarea ei in regim continuu. Un
astfel de sistem a fost elaborat pentru producerea fosfatazei alcalkine umane si a unor
anticorpi recombinati.
Producerea proteinelor farmaceutice in plante este mult mai sigura decat producerea
lor in sisteme cxare presupun folosirea microorganismelor sau a animalelor, fapt absolut
normal deoarece plantele sunt libere de patogenii care afecteaza omul de secvente de ADN
oncogen si de endotoxine. Cailew de biosinteza a proteinelor sunt aceleasi la plante si la
animale. Fata de microorganisme plantele prezinta avantajul capacitatii de a asambla corect
proteinele. De exemplu in plante s-au produc anticorpi funcionali din ser dar si secretori care
au ostructura mult mai complexa. Intre pante si animale exista insa unele diferente in privinta
modificarilor posttranslationale a proteinelor recombinate mai ales a glicolizarii. Din aceasta
cauza pentru a produce structuri glican de tip uman in plante sunt necesare cateva modificari
in calea de glicolizare.De altfel au fost deja aplicate mai mulkte strategii de sinteza a
glicoproteinelor de tip uman in plante
Porumbul est prima planta cultivata folosita pentru producerea proteinelor
recombinate in scop comercial. Principalii factori care au determinat aceasta alegere sunt:
productia mare de biomasa, usurinta transformarii genetice si a manipularii in vitro,
posibilitatea modularii productiei in functie de cerere. Pana cum porumbul transformat in
mod adecvat a fost folosit pentru producerea in scop comercial a a vidinei
betaglucuronidazei, lacazei, tripsinei si aprotininei ca si a unor anticorpi
Cartoful a fost deja folosit pentru priducerea de vacicnuri dar si a glucanazelor a unor
proteine fuzionate cu anticorpi utilizate pentru diagnosticare si a unor proteine din laptele
uman, iar tuberculii unor plante transgenice de cartof au fost utilizatiu in majoritatea testelor
clinice efectuate pana acum. De asemenea cartoful este evaluat si ca posibil sistem de
producere in masa a anticorpilor. Alte plante folosite pentru producerea de proteine
recombinate in scop comercial sunt tomatele, salata si bananele.
Prin modoficare genetica plantele pot fi programate sa produca proteine cu utilizari
dintre cele mai diverse. De la medicamente, vaccinuri si anticorpi pana la enzime industriale,
chimicale pentru cercetare. Primele produse obtinute pe aceasta cale care au fost
comercializate au fost enzima betaglucuronidaza codificata de o gena provenita de la bacteria
Escherichia coli si avidina care se gaseste in oul de gaina. Ambele au fost sintetizate de
culkturi de porumb si se folosesc in culturi de diagnostic. Alte enzime produse in plante
modificate genetic sunt:
-tripsina, folosita mai ales pentru producerea unor medicamente a unor vaccinuri sau
in tratamentul ranilor
-celulaze si xilanaza termostabile folosite in rpocesul de obinere a bioetanolului in
industria textila, in industria hartiei si pentru producerea furajelor
-fitaza care catalizeaza hidroliza fitatului ce nu poate fi digerat de animalele
monogastrice in inositol si fosfat anorganic
Anticorpii sunt glicoproteine complexe care reunosc si se leaga de antigenele tinta cu
mare specificitate. Din aceasta cauza sunt utilizati ata in prevenirea si tratarea cat si
diagnosticarea bolilor. Anticorpii monoclonali sunt folositi pe scara larga pentru imunizarea
pasiva.Odata administrati ei nu activeaza un raspuns imunitar.Mai precis in imunizarea
pasiva nu se administreaza un antigen pentru a obliga organismul sa produca un anticorp
impotriva lui ci se administreaza un anticorp ca agent terapeutic orientat impotriva unui
antigen specific. De exemplu se injecteaza intravenos mai multe doze de Herceptin un
anticorp monoclonal impotrica cancerului de san pentru a spori capacitatea organismului de a
elimina celulele canceroase. In ultimii ani terapia cu anticorpi s-a aplicat pentru tratarea unei
game extrem de largi de boli: diferite tipuri de cancer, boli de inima, boli infectioase,
inflamatii, boli de piele etc
In plante transgenice au fost asamblati anticorpi funtionali numiti planticorpi
directionati impotriva cariilor dentare, artritei reumatoide, holerei, anumitor cancere etc.De
exemplu plante transgenice au sintetizat un anticorp IgA secretat care confera protectie
impotriva bacteriei Streptococcus mutans ce produce carii dentare. Concret acest anticorp
recnoaste antigenul bacterian o molecula de aderare existenta la suprafata celulelor prevenind
colonizarea.Aplicat local pe dinti el opreste recolonizarea S. Mutans timp de 4 luni la fel ca
anticorpul produs in culturi de celule animale.
In functie de proprietatile lor fizice, chimice si imunologice, anticorpii se impart in 5
categorii: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Un anticorp tipic de ser este un tetramer alcatuit din 2
catene identice grele si 2 usoare si indiferent daca este usoara sau grea o catena e formata
dintr-un domeniu constant si un domeniu variabil.
In legarea antigenului sunt implicate numai regiunile variabile ale celor 2 catene. Cele
2 locuri de legare la antigen se afla regiunile aminoterminale ale ambelor tiuri de catene. Prin
asocierea acestor regiuni pot fi produse in mod artificial fragmente monocatenare variabile.
Anticorpii secretati au o structura mai complexa, ei suntdimeri ai cate unui anticorp
tipic din ser care includ alte 2 catene polipeptidice: componenta secretoare si catena de
legare. La amamifere pentru asamblarea acestor tipuri de anticorpi sunt necesare 2 tipuri
celulare. Plantele in care se exprima 4 transgene diferite pot asambla insa acesti anticorpi
intr-o singura celula.
In plante au fost transferate sise exprima gene care determina sinteza unor forme
foarte variate de anticorpi.
Plantele transgenice au sintetizat mai multe tipuri de imunoglobuline de dimensiuni
normale/derivati, construiti artificial de dimeniuni mai mici.
In mai ,ulte cazuri genele care codifica imunoglobulinele au fost mai inai introduse in
linii diferite, apoi prin hibridarea liniilor au fost cumulate. Transferul comcomitent al unor
gene si asamblarea corecta a Ig-urilor au fost reusite prin coinfectia unor plante de tutun cu 2
virusuri, fiecare virus exprimand o singra catena.
Prin fuziunea secventelor de ADN care cidifica regiunile bariabile ale catenelor grea
si usoara au fosr reazlizate gene sintetice, gene ce determina sinteza unei singure catene
polipeptidice. Aceasta poate forma in mod spontan anticorpi recombinati sub forma de dimeri
sau anticorpi care se leaga univalent la antigen.
Anticorpii sunt produsi in semintele de cereale pentru ca in acest fel pot fi pastrati
timp indelungat la temperatura ambientala far o degradare notabila si fara a deveni inactivi.
Cel putin 6 tipuri de planticorpi se afla in faza de testare preclinica/chimica si au sanse reale
sa fie lansati pe piata







Progresele nregistrate n ultimii 10 ani n biologia moleculari n
domeniulimunologiei au permis o mai bunnelegere a numeroase boli i au condus la
dezvoltarea unor strategii noi pentru vaccinare.Una dintre direciilepromitoare n acest sens
este obinerea de plante transgenice n care sse exprime gene pentru diferii antigeni.
Proteineleantigenice derivate de laplantele transgenice eliminsau previn unele boli la
animale, iar ntestele clinice n cazul oamenilor ele s-au dovedit afi sigure i funcionale
(Walmsley i Arntzen, 2000). S-a dovedit cr spunsul imun al unui organismfade un
anumit patogen poate fi indus prin utilizarea unor polipeptide similare celor din structura
epitopilor agenilor etiologici (Vior, 2000).In acest sens au fost elaborate tehnologii
deobinere a vaccinurilor subunitare care au avantajul cel iminutilizarea de virusuri vii
sau de microorganismepatogene active, dar dezavantajul c sunt termosensibile i foarte
scumpe. Producerea unor asemenea vaccinuri n plante elimin unele impedimente curente:
preul de cost ar fi mic, se eliminriscul contaminrii de patogeni animali, se asiguro
stabilitate pentru produsul obinut, iar administrarea se poate face pe cale orali nu prin
injectare. Primele testricliniceale unui vaccin produs de plante au fost rea
lizate n 1998, prin demonstrarea caracterului imunogen al unui antigen bacterian recombinat
produs de plante transgenice de cartof: administrarea vaccinului comestibil a condus la
inducerea unui rspuns imun la nivelul mucoaselor (Tacket i colab., 1998). Metodologia de
transfera genelor de interes n plante se bazeazatt pe sistemele ce utilizeazvectorii de
clonare derivai de la plasmidele Ti de la A.tumefacienscti pefolosirea unor virusuri
vegetale recombinate drept vectori ai genelor. Primele ncercri de aobine vaccinuri produse
de plante dateazdin anul 1990 cnd Curtiss i Cardineau audeterminat exprimarea unei
proteineantigenice de laStreptococcus mutans(proteina SpaA) dupclonarea genei
codificatoare n plante de tutun. Dupincorporarea de esut vegetal transformat n dieta
oarecilor, s-a obinut un rspuns imun la nivelul mucoaselor fade proteina Spa A. Cercetri
ulterioare au permis exprimarea antigenuluide suprafade la virusul hepatitei B n plante
transgenice de tutun i salat, aunei glicoproteine antigenice dela virusul turbrii n plante
transgenice de tomate, a subunitilor toxinei holerice n plante transgenicede tutunsau
cartofsau aglicoproteinei B de la citomegalovirusul uman n plante transgenice i semine de
tutun (Mason i colab., 1992; McGravey i colab., 1995; Arakawa i colab., 1997;
Tackberryi colab., 1999). Cele mai recente studii referitoare la vaccinurile comestibile
produse de plante transgenice in de stabilirea metodelor optime de administrare i dozare, a
tipului de rspuns imun i a duratei sale n cazul patogenilor de tipul Vibrio cholerae,
Pseudomonas aeruginosa, HIV sau virusul hepatitei murine. Deasemenea, sunt examinate
posibilitile de a mbunti exprimarea unor antigeni prin realizarea unorgene sintetice, ca
n cazul subunitii B aenterotoxinei termolabile de la Escherichia coli: prin ndeprtarea din
gena natural a unei secvene de nucleotide care determinprelucrarea ineficientsau
degradarea prematura proteinei heterologe n plant, s-a reuit o cretere de 3-14 ori a
acumulrii antigenului nfrunzele sau tuberculii de cartof transgenic, iar efectul antigenic s-a
dovedit prin hrnirea oarecilor (Mason i colab., 1998). Experimente recente efectuate de
Brennan i colab. (1999) au evideniat posibilitatea folosirii unor proteine antigenice derivate
de la Staphylococcus sureusproduse de plante C. P. Cornea 104transgenice ca vaccinuri oralesau
nazale: prin administrarea la oareci a probelor respective i examinarea ulterioara unor
fluide recoltate de la animalele tratate (de la nivelul bronhiilor sau a intestinului) au fost
detectate imunogloguline de tipul IgA i IgG specifice pentruantigenulfolosit n toate fluidele
testate. In paralel se realizeazteste pe voluntari umani, pentru anumite tipuri de vaccinuri
produse de plante: vaccin antidiareic ce conine o proteinsinteticderivarde la subunitatea B
a toxinei termolabile de E.coli, produs de plante de cartof transgenic; vaccin oral obinut din
cartof care conine antigenul de suprafaalvirusului hepatitei B (HbsAg); vaccin antidiareic
(pentru formele de boalde origine viral) ((Walmsey i Arntzen, 2000).
O a doua strategie interesanteste clonarea n plante a genelor ce codificsinteza
unoranticorpi specifici, pentru obinerea de anticorpi monoclonali vegetali. Producerea
primului tip de anticorp recombinat sintetizat de plante a fost descrisde Hiatt i colab.(1989).
Experimentele realizate la tutun au presupus douetape, urmrind clonarea separat, n plante
diferite, a genelor ce codificlanul greu (catena H), respectiv uor (catena L), ce alctuiesc
anticorpii (de exemplu, IgG1). Plantele transgenice au fost obinute prin utilizarea sistemului
de transformare mediat de Agrobacterium tumefaciens. Cele doutipuri de plante transgenice
regenerate, una exprimnd catena Hiar cealaltcatenL,aufostncruciate ntre ele i s-aexam
inat producerea deanticorpi funcionali (asamblai) de ctre plantele aprutendescenden(
Figura 12).





Figura12.Prezentarea schematica procedeuluide obinere de anticorpi princlonareagenelor codificatoare
ncelulele vegetale(adaptaredupWatsoni colab.1992).


Rezultateleobinute au fost ncurajatoare, n planteletransgenice descendente
detectndu-seprezenaanticorpilorfuncionali, ei reprezentnd aproximativ 1-1,5% din totalul
proteinelor celulare extrase din frunze. Mai mult, s-a dovedit canticorpii funcionali au fost
produi doar atunci cnd moleculele de ADNc ce codificcele doutipuri de catene Modificarea
genetica plantelor: principii generale derealizare; Aplicaii; Controverse 105 ale unui anticorp
conin osecvensemnal derivatde la genele pentru anticorpi de oarece.Acest fapt
sugereazc
echipamentul enzimatic al celulelor vegetale recunoate secvene leader heterologe,
permind exprimarea genelorclonate subcontrolul lor. Dei promitoare,aceste experimente
sunt abia la nceput, fiind necesare studii suplimentare nvederea optimizrii producerii unor
asemenea compui de ctre celulele vegetale, la nivel de bioreactor sau directn cmp, la
unprede cost convenabil (Whitelami colab., 1994)